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无菌、微生物限度检查与方法验证

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微生物限度和无菌检查法验证

微生物限度和无菌检查法验证

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方法验证的步骤与内容 1、制备验证试验用菌液 按药典无菌检查法中培养基灵敏度检查项中试验用 菌液的制备方法将规定需用的试验菌分别制成每毫 升中含10～100个菌（CFU）的供试菌液。 2、样品的前处理方法 样品的前处理方法是验证试验的一部分，需证明所 用的处理方法对各试验菌的生长无影响。 根据供试品的性状，选用以下适宜的方法，或几种 方法联合使用： 溶解：验证所用溶液、助溶剂和水浴助溶温度对微 生物的生长无影响。
7
乳化：验证所用乳化剂和水浴助溶温度的有效性、 使用量及对微生物的生长无影响。 破乳：验证所用破乳剂的有效性、使用量及对微生 物的生长无影响。 萃取：验证有机相选择的合理性、有效性及对微生 物的生长无影响。 稀释：验证降低供试品相对抑菌浓度的有效稀释倍 数。 离心：验证所用转速、时间和微生物的分布情况。 应说明采取某种前处理方法的原因，如样品不需要 特别的前处理就能制成均匀的供试液，这一步可以 省掉，直接进入确定样品有无抑菌性的步骤。
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选择适当的方法消除或有效降低供试品的抑菌性 根据供试品的特性选择药典规定的消除其抑菌性的 方法（一种或几种方法联合），或根据药物的化学 特性，寻找出其他合理、有效的方法，特别是有效 的中和剂；并通过模拟试验（验证试验）对消除或 降低抑菌性的效果进行检验。 无菌检查可采用：①薄膜过滤法；②中和法（目前 药典仅收载β-内酰胺酶处理法）。 ①薄膜过滤法适用于液体供试品和可溶于水的固体 供试品（只要许可，应首先采用）。验证的重点是 确定滤膜的适用性、确定冲洗的方法和冲洗液的用 量。
4
方法验证中应注意的问题与评价要求 1、验证试验的完整性 验证试验的完整性与方法的科学性密切相关，验 证工作不完整，就不能全面体现供试品和试验过 程对微生物的影响情况，则很可能影响或干扰对 最终试验结果的判断。故应按照中国药典2005年 版的要求进行方法验证。特别是对某些具有抑菌 性的供试品，需采取适当的方法消除或有效降低 供试品的抑菌性。在对供试品进行特殊处理时， 既要考察供试品的抑菌性，还要考察在供试液制 备过程中微生物受影响的程度（稀释剂对照组） 。

无菌检查微生物限度检查方法学验证实例

无菌检查微生物限度检查方法学验证实例

供试液制备：取样品10瓶分别加0.1%蛋
白胨溶液30 ml溶解后，过滤。
7.活菌计数
活菌计数结果见表1。
10－4稀释
10－5稀释
10－7稀释
试验次数
1
2
1
21Βιβλιοθήκη 2金黄色葡萄球菌56
60
枯草芽孢杆菌
77
79
白色念珠菌
86
70
黑曲霉菌
80
76
铜绿假单胞菌
47
50
方法验证
直接接种法：取样品12支，分别接种8支硫乙醇酸盐和4支霉菌液体培养基2ml/支后，再按要求加入相应的阳性菌液（30-100个/ml），置规定温度培养3-5天，逐日观察结果。
仪器和滤器：HTY-2000A集菌仪，全封闭无菌试验过滤培养器（批号20050105）北京牛牛基因有限公司。
01
方法：中国药典2005年版无菌检查的验证实验
02
操作方法 菌液制备： 取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中, 生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中, 32.5±2.5℃培养18～24小时；
培养：硫乙醇酸盐流体培养基桶30-35℃培养；真菌培养基桶23-28℃培养。观察结果。
结果 细菌和真菌数计数结果分别见表1和表2。
表1 细菌数计数 表2 真菌数计数结果
*
菌 种
大肠埃希菌
金黄色葡萄球菌
枯草芽孢杆菌
铜绿假单胞菌
生孢梭菌
计数(CFU)
22
26
36
39
62
66
58
54
45、 23
128、108

微生物限度检查方法的验证

微生物限度检查方法的验证
(1)接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养 物至 10ml营养肉汤中，35～37℃培养 18～24 小时，取此培养液 1ml加 0.9％无菌氯化钠溶液 9ml，采用 10 倍递增稀释法，稀释至 10-5～10-7， 使菌数约为 50～100cfu/ml。
(2)接种白色念珠菌的新鲜培养物至 10ml改良马丁培养基中，23～ 28℃培养 18～24 小时，取此培养液 1ml加 0.9％无菌氯化钠溶液 9ml， 采用 10 倍递增稀释法，稀释至 10-5～10-7，使菌数约为 50～100cfu/ml。
表 2 稀释剂对照组回收率测定结果
阳性菌
大肠 埃希菌
实验次数 1 2 3
菌液组菌落数
稀释剂对照组菌落数 回收率％
1
枯草芽
2
孢杆菌
3
1
金黄色
葡萄球
2
菌
3
1
白色
2
念珠菌
3
1
黑曲
2
霉菌
3
注：
稀释剂对照组平均菌落数
回收率 ＝
× 100％
菌液组平均菌落数
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微生物限度检查方法的验证
ygfyzy 整理
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微生物限度检查方法的验证
ygfyzy 整理
11.2 供试液需用特殊制备方法（如加中和剂或乳化剂等) 11.2.1 常规法 菌液组：1ml 菌液 /平皿，每株菌平行 2 个平皿（计算平均菌数：C) 供试品对照组：最低稀释级供试液 1ml /平皿，平行 2 个平皿（计算供 试液平均菌数：B） 试验组：最低稀释级供试液 1ml+ 1ml 菌液/平皿，平行 2 个平皿（计算 供试液平均菌数：A） 稀释剂对照组：稀释剂+加中和剂或乳化剂 + 1ml 菌液，平行 2 个平皿 （计算供试液平均菌数：D） 试验组回收率=(A－B)÷C×100% 稀释剂对照组回收率=D÷C×100% 11.2.2 培养基稀释法（5 个平皿） 菌液组：1ml 菌液/平皿，每株菌平行 2 个平皿（计算平均菌数：C) 供试品对照组：最低稀释级供试液 1ml 分别注 5 个平皿，0.2ml /平皿， 平行 2 份，共 10 个平皿（计算 0.2ml 供试液平均菌数：B） 试验组：最低稀释级供试液 0.2ml+ +加中和剂或乳化剂 1ml 菌液/平皿， 平行 2 个平皿（计算平均菌数：A) 试验组回收率=(A－B)÷C×100% 稀释剂对照组：稀释剂+加中和剂或乳化剂+ 1ml 菌液，平行 2 个平皿（稀 释剂对照组与试验组同法操作）（计算平均菌数：D) 稀释剂对照组回收率=D÷C×100% 11.2.3 供试液需用特殊制备方法（离心沉淀法） 菌液组：1ml 菌液 /平皿，每株菌平行 2 个平皿（计算平均菌数：C) 供试品对照组：最低稀释级供试液 10ml +离心，500rpm 离心取上清，

药品微生物检验及方法验证

药品微生物检验及方法验证

药品微生物检验及方法验证药品微生物限度检查及方法验证从事药品微生物限度检查工作两年时间，从学做到承担工作到变得有点经验，经历了一个摸索、学习和积累的过程，回过头来做一个总结，把一些零散的经验和体会做一个梳理和归整，以供在此岗位工作的同仁参考。

第一部分：外围工作外围工作主要有器皿清洗、灭菌，培养基、试剂配制及灭菌，无菌室清洁消毒等。

器皿的清洗是每个实验室和每一个实验员必须要做的最起码的工作，工作要求简单，操作方便，把握一个原则：干净。

培养基、试剂配制后一般都要求调PH到7.20，因为高温灭菌之后PH值会下降0.2左右。

固体培养基在灭菌前要先加热煮沸，使琼脂均匀分散。

煮沸时要注意不要溢出容器，以免发生烫伤。

万一不小心溢出，可用一湿抹布盖住容器口，迅速将其从加热源上移开，不要在情急之下徒手去拿或者在容器侧面拿，那样容易被从容器口源源不断溢出的培养基烫伤。

液体物品灭菌后，不能立即打开放气阀放气，因为此时被灭菌物品的温度大于100℃，在压力等于常压时，液体会暴沸，造成液体喷出或容器炸裂，发生事故。

万级洁净度的无菌室应当每周进行一次消毒，消毒剂每月更换一次，防止长期使用同一种消毒剂而使微生物形成耐药性。

消毒范围包括墙壁，地面，天花板以及空气。

表面消毒可以用消毒剂擦拭，尤其注意门框边缘以及出风回风口，不能留有死角；空气消毒宜采用臭氧或者紫外灯。

可以使用专门的臭氧发生器产生臭氧进行消毒，也可以在每一个操作间包括净化台安装适宜功率的紫外灯，一方面紫外线可以对近距离的物体表面进行消毒，另一方面紫外线的作用也可以使空气中的氧气转换成臭氧，从而能够杀死空气中的微生物。

另外在每次做完实验之后，都应当对实验台面以及地面进行消毒处理。

第二部分：检验过程整个无菌室的检验操作过程应当有一个标准的操作规范，严格按照无菌操作的规定进行操作，包括进入无菌室的程序以及人员清洁消毒，都应当遵守标准来进行。

首先，进入无菌室应当严格按照洁净区（室）有关规定进行。

微生物限度检查方法及其验证报告(修改)

微生物限度检查方法及其验证报告(修改)

文档来源为:从网络收集整理.word 版本可编辑.欢迎下载支持.文件编号：73021微生物限度检查方法及其验证报告目录样品相关信息 基本信息主要仪器设备和试验耗材信息 主要使用的仪器设备 试验用培养基 试验用试剂 试验用菌种 试验环境 无菌室 洁净工作台 生物安全柜 试验方案 验证试验目的微生物限度检查方法草案 方法验证试验菌液制备计数培养基适用性检查控制菌检查用培养基使用性检查 供试液制备 方法验证菌落计数方法验证试验 控制菌检查方法的验证方法验证结论供试品微生物限度检查结果 样品相关信息 基本信息（三批）1 1.12 2.1 2.2 2.3 2.4 3 3.1 3.2 3.3 4 4.1 4.25 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.5.15.5.2 5.6 6 1 1.12主要仪器设备和试验耗材信息2.1主要使用的仪器设备2.2试验用培养基2.2.1对照培养基2.2.2试验用培养基2.3试验用试剂2.4试验用菌种3试验环境《中国药典》2015版规定，微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。

本公司微生物限度室、阳性对照室、生物安全柜及超净工作台洁净度检测无特殊情况下每季度进行一次。

3.1无菌室无菌室按《医药工业洁净厂房设计规范》GB50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对10000级洁净度要求。

3.2超净工作台超净工作台按《医药工业洁净厂房设计规范》GB50457-2008监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。

超净工作台沉降菌检测记录3.3生物安全柜生物安全柜按《生物安全实验室建筑技术规范》GB50346-2011监测，静态洁净度检测结果符合GB50457-2008对100级洁净度要求。

生物安全柜沉降菌监测记录4试验方案按《中国药典》2015年版第四部：（通则1105）非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、（通则1106）非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法、（通则1107）非无菌药品微生物限度标准及（通则1121）抑菌效力检查法规定，本品微生物限度标准为：1g供试品中，需氧菌总数不得过lOOOcfu,霉菌和酵母菌总数不得过lOOcfu，大肠埃希菌不得检出。

微生物限度和无菌检查方法验证中存在的问题

微生物限度和无菌检查方法验证中存在的问题

86 I FOOD INDUSTRY I理论THEORY微生物限度和无菌检查方法验证中存在的问题文 郭焕君河北省清河县食品药品检验检测中心的检查上，要根据药品的成分和特点进行分类检查，如对于无抑菌成分和作用的品种，就可按照常规方法进行验证；而对于有抑菌成分和效果的药品，则要根据其菌株特点进行分类验证。

三、方法验证资料尚未实现资源共享方法验证资料是反映药厂对药品的检测质量以及微生物控制效率的总结性文件。

但在实际的检验和审核工作中，由于方法验证资料的上交和共享中牵扯到了大量的人力、物力以及资金的投入，导致许多检验机构在实际的资料审核过程中，为了降低成本，减少工作任务，而忽视了方法验证资料共享的重要性。

并且，还有一部分药厂为了隐瞒自身的药品质量问题，故意拖延方法验证资料时间，从而导致药品的质检工作存在一定程度的纰漏，药品的微生物限度和无菌检查工作不符合规定。

为此，药品监督管理部门必须重视强化方法验证监督管理，严格要求药厂提供准确、可靠的方法验证数据，实现方法验证数据的实时共享，有效保障药品的安全性。

总结总而言之，药品的无菌检查和微生物限度检查是检验药品安全性和质量的重要工作。

为了能够确保药厂产品的安全性和质量，促使我国医疗事业实现可持续性发展，必须重视方法验证工作的实效性，及时反思与改正，以确保药品微生物限度和无菌检查方法验证工作有序展开。

由于目前的药品类型各不相同，其中有许多药品本身就带有一定的杀菌和抑菌作用，这就导致了在实际的微生物限度和无菌检查时会出现假阴性的检测结果，从而严重影响药品检测的真实性。

因此，为了能够更好地完善我国药品的微生物控制工作，除了要针对药品的特点进行差异化检测外，还应加强检测人员专业素养、优化方法验证形式。

一、检测人员专业能力有待加强在药品的微生物限度和无菌检查工作中，参与检测的工作人员是影响药品检测真实性的决定性因素。

由于这是一项程序较为复杂和烦琐的工作，相关工作人员不但要有一定的微生物专业基础知识，同时还要具备一定的操作技能。

中国药典无菌、微生物限度与细菌内毒素检查方法学验证内容详解

中国药典无菌、微生物限度与细菌内毒素检查方法学验证内容详解

国家药典委员会
中国药品生物制品检定所
二00五年十月十一日
● 验证的目的: 验证所采用的方法和条件是否适合 于供试品的无菌检查。 即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌 活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不计。 ● 验证的意义：保证检验结果的准确、可靠及检 验方法的完整性。
二、无菌检查验证的关键点
中检所和药典会多次召开会议肯定工作的成绩、 研讨存在的问题，希望各级领导能给予高度重 视，从各方面支持这项工作长期持续发展。 实际工作中，药品生产、研发企业和各级药检 所在工作中都存在很多困难和问题。
关于执行《中国药典》2005年版微生物限度 检查法和无菌检查法有关问题的说明
国药典发[2005]98号
验证的目的是为了确认试验中供试品应选择药 典中所收载的何种供试液制备方法、何种测定
方法及确定的检测系统是否适用于该供 试品的检验，即只有通过方法验证，才 能确定供试品的检验条件和方法，保证 “微生物限度检查”或“无菌检查”方法的 科学性和检验结果的准确性。
2．不同企业生产的相同品种，特别是中 成药，因原料来源、工艺、辅料的不同， 药品可能表现出不同的抑菌特性；同一个 企业生产的相同品种，因原料来源不同、 工艺改变或不同实验室等原因，也可能导 致检测结果的差异。因此，不同企业生产 的相同品种进行“微生物限度检查”或“无菌 检查”时，其具体试验方法如冲洗量等不 能简单照搬，需通过验证试验核实该试验 方法和检测系统是否适宜。
生孢梭菌 (Clostridium sporogenes) [CMCC(B) 64 941]
白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC(F) 98 001]
黑曲霉 (Asperglllus niger) [CMCC(F) 98 003]

无菌、微生物限度检查做法精炼

无菌、微生物限度检查做法精炼

微生物限度检测：（1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法）一般有三种方法：平皿法、薄膜法、MPN法。

样品计数方法的验证：1 培养基适用性的检查TSA :培养的是需氧菌总数，包括真菌。

需要用的金黄色葡萄球菌，（革兰氏阳性菌）铜绿假单胞菌，（革兰氏阴性菌）枯草芽孢杆菌，（细菌中芽孢的代表）白色念珠菌，（酵母菌的代表）黑曲霉。

（霉菌的代表）SDA 霉菌和酵母的总数白色念珠菌，(酵母的代表)黑曲霉。

（霉菌的代表）怎么做呢？在TSA 验证时，每一株菌有4个平皿，试验组2个，对照组2个。

对照组用的是中检院的TSA对照组培养基。

每个皿中接不大于100CFU/ml 的菌。

然后：1摇匀 2 凝固 3 倒置（细菌是单细胞的生物正置会有水滴下来，菌落会蔓延）细菌培养 30-35度培养3d 需要做5种菌（金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌，黑曲霉）真菌培养20-25度培养5d （培养的温度是由培养基的种类决定的，培养的时间是由微生物的种类决定的。

需要做2种菌。

结果：结论被检培养基上菌落的平均数与对照培养基上菌落的平均数的比值在0.5-2范围内合格。

2计数方法的适用性(有抑菌性，导致微生物数减少)微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。

Ppc 原理A组供试液（试验组）（供试液加菌液100CFU）2种方法：供试液+（每ml不超过100CFU的菌）平皿法+（每张膜中加入100CFU的菌）薄膜法B 组供试液组对照组供试液（以稀释液代替菌液组操作）C组菌液组菌液每ml 不超过100CFU的菌取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作加入试验菌进行微生物的回收。

(A-B)/C的比值在0.5-2之间。

日常检测检验量：一次试验所用的供试品量（g、ml或cm2）一般为10g或10ml (随机抽取不少于2个最新包装，从两个包装中取)回收率；（修正系数）（用于医疗器械上的微生物的测量，或者是固体需要做的，因为洗脱不完全）第一种：薄膜过滤法（微生物较多的情况，产品直接洗脱法）无菌一、培养基适用性检查 (无菌性和灵敏度)目的:确认培养基的有效性。

2010年版《中国药典》附录 无菌检查和微生物限度检查方法增修定内容

2010年版《中国药典》附录 无菌检查和微生物限度检查方法增修定内容
2010年版药典附录无菌检查和微生物
限度检查方法增修定内容
杜平华
起草的指导思想
一、以科学发展观为统领，服务于资源节约型社会、 环境友好型社会的要求；落实科学监管理念，着 力解决发展中的问题。 二、与时俱进，广泛吸纳先进技术与成果；坚持自 主与创新；积极推进药品标准化战略，提高我国 药品标准总体水平，着力提升《中国药典》在国 际社会中的地位和作用，提高综合竞争力，促进 医药产业的健康发展，为构建社会主义和谐社会 作出贡献。
⑶新增贴剂供试液制备
供试液的制备 ⑴经验证方法制备成供试液在无菌环境进行。 ⑵避免粘贴面粘合在一起。 ⑶置于含有表面活性剂（如聚山梨酯80或卵磷 脂）的稀释剂中，制成供试液。 ⑷充分振摇。 ⑸也可采用以其他适宜的方法制备成供试液。
⑷具抑菌活性的供试品增修订内容
删除应消除供试液的抑菌活性修改为当供试品 具有抑菌活性时，应尽量选择操作简便、快速的 方法，应避免损伤供试品中污染的微生物。在供 试品溶液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过 滤法。
一、抑菌剂效力检查法指导原则
⒈指导原则的目的 ⑴是为测定灭菌、非灭菌制剂中抑菌剂的活性，以评 价最终产品的抑菌效力及生产企业在制剂研发阶段抑 菌剂的确定提供指导。 ⑵为防止药品由于微生物污染而引起变质，对服用者 造成不良反应，在药品生产过程中加入一定剂量的抑 菌剂。 ⑶抑菌剂不能用于替代药品生产的GMP管理，不能作 为非灭菌制剂降低微生物污染的唯一途径，也不能作 为控制多剂量包装制剂灭菌前的生物负载的手段。
3、检验量增修订内容
⑴中药膜剂检验量50 cm2 修改为100cm2 。 ⑵沙门菌检验量修改为检验量为20 g或20ml并 注明（其中10 g用于阳性对照）。
4、供试液的制备增修订内容 ⑴供试品检查时使用表面活性剂应证明其对 微生其他经 验证的方法，但应均匀加热，且温度不应超 过45℃。

微生物限度检查办法验证方法

微生物限度检查办法验证方法

微生物限度检查方法验证方案1.目的：为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。

?验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准2.范围：本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。

3.规范性引用文件：?根据《中国药典》2010年版二部附录Ⅺ?J?微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。

4.验证实施：4.4.1?试验前的准备:?4.4.1.1?试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30?min，在3天内使用。

?4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15?min，在3周内使用。

?4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15?min，在3周内使用。

无菌检验室、微生物限度检验室、阳性对照室验证方案

无菌检验室、微生物限度检验室、阳性对照室验证方案

无菌检验室微生物限度检验室阳性对照检验室黑曲霉对照检验室验证方案沈阳上善医疗器械有限公司2011年月目录１.验证的目的２.验证小组成员３.验证小组分工４.验证依据５.标准内容６.检验室的自净器和超净台安装确认7.自净器和超净台的运行确认8.洁净度的测定9.验证结果及评价：10.责任1．验证的目的1.1检查并确认检验室的自净器和超净台的安装符合设计要求。

1.2检测并确认检验室的自净器和超净台的运行性能应能达到检验要求及验证标准。

1.3洁净度测试,确认检验室能达到规定的洁净度。

3验证小组分工：3.1组长：负责审核验证方案是否可行。

3.2副组长：负责组织实施验证、审核测试结果、评价及结论，负责验证报告的会签与批准。

3.3组员：负责无菌检验室、微生物检验室、阳性对照检验室、黑曲霉对照检验室的验证过程；提供监测结果。

3.4组员：负责无菌室正常管理。

4.验证依据：GB—T16294—1996 医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法YY0033-2000 无菌医疗器具生产管理规范5．验证标准6．检验室的自净器和超净台安装确认6.1部件安装确认6.2高效过滤器的检漏测试采用尘埃粒子计数器对高效过滤器进行检漏测试，采样头离过滤器距离约2cm，沿过滤器出风侧及内边框来回扫描。

检漏测试结果记录在自净器和超净台运行确认记录上。

7．自净器和超净台的运行确认7.1风速测定采用风速仪贴近高效过滤器出风口测定，一般测定4个点，求出平均风速。

超净台测定8个点，求平均风速。

7.2压差测定采用微压表测定7.3温度、相对湿度测定采用温湿度记录仪测定7.4结果记录如下：无菌检验室结果分析及评价:8．洁净度的测定8.1尘埃粒子数测定采用尘埃粒子计数器,每个检验操作室测试3次,每个检验操作室采样点2个,超净台采样点4个,采样点的高度离地面1m。

求平均值。

尘埃粒子数测定在自净器和超净台运行30分钟后进行。

尘埃粒子数测试记录( )平均值0.5μm 个, 5μm1 个平均值0.5μm 个, 5μm 个测试人: 日期:结果分析及评价:8.2沉降菌测定医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法》有关要求采用φ90mm培养皿，将培养皿按要求放置后，打开平皿盖，使培养基表面暴露30分钟后，将平皿盖盖上，然后在30—35℃下培养48小时后计数。

微生物限度检查方法验证方案

微生物限度检查方法验证方案

微生物限度检查方法验证方案目录1. 目的 (3)2. 适用范围 (3)3. 参考标准 (3)4. 接受标准 (3)5. 人员职责 (3)6. 抽样计划 (4)7. 设备、试剂和菌种信息 (4)8. 方法适用性试验 (5)9. 文件控制 (6)10. 不合格情况处理 (6)11. 再验证周期 (6)12. 附件清单 (6)1.目的根据中国药典2020版微生物限度检查法的要求，对产品的微生物限度检查法进行验证，以确定所采用的方法适合于本产品的微生物限度检查，即确认本品在该检查量及该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性已被充分消除到可以忽略不计。

保证检验结果的准确、可靠及检验方法的完整性。

2.适用范围适用于本司产品的微生物限度检查。

3.参考标准《中华人民共和国药典》（2020版第四部1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法）《医疗器械的灭菌微生物学方法第1部分：产品上微生物总数的测定》《医疗器械的灭菌微生物学方法第1部分：产品上微生物总数的估计》4.接受标准4.1.阴性对照组不长菌；4.2.回收率（试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值）应在0.5~2范围内；4.3.若回收率小于0.5，考虑产品有抑菌性，则重新考虑检查方法的建立。

5.人员职责5.1.成员及其职责详见表一：表一人员及职责5.2.培训要求确保参与验证的所有人员了解其职责和角色，以及验证的过程和要求。

验证开始前，负责本次验证的检验员将对参与确认执行的人员讲解验证的过程和要求，并记录在《培训记录》中。

适用时，培训考核记录作为附录包含在验证报告中。

6. 抽样计划随机抽取3个批次，每个批次随机抽取7套样品。

具体信息详见表二：表二 样品信息确认人/日期： 复核人/日期： 7. 设备、试剂和菌种信息 7.1. 设备信息详见表三表三 设备信息确认人/日期：复核人/日期： 7.2. 试剂信息详见表四表四 试剂信息确认人/日期： 复核人/日期： 7.3. 菌种信息详见表五表五 菌种信息确认人/日期：复核人/日期：7.4.菌液的制备用接种环取枯草芽孢杆菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取金黄色葡萄球菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取铜绿假单胞菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取白色念珠菌的斜面培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的菌悬液；用接种环取黑曲霉的斜面培养物，向培养物中加入10mL0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，转移孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成浓度≤100cfu/mL的孢子悬液。

无菌检查和微生物限度检查操作规范

无菌检查和微生物限度检查操作规范

无菌检查和微生物限度检查操作规范（中国药品生物制品检定所）一、无菌室的要求：无菌室是无菌检查、微生物限度检查的重要设备，面积不小于6平米，高度2.4-2.8m为宜。

建筑材料要光洁，不吸潮，无凸起，耐腐蚀，易清洗。

无菌室内部应六面光滑，无缝隙，里面连接处应呈凹凸形，不留死角。

操作间和缓冲间的门不应直对，缓冲间两个。

无菌室内采光面积要大，照明灯应镶嵌在天花板内，光照应分布均匀，光照度不低于300lux，电源开关应设在室外。

无菌室、缓冲间和操作间均应设置紫外线杀菌灯，每立方米2-2.5瓦，距实验台高度不超过1米，并应定期检查辐射强度，距1米处应不低于70微瓦/平方厘米，无菌室内应安装空气除菌过滤层流装置及调温装置，控制温度18-26℃，相对湿度40%-60%，操作间或净化工作台的洁净空气应保持与相临环境形成正压，不低于4.9帕。

操作区洁净度100级，操作间洁净度10000级，洁净度定期检查。

无菌室及缓冲间不得存放其他杂物，如培养箱。

用消毒液清洁无菌室操作台面，开启无菌室紫外灯和层流空气过滤30分钟以上。

无菌室的无菌程度，常用的沉降菌测定方法为：取营养肉汤琼脂平板3个，置无菌室的操作区台面左、中、右位置上，开盖暴露30分钟，在30-35℃培养2天后，计算菌落数。

用于无菌检查的无菌室或微生物限度检查的无菌室，细菌总数应小于3个，浮游菌每立方米应小于5个，否则，不能用于无菌检查和微生物限度检查。

二、培养基的准备1、培养基的制备：配制培养基的蒸馏水或去离子水应符合规定。

再称取需气菌、厌气菌培养基、真菌培养基的干燥培养基，加水溶化后，调节PH值，使灭菌后需气菌、厌气菌培养基的PH值为7.0-7.3，真菌培养基的PH值为6.2-6.6，分装、盖塞、灭菌，待用。

2、培养基灵敏度试验：培养基是无菌试验的基准物质，关系到无菌试验结果的科学、准确、可信度，因此，培养基灵敏度试验是无菌试验的重要组成部分。

只有使用灵敏度试验合格的培养基，才能保证无菌试验结果准确、可靠。

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微生物实验室的质量管理
一、实验室设施与设备和管理
• • • • • 设施—洁净室、净化工作台、生物安全柜。 设备—高压蒸汽灭菌器、电热恒温干烤箱、培养箱、冰箱。 实验仪器—全封闭薄膜过滤装置、电动匀浆仪、电热恒温水浴箱、离心 机、显微镜，及刻度吸管、试管、三角烧瓶、培养皿等。 建立主要设施、设备、仪器的明细记录，内容包括名称、型号、生产厂 家、购买日期。 质量保证档案：购买发票、安装验收或开箱验收记录、调试记录、计量 检定或运行校验合格证、指定专人负责、制订标准操作规程（SOP）、 建立使用登记册，维修、保养记录、改造或更新记录、直至报废记录。
•严格分开的无菌检查、微生物限度检查、无菌采样室。 •菌种处理与微生物鉴别室有局部百级措施。 •各自分开的抗生素微生物检定、细菌内毒素检查、抗菌作用测定半无菌 室。 •培养室（一般为100，000级）。 •试液及培养基的配制室。 •灭菌室。
•实验器皿洗涤、烘干室。
•人员办公休闲室。 •实验用品、易耗品储藏室。
一、菌种的保存与管理
1. 菌种—特殊的标准品 应保持基生长特性和减少污染，是微生物实
菌种名称：金黄色葡萄球菌
菌种系列号：[CMCC(B)26003]
验结果一致性的重要保证。
2. 制定菌种保藏管理制度
传代次数：第 4 代 有 效 期： 年 月 日 制备日期： 年 月 日 传 代 人：王熙凤
微生物实验室应制定菌种的保藏管理规程来规范菌种的来源、申购、保 管、转种传代、存储和领用等方面的要求，确保菌种的溯源性和稳定性； 防止试验用菌种因多次传代而失去典型生物学特征发生变异或死亡，保证 菌种长期正确、稳定，从而确保实验的灵敏度和重现性。
菌种的传代和保藏
菌种的保藏方法
• 使菌种的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，从而在一定时间内 不发生变异并保持生命活力。 • 一般来说，低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的三个 重要因素 • 无论使用那种菌种保藏方法，都应进行验证，以确保在相应保存条 件下的菌种不会变异并且性能稳定。 • 菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代（GMP，药 典） • 将微生物接种至一新鲜培养基上/内，每萌发一次即称为“一代”。
菌种的确认
• 从培养肉汤中取细菌培养物接种到平板上，上划线分离出单个菌落。 • 培养后观察其是否具有典型的菌落形态 • 然后挑取单一的纯菌落，进行革兰染色、镜检，观察其染色特性及 菌形。 • 最后再做生化实验以进一步鉴定该菌种，或用API鉴定系统做鉴定 工作。 • 对已经过鉴定确认的菌种就可以进行菌种的传代和保藏了。
微生物实验室的质量管理
•菌种保存应有专人负责，加锁保存于冰箱中。 •实验室的标准菌株应来自CMCC（中国药品生物制品检定所医学菌种保 藏中心或ATCC（美国菌种保藏中心）等国际法定菌种保藏机构。有接 收、确认记录。 •菌种的转种等均应在超净工作台进行，以防污染。 •各种菌种应按规定时间接种，所有保藏的菌种均应贴有相应的标签，有
甘油冷冻管保藏法
• 将待保藏菌接种至平板或琼脂斜面，培养
• 用无菌接种环轻轻刮取菌台，用接种环使细菌充分扩散到预先装于
试管中的无菌蒸馏水中 • 调整菌液浓度，使其等同于麦氏比浊管第10号管
• 向已制备好的菌悬液中加入等体积、浓度为20%的无菌甘油，得到
10%甘油菌悬液。 • 轻轻振摇小管，使内容物充分混合，分装于无菌小试管。
微生物实验室的质量管理
一、实验室设施与设备和管理
1. 定期监测生物安全柜和（或）超净工作台的内表面的微生物学质量及其 内部的空气质量（粒子和微生物）。使用时检查压差指示表。 2. 培养箱、冰箱需在设备的每个腔室内放置经校准过的玻璃温度计，每天 检查设备腔室内的温度状况并且在日志上做好相应的记录。定期回顾每 个设备的温度记录数据，以考察设备的运行状态。 3. 定期用中性的清洁剂或消毒剂清洗培养箱（或室）、冷藏箱（或室）、 冷冻冰箱及水浴的腔室内表面。 4. 高压灭菌柜、电热恒温干燥箱等需要验证和持续监控。 5. 仪器的校准和确认。
• 优点：操作简单，使用方便，不需特殊设备，对大多数微生物都适 用。 • 缺点：保藏期太短；传代次数多，易发生变异及污染。 • 此法为实验室工作用菌种的最常用的保藏方法，仅能用于工作用菌 种的短期保藏。
• 此法保藏霉菌、放线菌、芽胞杆菌可保藏两年以上，酵母菌可保藏1~2年， 一般无芽胞细菌也可保藏1年左右。
•
此法制备简单，不需要其他特殊设备，并且效果好，是传代培养的变相方
法，可适当延长保藏时间。
琼脂斜面低温保藏法保藏法（厂家常用）
• 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，生长充分后，移至2~8℃
冰箱中保藏。 • 保藏时间： •霉菌、放线菌及芽胞的菌保存2~4个月，移种一次； •酵母菌2个月移种一次； •细菌最好每1月移种一次。
冷冻真空干燥保藏法
主要是将待保藏菌种混于有保护作用介质内制成菌液，分装在安 瓿中于冷冻条件下使其快速冻结，因冻结可使晶型细致，不致损伤活 菌细胞。然后用真空抽气减压，是安瓿内的冰晶液体升华，水气迅速 被真空抽走，冰晶型的菌液很快变成疏松的干燥固体物，最后在真空 状态下熔封管口，使干燥物在局部真空条件下封存，并置冷暗处，在 很长时间内菌种仍可维持活力不变。
• 制好的甘油冷冻管最好在-30℃条件下贮存。
• • 有效期至少为2年。 氧细菌和酵母菌可用此法保藏，霉菌和厌氧菌则不适于用此法保藏。
液体石蜡覆盖保藏法
• 将菌种穿刺接种于半固体高层培养基中培养，
• 无菌操作在层流台下用无菌吸管吸取无菌液体石蜡至培养好的菌种
管内，并使石蜡高出菌种表面约1cm， • 将试管直立，置于2~8℃冰箱中或室温下保存，如铜绿假单胞菌。
微生物实验室的质量管理
清洁、消毒剂的管理
•品种：5~20倍稀释的碘伏水溶液 •0.10%新洁尔灭容易 •1:50的84消毒液
•75%乙醇溶液
•3%碘酒溶液 •5%石碳酸（来苏儿）消毒溶液 •2%戊二醛水溶液 •尼泊金酒精消毒液等 •应定期更换消毒剂品种，按标准准确配制。
微生物实验室的质量管理
无菌、微生物限度检查 及方法验证
微生物实验室的质量管理
一、实验室设施与设备和管理（法规要求）
•无菌检查、微生物限度检查与抗生素微生物检定的实验室，应严格分开。
□无菌检查、微生物限度检查实验室分无菌操作间和缓冲间。 □无菌操作间应具备相应的空调净化设施和环境，采用局部百级措施 时，其环境应符合万级洁净度要求。 □进入无菌操作间应有人流净化和物流净化的设施。 □无菌操作间应根据检验品种的需要，保持对邻室的相对正压或相对 负压，并定期检测洁净度。
菌种清单。
验证实验常用菌种
•枯草芽孢杆菌 •金黄色葡萄球菌 •生孢梭菌 [CMCC（B）63501] [CMCC（B）26003] [CMCC（B）64941]
•铜绿假单胞菌
•大肠埃希菌 •乙型副伤寒沙门菌 •白色念珠菌 •黑曲霉
[CMCC（B）10104]
[CMCC（B）44102] [CMCC（B）50094] [CMCC（B）98001] [CMCC（B）9 003]
微生物实验室的质量管理
•设施和设备的管理 •特殊标准品——菌种 •培养基、缓冲液、试剂 •消毒剂 •文件管理
•培训
•内审
微生物实验室的质量管理
•微生物室实验室的质量管理制定 •洁净室（无菌室）的使用管理规程（SOP） •菌种处理相关的标准操作规程（SOP） •生物安全柜的使用标准操作规程（SOP） •带菌废弃物的处理标准操作规程（SOP） •环境消毒标准操作规程（SOP） •环境清洁、消毒标准操作规程（SOP） •试液及培养基配制的标准操作规程（SOP） •实验器皿洗涤标准操作规程（SOP） •建立无菌室使用登记册 •使用日期，时间，使用人，设备运转状况，温、湿度，洁净度状况 （沉降菌数、浮游菌数、尘埃粒子数），报修原因，报修结果，清洁 工作（台面、地面、墙面、天花板、传递窗、门把手），消毒液名称 等
□无菌操作间内禁放杂物，并应制定地面、门窗、墙壁、设施等的定 期清洁、灭菌规程。
•无菌检查在洁净度100级单向流空气区域内进行，其全过程应严格遵守无 菌操作，防止微生物污染。单向流空气区与工作台面，必须进行洁净度验 证。微生物限度检查的全过程，均应遵守无菌操作，严防再污染。
微生物实验室的质量管理
为满足微生物学实验要求，微生物实验室应具有：
微生物实验室的质量管理
需要确认和验证试验和 持续的质量监控的设备
• 高压灭菌柜和电热恒温干燥去热原烘箱 • 安装确认（IQ）：要确认控制系统及其他仪器仪表的设计是否得当并经 过校验。检查有关共用介质（如蒸气、水和空气等）符合灭菌工艺的要 求。 • 运行确认（OQ）：要求证明空载状态下验证方案中所述腔室内所有关 键位置的温度是否均处在规定范围内。建立热分布图谱。空载状态下， 湿热灭菌当腔室工作温度不低于121℃时，各点温度与腔室内平均温度 之差不超过±1 ℃，于热除热源，当运行温度不低于250 ℃时，腔室内 的温差应不得超过±15 ℃。 • 性能确认（PQ）：要求在满载条件，温度探头插入待灭菌物品的内部， 同时加入一定浓度的微生物或独立的生物指示剂。 • 对不同的工艺条件（物品、包装和装载方式、灭菌参数等），分别进行 性能确认试验，包括热穿透试验和生物指示剂挑战试验。 包括：高压灭菌柜、除热源电 热恒温干燥箱、自动微生物鉴 别系统和计数系统。
微生物实验室的质量管理
洁净室（无菌室）的使用管理
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每季度定期进行清洁度再验证，以确保洁净度符合规定，保存原始记录 及趋势分析资料，定期归档保存。
至少每年一次定期更换新的紫外灯管并记录，以确保紫外灯管灭菌持续 有效，定期归档保存。 至少2年1次，或按洁净度验证实际情况，定期更换初效、中效、高效 头。以确保净化系统的功能持续有效，并同时在使用登记本上做好更换 记录。定期归档保存。 平时实验室内应尽可能减少人员的走动或活动，通向洁净室的门要关闭 或安装自动闭门器使其保持关闭状态。 发现洁净度不符合规定时，应立即停止使用，寻找原因，彻底清洁、消 毒，须经清洁度再验证符合规定后，才再使用，并将情况记录在无菌室 使用登记册上，定期归档保存。 非微生物室检验人员不得进入洁净室（无菌室），对必须进入的外来人 员或维修人员应进行指导和监督。