微生物细胞的破碎及破碎率测定1

细胞破碎（cell disruption）定义:细胞破碎就是采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相中，破碎后的细胞浆液经固液分离除去细胞碎片后，再采用不同的分离手段进一步纯化.1细胞壁的组成和结构微生物细胞壁的化学组成和结构细菌，肽聚糖的网状结构酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质真菌：细胞壁更厚植物细胞壁的化学组成和结构初生壁，次生壁具有很高的机械强度2 细胞破碎技术机械法和非机械法2.1机械法机械法主要是利用高压、研磨或超声波等手段在细胞壁上产生的剪切力达到破碎目的.包括高压匀浆法,珠磨法和超声破碎法高压匀浆器影响匀浆破碎的主要因素是压力、温度和通过匀浆器阀的次数。

高压匀浆法的适用范围较广，在微生物细胞和植物细胞的大规模处理中常采用.高速珠磨机(high spced bead mill) 研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝等研磨剂一起快速搅拌，使细胞获得破碎。

在工业规模的破碎中常采用高速珠磨机超声波破碎器超声波处理细胞悬浮液时，破碎作用受许多因素的影响，通常声强和振幅影响很大，但强度太高易使蛋白质变性，频率的变化影响不明显：此外介质的离子强度、pH值、菌体的种类和浓度也有很大的影响.超声波振荡过程中遇到的最大问题就是产生的热量不容易驱散，所以影响了它在大规模工业上的应用，但在实验室和小规模生产中是一种很好的方法2.2 非机械法非机械方法很多，包括酶解、渗透压冲击、冻结和融化、干燥法和化学法溶胞等.1)酶解法是利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破碎目的。

酶解法可以在细胞悬浮液中加入特定的酶，也可以采用自溶作用。

酶解法的优点是发生酶解的条件温和、能选择性地释放产物、胞内核酸等泄出量少、细胞外形较完整、便于后步分离等；但酶水解价格高，故小规模应用较广.渗透压冲击法冻融法干燥法化学法:采用化学法处理可以溶解细胞或抽提胞内组分。

下游加工过程：对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的，动植物细胞组织培养的，酶反应等各种生物工业产生过程获得的生物原料，经提取分离，加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术。

下游加工的一般步骤：1预处理和固液分离（目的：改变发酵液的性质，便于固液分离及提取）2提取（目的：除去与产物性质差异较大的杂质，为后道精制工序创造有利条件）3精制（目的：除去与产物的物理化学性质比较相近的杂质）4成品制作清洁生产：是指将综合预防的环境保护策略持续应用于生产过程和产品中，以减少对人类和环境的风险。

下游技术中的物理过程；1平衡分离过程，这种操作是建立在相平衡关系上的。

例如蒸发，蒸馏，干燥结晶等2拟平衡分离过程，在混合体系外加上一个能引起物质分离的势能场。

例如离心分离，电泳等3非平衡分离操作，利用物质移动速度差和广义的，基于屏蔽效应的分离操作。

例如超滤，反渗透膜等下游技术化学过程一化学性分子识别：1分子间相互作用2分子识别二化学反应。

例如柠檬酸工业中常用石灰乳与柠檬酸反应生成溶解度很低的柠檬酸该盐沉淀。

亲和色谱，手臂也就是连接担体和配体的隔离基，以便配体再结合蛋白质时不引起立体障碍。

如何改变发酵液特性：一降低液体粘度：降低粘度可以提高过滤速率，方法有加水稀释和加热等二调pH 三凝聚与絮凝凝聚：指在电解质的作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象。

凝聚值越小，即凝聚能力越大絮凝：指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。

四加入助滤剂五加入反应剂杂蛋白质的除去:沉淀法，变性法，吸附法过滤装置：1板框式过滤机2真空转鼓过滤机：四区：卸渣区，再生区，过滤区，洗涤吸干区。

细胞破碎率：1直接测定法即计数破碎前后细胞数。

2目的产物测定法即测定目的产物的释放量3导电率测点法分子萃取：相似相容原理：1分子结构相似2能量相似，在生物工业中，的对后一点考虑的主要是分子极性，介电常数越大，极性越大超临界流体：就是状态超过气液共存时的最高压力和最高温度下物质特有的点———临界点后的流体。

一、酵母和大肠杆菌细胞的破碎及破碎率的测定一、实验原理1.超声波破碎细胞的实验原理频率超过15～20kHz的超声波，在较高输入功率下（100～250W），通过超声波发生器和换能器的作用, 将电能转换为声能，震动波通过浸入在样品中的钛合金变速杆对破碎的各类细胞产生空化效应，从而起到破碎细胞等物质的作用。

2.采用紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验原理蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质溶液在270～280nm具有一个紫外吸收高峰。

在一定范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，服从朗伯比尔定律。

由于不同蛋白质中酪氨酸和色氨酸的含量及所处的微环境不同，故蛋白质溶液在280nm的吸光度值不同。

3.血球计算板使用原理计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格，而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格，而每个大方格又分成16个小方格。

但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。

a.16格×25格的血球计数板计算公式:细胞数/ml=100小格内细胞个数/100×400×10000×稀释倍数b. 25格×16格的血球计数板计算公式:细胞数/ml=80小格内细胞个数/80×400×10000×稀释倍数二、实验流程图1.啤酒酵母的破碎啤酒酵母培养（菌种纯化、扩大培养）→破碎前计数（采用紫外分光光度计定性检测蛋白）→细胞超声破碎（80 ml酵母细胞悬浮液置于100 ml容测OD280器中，浸没超声发射针1 cm ；频率中档超声4 s，间歇6 s，80-120次；0.5 ml 悬液稀释1000倍，电子显微镜观察、计数；另取1.5 ml酵母破碎液12000 r/min定性检测蛋白的释放情况；留4 ℃离心10 min取上清，紫外分光光度计测OD280取50ul上清加入2×SDS上清缓冲液，煮沸5 min，-20 ℃保存，待下次实验用。

试验一酵母细胞的破碎及破碎率的测定:一、实验目的_大蒜试验一酵母细胞的破碎及破碎率的测定一、实验目的1.掌握超声波破碎细胞的原理和操作;2.学习细胞破碎率的评价方法.二、实验原理频率超过15~20kHz的超声波,在较高的输入功率下可破碎细胞.本实验采用JY95-2D超生波细胞粉碎机,其工作原理是:JY92-2D超声波细胞粉碎机由超声波发生器和换能器两部分组成.超声波发生器是将220V、50Hz的单相电通过变频器件变为20~25Hz、约600V 的交变电能,并以适当的阻抗与功率匹配来推动换能器工作,做纵向机械振动,震动波通过浸入在样品中的钛合金变速杆对破碎的各类细胞产生空化效应,从而达到破碎细胞的目的.三、实验器材超声波细胞破碎机,电子显微镜,酒精灯,载玻片,血细胞计数板,接种针.四、试剂和材料酵母细胞悬浮液0.2g/mL的啤酒酵母溶于50mmol/L乙酸钠-乙酸缓冲溶液.马铃薯培养基①马铃薯200g;②琼脂20g;③蔗糖20g;④蒸馏水1000mL;⑤pH为6.5.选优质马铃薯去皮切块,加水煮沸30min,然后用纱布过滤,再加糖及琼脂,融化后补充加水至1000mL,分装,115℃灭菌20min.五、操作步骤啤酒酵母的培养①菌种纯化. 将酵母菌种转接至斜面培养基上,28~30℃,培养3~4d,培养成熟后,用接种环取一环酵母菌至8mL液体培养基中,28~30℃,培养24h.②扩大培养. 将培养成熟的8mL液体培养基中的酵母菌全部转接至80mL液体培养基的锥形瓶中,28~30℃,培养15~20h.破碎前计数取1mL酵母细胞悬浮液经适当稀释后,用血细胞计数板在显微镜下计数.细胞超声波破碎①将80mL酵母细胞悬浮液放入100mL容器中,液体浸没超声发射针1cm.②打开开关,将频率设置中档,超声破碎1min,间歇1min,破碎20次.③取1mL破碎后的细胞悬浮液经适当稀释后,滴一滴在血细胞计数板上,盖上盖玻片,用电子显微镜进行观察,计数.计算细胞破碎率.④破碎后的细胞悬浮液,于12000r/min、4℃离心30min,去除细胞碎片.用Lowry法检测上清液蛋白质含量.六、结果与讨论1、用显微镜观察细胞破碎前后的形态变化.2、用两种方法对细胞破碎率进行评价:一种是直接计数法,对破碎后的样品进行适当的稀释后,通过在血球计数板上用显微镜观察来实现细胞的计数,从而计算出破碎率;另一种是间接计数法,将破碎后的细胞悬浮液离心分离掉固体,然后用Lowry法测量上清液中的蛋白质含量,也可以评估细胞的破碎程度.试验二细胞核与线粒体的分级分离一、实验目的1.了解离心分离的原理;2.掌握差速离心法分离细胞器的方法及操作.二、实验原理细胞内不同的结构,密度和大小都不相同,在同一离心场内的沉降速度也不相同,根据这一原理,常用不同转速的离心法,将细胞内各种组分分级分离出来.分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆,在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离,其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步,这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段.匀浆低温条件下,将组织放在匀浆器中,加入等渗匀浆介质进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆.分级分离由低速到高速离心逐渐沉降.先用低速使较大的颗粒沉淀,再用较高的转速,将浮在上清液中的颗粒沉淀下来,从而使各种细胞结构,如细胞核、线粒体等得以分离.由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中,所以每级离心得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒,须经反复悬浮和离心加以纯化.分析分级分离得到的组分,可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定.三、实验器材普通离心机,高速离心机,匀浆器,平皿,载玻片,显微镜.四、试剂和材料小白鼠,0.9%NaCl溶液,0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙,1%甲苯胺蓝,0.02%詹纳斯绿B染液.五、操作步骤细胞核的分离提取操作步骤1.用颈椎脱位的方法处死小白鼠后,迅速剖开腹部取出肝脏,剪成小块尽快置于盛有0.9%NaCl的烧杯中,反复洗涤,尽量除去血污,用滤纸吸去表面的液体.2.将湿重约1g的肝组织放在小平皿中,用量筒量取8ml预冷的0.25mol/L蔗糖一0.003mol/L氯化钙溶液,先加少量该溶液于平皿中,尽量剪碎肝组织后,再全部加入.3.剪碎的肝组织倒入匀浆管中,使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中,左手持之,右手将匀浆捣杆垂直插入管中,上下转动研磨3~5次,用3层纱布过滤匀浆液于离心管中,然后制备一张涂片I,做好标记,自然干燥.4.将装有滤液的离心管配平后,放入普通离心机,以2500r/min离心15min;缓缓取上清液,移入高速离心管中,保存于有冰块的烧杯中,待分离线粒体用;同时涂一张上清液片Ⅱ做好标记,自然干燥;余下的沉淀物进行下一步骤.5.用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol/L氯化钙溶液悬浮沉淀物,以2500r/min离心15min,弃上清,将残留液体用吸管吹打成悬液,滴一滴于干净的载玻片上,涂片Ⅲ,自然干燥.6.将I、Ⅱ、Ⅲ涂片用l%甲苯胺蓝染色后盖片即可观察.7.分别于高倍镜下观察三张图片,描述镜下所见.高速离心分离提取线粒体操作步骤1.将装有上清液的高速离心管,从装有冰块的烧杯中取出,配平后,以17000r/min离心20min,弃上清,留取沉淀物.2.加入0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙液lmL,用吸管吹打成悬液,以17000r/min离心20min,将上清吸入另一试管中,留取沉淀物,加入0.1mL 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液混匀成悬液.3.取上清液和沉淀物悬液,分别滴一滴于干净载玻片上,各滴一滴0.02%詹纳斯绿B染液盖上盖片染20min.4.油镜下观察,发现颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染液染成蓝绿色.六、结果与讨论1、画出说分离的细胞核和线粒体的形态,并说明其结构特点.2、解释差速离心的分离原理.试验三胰凝乳蛋白酶的制备一、实验目的1.掌握盐析法分离酶的基本原理和操作;2.掌握结晶的基本方法和操作;3.学习胰凝乳蛋白酶制备的方法.二、实验原理蛋白质分子表面带有一定的电荷,因同种电荷相互排斥,使蛋白质分子彼此分离;同时,蛋白质分子表面分布着各种亲水基团,这些基团与水分子相互作用形成水化膜,增加蛋白质水溶液的稳定性.如果在蛋白质溶液中加入大量中性盐,蛋白质分子表面的电荷被大量中和,水化膜被破坏,于是蛋白质分子相互聚集而沉淀析出,这种现象称为盐析.由于不同的蛋白质分子表面所带的电荷多少不同,分布情况也不一样,因此不同的蛋白质盐析所需的盐浓度也各异.盐析法就是通过控制盐的浓度,使蛋白质混合液中的各个成分分步析出,达到粗分离蛋白质的目的.三、实验器材高速组织捣碎机,解剖刀,镊子,剪刀,烧杯,离心机,离心管,漏斗,纱布,棉线,吸管,玻璃棒,滴管,透析袋,台秤,分析天平,离心机.四、试剂和材料新鲜猪胰脏,0.125mol/LH2SO4溶液,固体2SO4,1%酪蛋白溶液,磷酸盐缓冲液,0.1mol/LNaOH溶液,1%BaCl2.五、操作步骤整个操作过程在0~5℃条件下进行.提取取新鲜猪胰脏,放在盛有冰冷0.125mol/LH2SO4的容器中,保存在冰箱中待用.去除胰脏表面的脂肪和结缔组织后称重.用组织捣碎机绞碎,然后涽悬于2倍体积的冰冷0.125mol/LH2SO4溶液中,放冰箱内过夜.将上述混悬液离心10min,上层液经2层纱布过滤至烧杯中,将沉淀再混悬于等体积的冰冷的0.125mol/LH2SO4溶液中,再离心,将两次上层液合并,即为提取液.分离取提取液10mL,加固体2SO41.14g达0.2饱和度,放置10min,离心10min.弃去沉淀,保留上清液.在上清液中加入固体2SO41.323g达0.5饱和度,放置10min 离心10min.弃去上清液,保留沉淀.将沉淀溶解于3倍体积的水中,装入透析袋中,用pH为7.4的0.1mol/L磷酸盐缓冲液透析,直至1%BaCl2检查无白色BaSO4沉淀产生,然后离心5min.弃去沉淀,保留上清液.在上清液中加2SO4达0.6饱和度,放置10min,离心10min.弃去上清液,保留沉淀.结晶取分离所得的胰凝乳蛋白酶容于3倍体积的水中.然后加2SO4至胰凝乳蛋白酶溶液达0.25饱和度,用0.1mol/LNaOH调节至pH6.0,在室温放置12h即可出现结晶.六、结果与讨论1、在显微镜下观察胰凝乳蛋白酶的结晶形状.2、计算胰凝乳蛋白酶的得率.3、分析影响胰凝乳蛋白酶得率的因素.试验四牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制备一、实验目的1.掌握盐析法和等电点沉淀法的原理和基本操作.二、实验原理乳蛋白素广泛存在于乳品中,是乳糖合成所需要的重要蛋白质.牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白,酪蛋白在pH4.8左右会沉淀析出.而乳蛋白素在pH3左右才会沉淀.利用这一性质,可先将pH降至 4.8,或是在加热至40℃的牛奶中加硫酸钠,将酪蛋白沉淀出来.酪蛋白不溶于乙醇,这个性质被利用从酪蛋白粗制剂中出去脂类杂质.将去除掉酪蛋白的滤液的pH调至3左右,能使乳蛋白素沉淀析出,部分杂质可随澄清液除去.再经过一次pH沉淀后,即可得到粗乳蛋白素.三、实验器材烧杯,玻璃试管,离心管,磁力搅拌器,pH计,离心机. 四、试剂和材料脱脂或低脂奶粉,无水硫酸钠,0.1mol/LHCl,0.1mol/LNaOH,0.05mol/L碳酸氢铵,滤纸,pH试纸,浓盐酸,0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液,乙醇.五、操作步骤盐析法或等电点沉淀法制备酪蛋白1.将50mL牛乳倒入250mL烧杯中,于40℃水浴中加热并搅拌.2.在搅拌下缓慢加入10g无水硫酸钠,之后再继续搅拌10min.3.将溶液用细布过滤,分别收集沉淀和滤液.将上述沉淀悬浮于30mL乙醇中,倾于布式漏斗中,过滤出去乙醇溶液,抽干.将沉淀从布式漏斗中已出,在表面皿上摊开以除去乙醇,干燥后得到酪蛋白.准确秤量.等电点沉淀法制备酪蛋白素1.将操作步骤所得的滤液置于100mL烧杯中,一边搅拌,一边利用pH计以浓盐酸调整pH至3.0±0.1.2.6000r/min离心15min,倒掉上清液.3.在离心管内加入10mL去离子水,震荡,使馆内下层物重心悬浮,用0.1mol/LNaOH溶液调整pH至8.5~9.0,此时大部分蛋白质均会溶解.4.6000r/min离心10min,将上清液倒入50mL烧杯中.5.将烧杯置于磁力搅拌器上,一边搅拌,一边利用pH 计用0.1mol/LHCl调整pH至3.0±0.1.6.6000r/min离心10min,倒掉上清液.沉淀取出干燥,并秤量.六、结果与讨论1、计算出每100mL牛乳所制备出的酪蛋白数量,并与理论产量相比较.求出实际得率.2、计算出每100mL牛乳所制备出的乳蛋白素的数量.3、讨论影响得率的因素.试验五大蒜细胞SOD酶的提取和分离一、实验目的1.掌握有机溶剂沉淀法的原理和基本操作.2.掌握SOD酶提取分离的一般步骤.二、实验原理超氧化物歧化酶是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶.它可催化超氧负离子进行岐化反应,生成氧和过氧化氢.大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD,通过组织和细胞破碎后,可用pH7.8的磷酸缓冲液提取出来.由于SOD不溶于丙酮,可用丙酮将其沉淀析出.有机溶剂沉淀的原理是有机溶剂能降低水溶液的介电常数,使蛋白质分子之间的静电引力增大.同时,有机溶剂的亲水性比溶质分子的亲水性强,它会抢夺本来与亲水溶质结合的自由水,破坏其表面的水化膜,导致溶质分子之间的相互作用增大而发生聚集,从而沉淀析出.三、实验器材研钵,石英砂,烧杯,玻璃棒,pH计,冷冻离心机,离心管.四、试剂和材料新鲜蒜瓣,0.05mol/L磷酸缓冲溶液,氯仿-乙醇混合液,丙酮.五、操作步骤整个操作过程在0~5℃条件下进行.1.SOD酶的提取称取5g大蒜蒜瓣,加入石英砂研磨破碎细胞后,加入0.05mol/L的磷酸缓冲液15mL,继续研磨20min,使SOD酶充分溶解到缓冲液中,然后6000r/min冷冻离心15min,弃沉淀,取上清液.2.去除杂蛋白上清液中加入0.25倍体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min,6000r/min离心15min,弃去沉淀,得到的上清液即为粗酶液.3.SOD酶的沉淀分离粗酶液中加入等体积的冷丙酮,搅拌15min,6000r/min离心15min,得到SOD酶沉淀.冷冻干燥后即得成品.对成品进行称量并测定酶活力.六、结果与讨论1、计算出每500g大蒜蒜瓣所制备出的SOD酶的量.2、讨论有机溶剂沉淀法与盐析法相比的优缺点.试验六凝胶色谱法分离蛋白质一、实验目的1.掌握凝胶色谱基本原理.2.熟悉凝胶色谱法的操作.3.了解物资在色谱柱中洗脱行为与分配系数哦的关系.二、实验原理本实验将蓝葡聚糖200、细胞色素c和DNFP-甘氨酸的混合物通过交联葡聚糖凝胶G-50的色谱柱以蒸馏水为洗脱溶剂进行洗脱.蓝葡聚糖2000分子量最大,全部被排阻在凝胶颗粒的间隙中,而未进入凝胶颗粒内部,因而洗脱速度最快,最先流出柱,其V e=V o即Kd=0.DNFP-甘氨酸分子量最小不被排阻而可完全进入凝胶颗粒内部,洗脱速度最慢,最后流出柱,其V e=Vi+V o即Kd=1.细胞色素c分子量在上述二者之间,其洗脱速度居中.可以直接从蓝、红、黄三种不同颜色直接观察到三种物质分离的情况,并通过洗脱体积可以计算Vi、V o和各自的Kd.三、实验器材玻璃色谱柱1cm*25cm,蠕动泵,收集器.四、试验试剂交联葡聚糖凝胶G-50,蓝葡聚糖2000:配成2mg/mL 溶液,细胞色素c:配成2mg/mL溶液.DNFP-甘氨酸:称取甘氨酸0.15g溶于10%NaHCO31.5mL中,此液pH应在8.5~9.0左右,另取二硝基氟苯0.15g,溶于微热的95%乙醇3mL中,待其充分溶解后,立即倒入甘氨酸液管中.将此管置于沸水浴煮沸5min,待冷却后加2倍体积的95%乙醇,可见黄色DNFP-甘氨酸沉淀,离心2000r/min,1.5min弃去上清液,沉淀用95%乙醇洗两次,所得沉淀用蒸馏水1mL溶解即为DNFP-甘氨酸液,备用.五、操作步骤1.凝胶的准备称取交联葡聚糖G-50约4g,置于烧杯中,加蒸馏水适量平衡几次,倾去上浮的系小颗粒,于沸水浴中煮沸1h,取出,倾去商城业中的细颗粒,待冷却至室温后进行装柱.2.样品制备取配置好的蓝葡聚糖2000、细胞色素c 和DNFP-甘氨酸各0.3mL,混合即可.3.装柱将洗净的色谱柱保持垂直位置,关闭出口,柱内留下约2.0mL洗脱液.一次性将凝胶从塑料接口加入色谱柱内,打开柱底部出口,接通蠕动泵,调节流速0.3mL/min.凝胶随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降到色谱柱底部,最后使凝胶床沉降达20cm高,操作过程中注意不能让凝胶床表面露出液体,以防色谱床内出现”纹路”.在凝胶表面可盖一圆形滤纸,以免加入液体时冲起凝胶.4.加样用滴管吸去凝胶床面上的溶液,使洗脱液恰好流到床表面,关闭出口,小心把样品沿壁加于柱内成一薄层.切勿搅动床表面,打开出口使样品溶液渗入凝胶内并开始收集流出液,计量体积.5.洗脱并收集样品流完后,分三次加入少量洗脱液洗下柱壁上样品,最后接通蠕动泵,调节流速为0.3mL/min,用部分收集器收集,每管1mL.仔细观察样品在色谱柱内的分离现象.用肉眼观察并以-、+符合记录三种物质洗脱液的颜色及深浅程度.6.绘制洗脱曲线以洗脱体积为横坐标,洗脱液的颜色度,在坐标纸上作图,即得洗脱曲线.六、结果与讨论1、分析洗脱曲线,讨论组分分离情况和试验注意点. 试验七离子交换色谱分离氨基酸一、实验目的1.熟悉离子交换色谱技术的基本原理和方法.2.熟悉离子交换色谱分离氨基酸的基本原理和操作.二、实验原理氨基酸是两性电解质,有一定的等电点,在溶液pH小于其pI时带正电,大于其pI时带负电.故在一定的pH 条件小,各种氨基酸的带电情况不同,与离子交换剂上的交换基团的亲和力亦不同.因而得到分离.本实验选用Dowex50做为离子交换剂,它是含磺酸基团的强酸型阳离子交换剂,分离的样品为Asp、Gly、His三种氨基酸的混合液,这三种氨基酸分别属于酸性氨基酸、中性氨基酸和碱性氨基酸,它们在pH4.2的缓冲液中分别带负电荷和不同量的正电荷,与Dowex50的磺酸基团之间的亲和力不同,因此被洗脱下来的顺序亦不同,可以将三种不同的氨基酸分离开来,将各收集管分别用茚三酮显色鉴定.三、实验器材分光光度计,色谱柱,试管.四、试验试剂1)0.1mol/LNaOH.2)氨基酸混合液Asp、Gly、His各10mg溶于30mL0.06mol/LpH4.2柠檬酸钠缓冲液中.3)0.06mol/LpH4.2柠檬酸钠缓冲液取柠檬酸三钠98.0g溶于蒸馏水中,再加入42mL浓盐酸和6mL80%苯酚,最终加蒸馏水至5000mL,用pH计调溶液pH至4.2.4)茚三酮显色液称取85mg茚三酮和15mg还原茚三酮,用10mL乙二醇溶解.5)Dowex50的处理Dowex50用蒸馏水充分浸泡后,用6mol/LHCl浸泡煮沸1h,然后用蒸馏水洗去HCl至树脂呈中性,换15%NaOH浸泡1h,用蒸馏水洗去NaOH 至树脂呈中性,最后用pH4.2柠檬酸钠缓冲液浸泡备用.五、操作步骤1)装柱前准备用流水冲洗色谱柱,然后用蒸馏水冲洗,柱流水口装上橡皮管放入2~3mL蒸馏水,按压橡皮管内气泡,抬高流出管防止蒸馏水排空.2)装柱将处理好的Dowex50悬液小心倒入色谱柱内,待Dowex50自然下沉至柱下部时,打开下端放出液体,再慢慢加入悬液至Dowex50沉积面离色谱柱上缘约3cm时停止.装柱时注意防止液面低于交换树脂平面以及气泡的产生.3)平衡用pH4.2的柠檬酸钠缓冲液反复加在柱床上面,平衡10min,最后接通蠕动泵,调节流速1mL/min. 4)加样柱内缓冲液的液面与树脂平面相平,但勿使树脂露出液面,马上用乳头滴管滴加7滴样品在树脂平面上, 然后加少量缓冲液使样品进入柱内,反复两次,当样品完全进入树脂床后,接通蠕动泵,用pH4.2的柠檬酸钠缓冲液洗脱,部分收集器收集.5)收集与检测取12支试管编号,每管加入茚三酮显色液20滴,依次收集洗脱液每管2mL,混匀,置沸水浴15min取出,观色,用自来水冷却后在波长570nm处比色,当收集至第二洗脱峰出现时,即换用0.1mol/LNaOH 溶液洗脱直至第三洗脱峰出现后,停止洗脱.6)树脂的再生用0.1mol/LNaOH溶液洗脱色谱柱10min.7)回收树脂拔去橡皮接收管用洗耳球对着玻璃柱流出口将树脂吹入装树脂的小瓶内加入0.1mol/LNaOH浸泡.8)洗脱曲线的绘制以吸光度为纵坐标,洗脱体积为横坐标绘制曲线.六、结果与讨论1、分析洗脱曲线,讨论组分分离情况和试验注意事项. 试验八青霉素的萃取与萃取率的计算一、实验目的1.学会利用溶剂萃取的方法对目的产物进行提纯.2.掌握利用碘量法测定青霉素的含量,并计算出青霉素的萃取率.二、实验原理萃取过程是利用混合物质在两个不相混溶的液相中各种组分的溶解度的不同,从而达到分离的目的.pH为2.3时,青霉素在乙酸乙酯中比在水中溶解度大,因而可以将乙酸乙酯加到青霉素混合液中,并使其充分接触,从而使青霉素被萃取浓集到乙酸乙酯中,达到分离提存的目的.三、实验器材分液漏斗,小烧杯,电子天平,酸式滴定管,移液管,容量瓶,量筒,玻璃棒,pH试纸.四、试剂及药品1)Na2S2O3 取Na2S2O3约 2.6g与无水Na2CO30.02g,加新煮沸过的冷蒸馏水适量溶解,定容到100mL.2)碘溶液取碘1.3g,加KI3.6g与水5mL使之溶解,再加HCl1~2滴,定容到100mL.3)HAc-NaAc缓冲液取83g无水NaAc溶于水,加入60mL冰醋酸,定容到1L.4)NaOH液、HCl液、淀粉指示剂、乙酸乙酯、稀H2SO4、蒸馏水.5)Dowex50的处理Dowex50用蒸馏水充分浸泡后,用6mol/LHCl浸泡煮沸1h,然后用蒸馏水洗去HCl至树脂呈中性,换15%NaOH浸泡1h,用蒸馏水洗去NaOH 至树脂呈中性,最后用pH4.2柠檬酸钠缓冲液浸泡备用.五、操作步骤Na2S2O3的标定取K2Cr2O30.15g于碘量瓶中,加入50mL水,使之溶解,再加KI2g,溶解后加入稀H2SO440mL,摇匀,密闭,在暗处放置10min,取出后再加水250mL稀释,用Na2S2O3滴定临近终点时,加淀粉指示剂3mL,继续滴定至蓝色消失,记录Na2S2O3消耗的体积.青霉素的萃取1)用电子天平称取0.12g青霉素钠,溶解后定容到100mL.2)取15mL乙酸乙酯液,用稀H2SO4调节pH在2.3~2.4之间,准确移取10mL青霉素钠溶液与乙酸乙酯溶液融合,置于分液漏斗中,摇匀,静置30min.3)溶液分层后,讲下层萃余相置于烧杯中备用,将上层萃取液回收.萃取率的计算1)取5mL定容好的青霉素钠溶液于碘量瓶中,加NaOH溶液1mL,放置20min,再加1mLHCl溶液与5mLHAc-NaAc缓冲液,精密加入碘滴定液5mL,摇匀,密闭,在20~25℃暗处放置20min,用Na2S2O3滴定液滴定,临近终点时加淀粉指示剂3mL,继续滴定至蓝色消失,记录Na2S2O3消耗的体积.2)另取5mL定容好的青霉素钠溶液于碘量瓶中,加入5mLHAc-NaAc缓冲液,再精密加入碘滴定液5mL,用滴定液滴定至蓝色消失,记录Na2S2O3消耗的体积.3)取萃余项5mL于碘量瓶中,按步骤1)的方法进行测定,记录Na2S2O3消耗的体积.六、结果与讨论1、数据处理1)根据Na2S2O3-I2 2:1,分别计算操作步骤——萃取率计算中各步滴定的碘的量I①、I②、I③.2)萃取前与青霉素反应的碘:总I2= I②- I①;萃取后与青霉素反应的碘:余I2= I②- I③;3)根据青霉素-I2 1:8计算:萃取前青霉素含量和萃取后青霉素含量.4)计算:萃取率=/萃取前青霉素含量2、讨论pH的调节在提高青霉素萃取效率方面的重要性.试验九蛋白质的透析一、实验目的1.学会透析的基本原理和操作;二、实验原理蛋白质是大分子物质,它不能透过透析膜,而小分子物质可以自由透过.在分离提纯蛋白质的过程中,常利用透析的方法使蛋白质与其中夹杂的小分子物质分开.三、实验器材透析管或玻璃纸,烧杯,玻璃棒,电磁搅拌器,试管及试管.四、试剂及药品蛋白质的氯化钠溶液,10%硝酸溶液,1%硝酸银溶液,10%氢氧化钠溶液,1%硫酸铜溶液.五、操作步骤用蛋白质溶液做双缩脲反应.透析袋的的预处理.将一适当大小和长度的透析管放在50%乙醇中煮沸1h,再用10g/LNa2CO3和1mmol/LEDTA洗涤,最后用蒸馏水洗涤2~3次,结扎管的一端.向火棉胶制成的透析管中装入10~15mL蛋白质溶液并放在盛有蒸馏水的烧杯中.约1h后,至烧杯中取出水1~2mL水,加10%硝酸溶液数滴使成酸性,再加入1%硝酸银溶液1~2滴,检查氯离子的存在.从烧杯中另取出水1~2mL水,做双缩脲反应,检查是否有蛋白质存在.不断更换烧杯中的蒸馏水以加速透析过程.数小时后从烧杯中的水中不能再检出氯离子时,停止透析并检查透析袋内容物是否有蛋白质或氯离子存在.六、结果与讨论1从氯离子和双缩脲反应检查结果,评价透析效果. 试验十蛋白质的真空浓缩一、实验目的1.了解各种物质的浓缩原理,熟练掌握浓缩的一般过程、常用的浓缩技术的操作方法.2.通过实验操作学会使用真空旋转蒸发仪,掌握真空浓缩的原理及方法.分析试验现象,并能运用文字表达技术报告.二、实验原理蒸发浓缩是生产中使用最广泛的浓缩方法,采用浓缩设备把物料加热,使物料的易挥发部分水分在其沸点温度时不断地由液态变为气态,并将汽化时所产生的二次蒸汽不断排除,从而使制品的浓度不断提高,直至达到浓度要求.真空浓缩设备是利用真空蒸发机或机械分离等方法达到物料浓缩.目前,为了提高浓缩产品的质量,广泛采用真空浓缩.即一般在8~18kPa低压状态下,以蒸汽间接加热方式,对料液加热,使其在低温下沸腾蒸发,这样物料温度低,且加热所用蒸汽与沸腾液料的温差增大,在相同传热条件下,比常压蒸发时的蒸发速率高,可减少液料营养的损失,并可利用低压蒸汽作蒸发热源.一般低热敏性高的物质,都采用此方法来进行浓缩.真空蒸发浓缩是浓缩蛋白质的一种较好的方法,它即使蛋白质不易变性,有保持蛋白质中固有的成分.三、实验设备真空旋转蒸发仪是应用真空负压条件下,恒温加热、薄膜蒸发的原理研制而成.本仪器采用进口高档变频器控制,无级调速使玻璃旋转瓶恒速旋转,物料在瓶壁形成大面积均匀薄膜,再由可控恒温水浴锅对旋转瓶均匀加热,在系统抽真空条件下高速蒸发,溶剂蒸汽经高效玻璃双冷凝器冷却,回收于收集瓶.本仪器另设有加料接口及放料机构,便于蒸发过程中自动、连续工作. 由于本仪器是在真空条件下工作,且与物料接触部分全部采用耐高温高硼硅玻璃和聚四氟乙烯材料,所以本仪器特别适用于对热敏感性物料及对不锈钢等金属材料有污蚀的物料的浓缩、结晶、分离以及溶剂回收.本仪器接触面积大、蒸发效率高、使用方便、噪声低、。

试验一酵母细胞的破碎及破碎率的测定一、实验目的1.掌握超声波破碎细胞的原理和操作；2.学习细胞破碎率的评价方法。

二、实验原理频率超过15～20kHz的超声波，在较高的输入功率下（100～250W）可破碎细胞。

本实验采用JY95-2D超生波细胞粉碎机，其工作原理是：JY92-2D超声波细胞粉碎机由超声波发生器和换能器两部分组成。

超声波发生器（电源）是将2 20V、50Hz的单相电通过变频器件变为20～25Hz、约600V的交变电能，并以适当的阻抗与功率匹配来推动换能器工作，做纵向机械振动，震动波通过浸入在样品中的钛合金变速杆对破碎的各类细胞产生空化效应，从而达到破碎细胞的目的。

三、实验器材超声波细胞破碎机，电子显微镜，酒精灯，载玻片，血细胞计数板，接种针。

四、试剂和材料（1）酵母细胞悬浮液 0.2g/mL的啤酒酵母溶于50mmol/L乙酸钠-乙酸缓冲溶液（pH为4.7）。

（2）马铃薯培养基①马铃薯（去皮切块）200g；②琼脂20g；③蔗糖20g；④蒸馏水1000mL；⑤pH为6.5。

选优质马铃薯去皮切块，加水煮沸30min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，融化后补充加水至1000mL，分装，115℃灭菌20min。

五、操作步骤（1）啤酒酵母的培养①菌种纯化。

将酵母菌种转接至斜面培养基上，28～30℃，培养3～4d，培养成熟后，用接种环取一环酵母菌至8mL液体培养基中，28～30℃，培养24h。

②扩大培养。

将培养成熟的8mL液体培养基中的酵母菌全部转接至80mL液体培养基的锥形瓶中，28～30℃，培养15～20h。

（2）破碎前计数取1mL酵母细胞悬浮液经适当稀释后，用血细胞计数板在显微镜下计数。

（3）细胞超声波破碎①将80mL酵母细胞悬浮液放入100mL容器中，液体浸没超声发射针1cm。

②打开开关，将频率设置中档，超声破碎1min，间歇1min，破碎20次。

③取1mL破碎后的细胞悬浮液经适当稀释后，滴一滴在血细胞计数板上，盖上盖玻片，用电子显微镜进行观察，计数。