DPPH抗氧化能力测定

DPPH.法测定绿原酸清除自由基能力2.1 待测液的制备将绿原酸(纯度56%)、维生素C 和没食子酸分别配制成体积分数为0.1mg/mL 的无水乙醇溶液。

2.1.1 绿原酸母液的配制 称取 9.0 mg 绿原酸，定容到50ml ，即可得到绿原酸的母液0.1mg/mL 。

然后，再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。

分别为 mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml 。

2.1.2 Vc 母液的配制 称取 mg VC ，定容到100ml ，即可得到VC 的母液。

然后，再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。

分别为 mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml 。

2.1.3 没食子酸母液的配制 称取 mg 没食子酸，定容到100ml ，即可得到没食子酸的母液。

然后，再将所配制的母液按照要求稀释成不同浓度的溶液。

分别为 mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml; mg/ml 。

2.1.4 DPPH 母液的配制 称取 mg DPPH ，用无水乙醇定容到100ml ，即可得到DPPH 的母液。

然后，再将所配制的母液按照要求稀释成至一定浓度的溶液。

C DPPH = mg/ml 。

（建议用0.025mg/mL ）2.2 DPPH.溶液的可见光谱以无水乙醇为对照，在分光光度计上对DPPH.溶液进行在440～600nm 下扫描。

A max = nm2.3 抗氧化活性测定DPPH.是一种稳定的自由基，它的乙醇溶液呈紫色，在可见光区最大吸收峰为 nm 。

当DPPH.溶液中加入自由基清除剂时，溶液颜色变浅，517nm 处的吸光度变小，而吸光度变小的程度与自由基被清除的程度呈线性关系。

因此，可用来检测自由基的清除情况，从而评价某物质的抗氧化能力，其能力用清除率(Scavenging Rate,SR)来表示，清除率越大，抗氧化能力越强[4.5]。

抗氧化活性测定方法抗氧化活性测定方法在食品、药物、化妆品以及生物学研究中具有重要的应用价值。

抗氧化活性是指物质对自由基的清除能力，其测定方法可以评估物质的抗氧化性能和保护细胞免受氧化损伤的能力。

本文将介绍一些常用的抗氧化活性测定方法。

一、DPPH自由基清除法DPPH自由基清除法是目前应用最广泛的抗氧化活性测定方法之一、该方法基于DPPH自由基的紫色溶液，在受到氧化损伤时会褪色。

通过测定样品对DPPH自由基的清除能力，可以评估其抗氧化活性。

实验步骤：1.准备0.1mM的DPPH溶液。

2.取一定量的样品，加入适量的溶剂溶解。

3.取不同浓度的样品溶液，加入相同量的DPPH溶液。

4.静置反应一定时间后，通过测量溶液的吸光度变化，计算出样品的抗氧化活性。

二、还原能力测定法还原能力测定法是一种常用的抗氧化活性测定方法。

该方法基于物质对氧化剂的还原能力，通过测定还原剂浓度与吸光度之间的关系，评估样品的抗氧化活性。

实验步骤：1.准备一系列不同浓度的还原剂溶液。

2.取一定量的还原剂溶液，加入适量的氧化剂溶液。

3.静置反应一定时间后，通过测量溶液的吸光度变化，计算出还原剂的浓度与吸光度之间的关系。

4.根据吸光度与还原剂浓度的关系，评估样品的抗氧化活性。

三、总抗氧化能力测定法总抗氧化能力测定法是一种综合评估样品抗氧化活性的方法。

该方法基于样品的抗氧化剂含量和抗氧化活性，通过测定样品对氧自由基的清除能力，评估其总抗氧化能力。

实验步骤：1.准备一定浓度的氧自由基溶液。

2.取一定量的样品，加入适量的溶剂溶解。

3.取不同浓度的样品溶液，加入相同量的氧自由基溶液。

4.静置反应一定时间后，通过测量溶液的吸光度变化，计算出样品的抗氧化活性。

以上是常用的抗氧化活性测定方法，还有其他一些方法如ORAC法、TEAC法等也被广泛应用。

不同的方法适用于不同的样品和测定目的，选择适合的方法进行测定可以更准确地评估样品的抗氧化活性。

抗氧化活性实验方法（体外实验）之巴公井开创作1、清除DPPH自由基能力的测定称取一定量的DPPH，用无水乙醇配制成0.04mg/mL的DPPH 溶液。

分别取2mL分歧浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液，加入2mL DPPH溶液，混合均匀，室温放置30min后，5000r/min离心10min。

取上清液于517nm处测吸光值。

用Vc作为阳性对照。

样品对DPPH自由基的清除率用以下公式计算：DPPH()121100%A AA-=-⨯清除率A0—2mL无水乙醇+ 2mL DPPH溶液的吸光值；A1—2mL样品溶液+ 2mL DPPH溶液的吸光值；A2—2mL样品溶液+ 2mL无水乙醇的吸光值。

2、总还原能力的测定在10mL离心管中分别加入0.2mol/L pH 6.6的磷酸缓冲液2.5mL和分歧浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液1mL，加入2.5 mL 1%铁氰化钾，混合均匀后于50℃ FeCl3，混匀后静置10min，在700nm处检测吸光值。

Vc作为阳性对照。

3、对Fe2+离子螯合能力的测定分别取1mL分歧浓度（2，4，6，8mg/mL）的溶液和3.7mL蒸馏水，加入2mmol/L的FeCl2溶液0.1mL和5mmol/L的菲洛嗪溶液0.2mL，25℃水浴10min，于562nm处测吸光值。

EDTA为阳性对照。

样品对Fe2+的螯合率计算公式如下：Fe 2+()1201100%A A A -=-⨯螯合率 A 0—1mL 蒸馏水代替反应体系中样品溶液后的吸光值； A 1—样品溶液反应后的吸光值；A 2FeCl 2溶液后的吸光值。

4、超氧自由基（O 2-）清除率的测定采取邻苯三酚自氧化法测定。

取50mmol/L Tris-HCl 缓冲液（pH8.2）4.5mL ，置25℃水浴中保温20min ，分别加入1mL 样品溶液和0.4mL 25mmol/L 邻苯三酚溶液，混匀后于25℃水浴中反应5min ，加入1mL 8mmol/L HCl 终止反应，于299nm 处测定吸光度（A x ），空白对照组以相同体积蒸馏水代替样品。

3种抗氧化活性测定方法抗氧化活性测定方法是评估化合物或材料抗氧化性能的一种重要手段。

随着抗氧化活性的研究日益深入，目前已经发展出很多种测定方法。

以下将介绍三种常用的抗氧化活性测定方法：DPPH自由基清除法、Fe2+/Fe3+还原能力法和ABTS自由基清除法。

1.DPPH自由基清除法：DPPH（2,2-二苯基-1-苦味肼）是一种紫色的自由基，常用于评估化合物或材料的抗氧化活性。

该方法基于DPPH自由基与抗氧化物质发生反应后，颜色由紫色变为淡黄色或无色。

测定方法简单，操作方便。

其原理是待测样品与DPPH混合后，通过电子或氢的转移反应，DPPH自由基将被清除，溶液颜色由紫色转变为淡黄色。

根据吸光度变化可以计算出自由基清除率，进而评估抗氧化活性。

2.Fe2+/Fe3+还原能力法：该方法基于还原能力测定抗氧化物质对Fe3+离子的还原能力。

常用的试剂是FeCl3溶液和TPTZ（2,4,6-三聚吡啶甲酸）、酸性pH缓冲液。

其原理是待测样品能够还原Fe3+离子为Fe2+离子，Fe2+离子与TPTZ反应生成有颜色的络合物，通过分光光度计测定络合物的吸光度变化，进而计算出还原能力。

较高的吸光度变化表示较高的抗氧化活性。

3.ABTS自由基清除法：ABTS（2,2'-联氨基双(3-乙基苯并噻唑啉-6磺酸)）自由基是一种蓝绿色自由基，其浓度在紫外可见光区域有最大吸收。

该方法基于ABTS自由基清除率来评估抗氧化物质的抗氧化活性。

该方法较DPPH法和还原能力法更为灵敏。

其原理是待测样品与ABTS自由基反应后，ABTS自由基将被清除，溶液颜色由蓝绿色变为无色或浅黄色。

通过测定吸光度的变化，可以计算出自由基清除率，进而评估抗氧化活性。

除了上述常用的抗氧化活性测定方法外，还有很多其它方法也被广泛应用于抗氧化活性的评估，如氧化还原测定法、Fenton反应法、还原剂抑制能力法等。

每一种测定方法都有其独特的原理和适用范围，研究人员可以根据具体的研究目的和样品性质选择合适的测定方法。

3种抗氧化活性测定方法抗氧化活性是指物质对氧化过程的抑制作用，能够减缓或阻断自由基对细胞和组织的损害。

目前，常用的抗氧化活性测定方法主要包括DPPH 自由基清除法、ABTS自由基清除法和铁还原能力测定法。

以下将对这三种方法进行详细介绍。

1.DPPH自由基清除法：DPPH（2,2-二苯基-1-若氧基-苯基-π-苦味噁唑）自由基清除法是一种常用的抗氧化活性测定方法。

该方法是通过测定样品对DPPH自由基的清除能力来评估其抗氧化活性。

DPPH自由基是一种紫色稳定的自由基，在接触到氢供体（抗氧化剂）后，会发生颜色变化从紫色转变为黄色。

可以通过测定样品溶液的吸光度来评估其抗氧化能力。

吸光度的降低表明样品对DPPH自由基的清除能力较强。

2.ABTS自由基清除法：ABTS（2,2'-联氨基双（3-乙基苯并噻唑））自由基清除法也是一种常用的抗氧化活性测定方法。

ABTS自由基是一种无色可溶性自由基，其生成主要通过氧化剂与ABTS反应而产生。

测定方法是将ABTS与过氧化氢反应，生成蓝色自由基溶液，然后将样品加入到溶液中，通过测定吸光度的变化来评估样品的抗氧化活性。

吸光度的降低表明样品对ABTS自由基的清除能力较强。

3.铁还原能力测定法：铁还原能力测定法是一种评估抗氧化活性的常用方法，通过测定样品对Fe3+还原为Fe2+的能力来评估其抗氧化能力。

在这个方法中，还原剂（如抗氧化剂）会与Fe3+反应，生成Fe2+，并且Fe2+的浓度可以通过测量其吸光度来确定。

浓度越高，吸光度越高，表明样品的抗氧化能力越强。

这三种抗氧化活性测定方法各有其优势和适用范围。

DPPH自由基清除法适用于评估样品对自由基的清除能力，但其结果受其他化合物的影响较大；ABTS自由基清除法对于水溶性和脂溶性样品均适用，但其结果也受其他化合物的影响；铁还原能力测定法适用于样品中还原型物质的测定，可评估样品对金属离子的还原能力。

因此，在实际应用中，可以根据需要选择适合的方法来评估样品的抗氧化活性。

一DPPH自由基清除能力仪器及药品：酶标仪、紫外-可见分光光度计、甲醇、DPPH等DPPH 即1，1-二苯基-2-苦肼基自由基，是一种稳定的自由基，其甲醇溶液呈紫色，并在517 nm处有强吸收。

参考Braca et al. (2001)的方法进行测量。

取0.1 ml样品，加入3 ml 0.004％DPPH 甲醇溶液（质量分数）。

（0.02g溶于500ml甲醇溶液。

）混合均匀后，静置30 min后在517 nm处测定吸光值。

抑制率采用公式[(A0－A1)/A0] · 100计算，其中A0（加0.1ml甲醇和3mlDPPH甲醇溶液）为加入样品前的吸光值，A1 为加入样品后的吸光值。

（空白样采用甲醇。

用甲醇溶液调零。

）配置各个级分不同浓度的甲醇溶液，浓度范围可以先做预实验，大致在1mg-1000mg/l 之间：测定吸光值计算DPPH自由基清除率，绘制吸收曲线，找出其IC50二FRAP法测定抗氧化能力药品：醋酸纳、醋酸、三吡啶基均三嗪（2,4,6-Tripyridyl-s-triazine，TPTZ）、盐酸、FeCl3·6H2O、维生素C（L-Ascorbic Acid）（1）300mmol/L的醋酸盐缓冲液（pH=3.6）：3.1g C2H3NaO2·3H2O ＋16mL C2H4O2 溶于1L容量瓶中定容。

（或着是1.869g醋酸钠）（2）10mmol/L三吡啶基均三嗪（2,4,6-Tripyridyl-s-triazine，TPTZ，分子量312.33）溶于40mmol/L HCl中：称取0.312g三吡啶基均三嗪溶于50ml小烧杯中，加入0.34ml浓HCl（约11.7mol/l）搅拌均匀，然后定容到100ml容量瓶中。

（3）20mmol/L FeCl3·6H2O溶液，称取2.703gFeCl3·6H2O溶解于200ml蒸馏水中，然后定容到500ml容量瓶中FRAP试剂：25mL 醋酸盐缓冲液＋ 2.5mL TPTZ溶液＋ 2.5mL FeCl3·6H2O溶液（10:1:1）标准样：0.1-1mmol/L的维生素C（L-Ascorbic Acid）溶液FRAP分析步骤：取0.1 ml 样品放入10ml试管中，加入新鲜的FRAP试剂3.0 ml，然后置于25℃恒温水浴中，5 min后用紫外分光光度计在波长为593 nm处测吸光值，（空白样采用去离子水。

一、抗氧化测定1．DPPH:a)样品溶液浓度初测定，（0~4℃）储藏。

b)称4mg，加无水甲醇溶解于烧杯，转移至100mL容量瓶定容。

浓度为0.04mg/mL。

避光（0~4℃）储藏。

i.5ml离心管（2mlDPPH·溶液+2ml无水甲醇）混合后充分振摇，反映稳定，40min后测定。

以无水甲醇为对照分光检测λ=517nm。

平行测定2次。

A1ii.5ml离心管（2ml待测样+2mL无水甲醇）混合后充分振摇，反映稳定，40min后测定。

以无水甲醇为对照分光检测λ=517nm。

A2iii.5ml离心管（2mlDPPH·溶液+2ml待测样）混合后充分振摇，反映稳定，40min后测定。

以无水甲醇为对照分光检测λ=517nm。

A3清除率（Y）=[1-（A3-A2）/A1]∙100%。

平行测定3次，取平均值。

分别以试样质量浓度和清除率做显形回归方程并计算清除率为50%时，代测样品的浓度值，即半抑制浓度IC50。

自由基清除能力，AE=1/IC50。

根据AE大小判断待测样品清除自由基能力的大小，AE越大清除能力越强。

2．·OHa)PBS制配：磷酸二氢钠31.2g 1000ml蒸馏水定容，磷酸氢二钠71.6g1000ml蒸馏水定容。

移液管移液磷酸二氢钠190ml、磷酸氢二钠810ml 于1000ml 烧杯，pH 计调7.4。

b) 邻二氮菲：148mg 蒸馏水定容100ml 。

c) 硫酸亚铁：208.5mg 蒸馏水定容100ml 。

d) 100ml30%双蒸馏水定容300ml 。

封口。

i. 10ml 离心管（0.5ml 邻二氮菲溶液+1mlPBS 混匀后+0.5ml 硫酸亚铁混匀后+0.5ml 22O H +双蒸馏水定容10ml ）37℃水浴1h 后分光λ=536nm 。

A1ii. 10ml 离心管（0.5ml 邻二氮菲溶液+1mlPBS 混匀后+0.5ml 硫酸亚铁混匀后+双蒸馏水定容10ml ）37℃水浴1h 后分光λ=536nm.A2 iii. 10ml 离心管（0.5ml 邻二氮菲溶液+1mlPBS 混匀后+0.5ml 待测样+0.5ml 硫酸亚铁混匀后+0.5ml 22O H +双蒸馏水定容10ml ）37℃水浴1h 后分光λ=536nm.A3iv. 10ml 离心管（1mlPBS+双蒸馏水定容10ml ）37℃水浴1h 后分光λ=536nm.A 空。

DPPH法测定黄芩黄酮的抗氧化活性抗氧化就是任何以低浓度存在就能有效抑制自由基的氧化反应的物质,其作用机理可以是直接作用在自由基,或是间接消耗掉容易生成自由基的物质，防止发生进一步反应。

目前对自由基清除剂的研究方法主要有类，一类是体外模型，另一类是体内模型,其中DPPH 法是体外模型中最常用的方法。

DPPH又称1，1-二苯基—2-三硝基苯肼，是一种很稳定的氮中心的自由基,他的稳定性主要来自共振稳定作用的3个苯环的空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用。

它的无水乙醇溶液呈紫色,在517nm波长处有最大吸收，吸光度与浓度呈线性关系。

向其中加入自由基清除剂时,可以结合或替代DPPH·，使自由基数量减少，吸光度变小，溶液颜色变浅，借此可评价清除自由基的能力。

即通过在517nm波长处检测样品清除DPPH·的效果，来计算抗氧化能力。

实验研究表明，黄芩黄酮中清除DPPH 自由基活性的主要成分是黄芩苷[1]，黄芩苷中含有羧羟基和酚羟基能与DPPH反应，反应式如下：NN+O2NO2NNO2H+NNHO2NO2NNO2 DPPH 与抗氧化剂反应原理材料：DPPH（1，1-二苯基—2-三硝基苯肼)；无水乙醇；仪器:分光光度计1.DPPH贮备液的制备准确称取DPPH试剂3．5mg,用无水乙醇溶解，并定量转入10mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，取2mL至100ml容量瓶中，摇匀得浓度为0。

0178mmol／L D PP H贮备液，置于冰箱中冷藏备用。

2.试液的制备准确称取5。

2mg干燥的黄酮提取物（32。

75%），用无水乙醇溶解,并定量转入50ml容量瓶中，用无水乙醇定量至刻度，取10ml至100ml容量瓶中，摇匀得浓度为0.0233mmol／L试液.3.DPPH·清除率的测定在10mL比色管中依次加入4.0mLDPPH溶液和黄酮提取液,再加入无水乙醇至刻度，混匀立即用1cm比色皿在517nm波长处测吸光值(A），吸光值记为Ai,再在温室避光保存30min后测吸光值，记为Aj，对照试验为只加DPPH的乙醇溶液，其吸光值记为Ac。

DPPH在抗氧化活性评价中的应用DPPH（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl）是一种广泛用于评价抗氧化活性的自由基。

DPPH自由基是一种稳定的紫色自由基，其吸收峰位于波长517 nm。

其吸光度随着还原剂的加入而减小，可用于测定抗氧化剂的能力。

1.抗氧化剂的选择和筛选：DPPH法是一个简单且经济的方法，可以有效地评价天然产物、食品添加剂、药物、化妆品和其他化合物的抗氧化活性。

通过与DPPH自由基的反应，可以量化评价抗氧化剂的能力，通常以IC50（抑制50%的浓度）作为评价指标。

IC50越小，表明抗氧化剂的抗氧化活性越强，推荐进一步的研究。

2.抗氧化剂的相关性研究：DPPH法可用于评价抗氧化剂与其他营养物质或化学物质之间的相互作用。

通过与DPPH自由基的反应，可以评估不同化合物之间的相互作用，从而了解它们对抗氧化过程的贡献程度。

这有助于揭示一些抗氧化剂的混合物或复杂多组分体系中的相互作用机制。

3.抗氧化剂的稳定性评价：DPPH法可以用来评估不同条件下抗氧化剂的稳定性，如光照、温度和pH值等。

通过检测其吸光度的变化，可以了解抗氧化剂在不同条件下的稳定性，并选择合适的条件来保护抗氧化剂的稳定性。

4.抗氧化剂的动力学研究：DPPH法还可用于研究抗氧化剂与DPPH自由基之间的反应动力学。

通过测定DPPH与抗氧化剂反应的速率常数，可以了解化合物与DPPH自由基的反应速率，并推测其机制和反应类型。

5.新型抗氧化剂的发现：DPPH法可以广泛应用于天然产物的抗氧化活性筛选，有助于发现新型的抗氧化剂。

通过检测化合物与DPPH自由基的反应，可以评估它们的抗氧化能力，并筛选出具有潜力的新型抗氧化剂。

总之，DPPH法是一种简单、快速且有效的方法，已在抗氧化活性评价中得到广泛应用。

它可以用于抗氧化剂的筛选和选择、抗氧化剂与其他物质的相关性研究、抗氧化剂的稳定性评价、抗氧化剂的动力学研究和新型抗氧化剂的发现。