微生物限度方法学验证方案(沙门菌)

沙门氏菌检验能力验证技术方案沙门氏菌是一种存在于动物和人类肠道中的细菌，可以引起沙门氏菌感染。

由于其传播途径多样且易于感染，沙门氏菌成为食品安全和公共卫生的重要问题。

为了确保食品的安全性，需要对检测沙门氏菌的实验室进行能力验证。

以下是一个针对沙门氏菌检验能力验证的技术方案。

一、实验室设备准备1.需要准备培养基、培养皿、离心管和移液器等常规实验室设备。

2.保证实验室的温度和湿度适宜，以促进沙门氏菌的生长和培养。

二、样本准备1.选择新鲜的食品样品，如鸡蛋、肉类或蔬菜等，并保证样品的新鲜度，以确保样品中的沙门氏菌含量。

2.将样品进行消毒，以杀死潜在的细菌和病原体，然后进行预处理，如打碎、切割或混合。

三、沙门氏菌培养和检测1.使用适当的培养基，如SS培养基或XLD培养基等，将样品接种到培养皿中，然后在适当的温度和湿度下培养。

2.根据实验需要，选择不同的培养期，一般情况下选择24小时的培养期。

3.培养结束后，观察培养皿上是否有沙门氏菌的生长，如有则表示样品中可能含有沙门氏菌。

4.进一步确认是否为沙门氏菌，可以进行进一步的鉴定测试，如气体产生试验或生化试验等。

四、记录和分析结果1.对于每个样品，记录培养结束后培养皿上的菌落数量和形态。

2.分析结果，计算出样品中沙门氏菌的存在量，可以使用经验计数法或统计学方法进行计算。

3.将实验结果与预期结果进行比较，评估实验室的沙门氏菌检验能力是否达到要求。

五、能力验证1.根据实验需要和要求，选择合适的参考材料进行能力验证。

2.安排合适的被试验员进行实验，确保实验员具备相关的培训和经验。

3.分析验证结果，评估实验室的沙门氏菌检验能力，并根据结果进行改进和调整。

六、结果验证1.将实验结果分析和能力验证结果整理成报告，明确实验室的沙门氏菌检验能力是否达到预期要求。

2.如果实验室的能力未达到要求，可根据评估结果进行改进和培训，以提高实验室的能力。

通过以上技术方案，可以对沙门氏菌的检验能力进行有效的验证。

微生物限度检查法细菌及控制菌培养温度为30～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23～28℃。

检验结果以1g、1ml、10g、10ml或10cm2为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。

检验量检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml或cm2)。

除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。

要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml(其中10g 或10ml用于阳性对照试验)。

检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，大蜜丸还不得少于4丸，膜剂还不得少于4片。

一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包装单位)的3倍量供试品。

供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。

供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。

供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。

常用的供试液制备方法如下。

1．液体供试品取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10的供试液。

油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。

水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。

2．固体、半固体或黏稠性供试品取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1：10的供试液。

必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。

阴性（-）对照试验取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。

每种计数用的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。

阳性（+）对照试验阳性对照试验方法同供试品的控制菌检查，对照菌（检测的控制菌）的加菌量为10～100cfu（加对应控制菌制成的溶液1ml）。

阳性对照试验应检出相应的控制菌。

培养和计数除另有规定外，细菌培养3天，霉菌、酵母菌培养5天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数，必要时，可适当延长培养时间至7天进行菌落计数并报告。

微生物限度检测方法学验证方案文件编号：P-批准签字页目录1.目的 (4)2.范围 (4)3.责任者及职责 (4)4.验证简介 (4)5．验证过程 (7)6．结果判断 (8)7．结论和建议 (8)8．异常情况报告 (8)9．再验证 (8)10．附件 (8)附件1：培养基的灵敏度复核 (9)附件2：稀释液的无菌性检查 (10)附件3：方法验证 (11)1. 目的按照中国药典2010版（第三部），采用薄膜过滤法进行微生物限度检查，本方案对新修订的方法进行验证。

2. 范围本公司要求进行微生物限度检查的原辅料和制剂，中间制品以及消毒剂。

3. 责任者及职责4. 验证简介4.1 定义●CFU：菌落数●供试品对照组取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。

●试验组当采取薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌加在最后一次冲洗液中，过滤后，取出滤膜接入对应培养基中。

●菌液组测定所加的试验菌数。

●稀释剂对照组用相应的稀释液替代供试品，按试验组规定的方法进行菌落计数。

4.2 菌悬液4.2.1菌种及来源检查人：复核人：检查日期：4.2.2菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，30~35℃培养18~24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，20~25℃培养24~48h。

上述培养物用0.9％无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数50~100CFU的菌悬液。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23~28℃培养5~7天，加入3~5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~100CFU的孢子溶液。

4.3 培养基及稀释液4.3.1培养基和稀释液的名称培养基：营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基稀释液：pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲溶液、灭菌纯化水4.3.2培养基灵敏度复核培养基灵敏度复核，参见《培养基的灵敏度检查操作规程》QC2524.3.3稀释液的无菌性检查对稀释液进行无菌检查，14天规定温度培养后应无菌。

2020版药典微生物限度计数—沙门菌2020版本药典(1) 菌种及菌液制备1) 菌液制备将铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌分别接种在胰酪大豆胨琼脂培养基上，35℃条件下培养24小时，将新鲜培养物用pH7.0的0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液。

(2) 控制菌检查方法适用性试验控制菌检査用培养基的适用性检查项目包括促生长能力、抑制能力及指示特性的检查，各培养基的检查项目及所用的菌株见表1。

表1 控制菌检査用培养基的促生长能力、抑制能力和指示特性沙门菌菌检查方法适用性试验1、RV沙门菌增菌液体培养基促生长能力检查：分别接种不大于l00cfu的乙型副伤寒沙门菌于被检培养基和对照培养基中，在35℃条件下培养18小时。

2、RV沙门菌增菌液体培养基抑制能力检查：分别接种不大于l00cfu的金黄色葡萄球菌于被检培养基和对照培养基中，在35℃条件下培养24小时。

3、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基促生长能力检查：分别接种不大于l00cfu的乙型副伤寒沙门菌于被检培养基和对照培养基中，在35℃条件下培养18小时。

4、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基指示特性检查：分别接种不大于l00cfu的乙型副伤寒沙门菌于被检培养基和对照培养基中，在35℃条件下培养18小时。

5、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基抑制能力检查：分别接种不大于l00cfu的乙型副伤寒沙门菌于被检培养基和对照培养基中，在35℃条件下培养24小时。

6、三糖铁琼脂培养基指示特性检查：分别接种不大于l00cfu的乙型副伤寒沙门菌于被检培养基和对照培养基中，在35℃条件下培养18小时。

7、三糖铁琼脂培养基抑制能力检查：分别接种不大于l00cfu的乙型副伤寒沙门菌于被检培养基和对照培养基中，在35℃条件下培养18小时。

(3) 沙门菌检査1) 供试液制备和增菌培养取10g供试品直接接种至90ml的胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，35℃培养24小时。

微生物限度检查方法适用性试验方案一、试验目的本试验旨在验证微生物限度检查方法的适用性，并评估其在实际样品中的准确性、精密度和灵敏度，以确保检测结果的可靠性。

二、试验范围本试验适用于各类药品、食品、环境以及生物制品等样品的微生物限度检查。

三、试验设备与试剂1. 培养基：本试验需使用适当的培养基，如大肠杆菌培养基、沙门氏菌培养基等，以满足特定微生物的培养需求。

2. 灭菌设备：试验中的培养基、工具及试剂需经过灭菌处理，以保证试验环境的无菌状态。

3. 微量移液器：用于准确取样和移液，确保实验的精确性。

4. 微生物培养箱：用于提供适宜的温度和湿度条件来培养微生物样品。

四、试验步骤1. 样品制备：按照相关规定和标准采集样品，并根据不同样品的特性进行适当处理，以便得到具有代表性的样品。

2. 培养基接种：将样品按照试验要求接种到相应的培养基中，并在一定条件下进行培养，以促使微生物生长。

3. 培养基培养：将接种过样品的培养基置于微生物培养箱中，根据微生物的生长特性进行培养，通常包括温度、湿度和培养时间等方面的控制。

4. 结果观察与记录：根据实验要求，观察培养基上是否有微生物的生长，并记录对应的观察结果。

5. 试验数据处理与分析：根据试验结果进行数据处理与分析，并评估微生物限度检查方法的适用性、准确性和灵敏度。

五、试验评价指标1. 准确性：通过与参考方法的比对，评估限度检查方法的准确程度。

2. 精密度：利用不同实验者、设备和试剂的重复试验，评估方法的可重复性和稳定性。

3. 确定度：评估方法的灵敏度和特异性，以确定方法对微生物的检测能力。

4. 可靠性：综合以上评价指标，评估方法在实际应用中的可靠性和适用性。

六、试验结果与分析根据试验评价指标，通过一系列试验和数据分析，我们可以得出以下结论：1. 限度检查方法在各类样品中的准确性良好，能够准确反映样品中微生物的含量。

2. 试验结果表明，方法具有较好的重复性和稳定性，不同实验者、设备和试剂的试验结果相对一致。

微生物限度检验方法验证方案1. 适用范围本方案适用于本公司各品种微生物限度检验方法的验证。

2. 目的通过验证确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度的测定。

3. 职责项目责任人：负责验证方案的起草及具体实施。

验证管理员：负责验证工作的组织、协调及管理。

QA 现场监控员：负责验证实施过程中的监督检查，取样，确保结果的可靠性。

QC 负责人：负责验证方案中检验方法的审核及按照规定的取样计划对标准检验操作程序的准确执行，负责组织实施。

QC 检验员：负责验证方案的起草与参与实施，并对所测数据准确性负责。

质量部经理：负责验证方案及报告的审核和批准。

4. 内容4.1. 概述通过验证以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定；确认所采用的方法适合于该药品的控制菌的检查。

根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。

若符合，按验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。

4.2 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证当建立药品的微生物限度检查时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定。

验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。

4.2.1. 验证用菌株及菌种要求大肠埃希菌【CMCC（B）44102】金黄色葡萄球菌【CMCC （B）26003】枯草芽孢杆菌【CMCC （B）63501】黑曲霉【CMCC （F）98003】白色念珠菌【CMCC （F）98001】。

大肠埃希菌为革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，枯草芽孢杆菌为产芽孢杆菌，前述菌株作为细菌计数验证用菌株；黑曲霉为霉菌，白色念珠菌为酵母菌，作为霉菌及酵母菌计数验证用菌株。

验证实验所用的菌株传代次数不得超过 5 代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0 代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。

1.概述:培养基是微生物试验的基础，直接影响微生物试验结果。

适宜的培养基制备方法、贮藏条件和质量控制是提供优质培养基的保证。

供试品微生物限度检查中所使用的培养基应进行适用性检查。

2.验证目的：本次验证的目的是确认沙门菌检查用培养基适用性检查用的RV沙门菌增菌液体培养基、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基、三糖铁琼脂培养基的质量，以及其制备程序、保存条件等是否满足微生物限度检查用要求。

3.验证依据：《中国药典》2015年版四部“1106非无菌产品微生物限度检查：微生物控制菌检查”、“9203药品微生物实验室质量管理指导原则”。

4.验证项目：RV沙门菌增菌液体培养基、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基、三糖铁琼脂培养基的适用性检查。

5.适用范围：成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。

6.验证周期：除另有规定外，在实验室中，若采用已验证的配制和灭菌程序制备培养基且过程受控，那么同一批脱水培养基的适用性检查试验可以只进行一次。

如果培养基的制备过程未经验证，那么每一灭菌批培养基均要进行适用性检查试验。

7.验证小组人员及职责：7.1验证小组人员:7.2验证人员职责及要求7.2.1按验证方案及相关文件实施验证。

7.2.2认真观察并做好验证原始记录。

7.2.3对实施验证的结果负责。

7.3验证中各部门的职责7.3.1验证领导组职责7.3.1.1制订验证总计划，负责全公司验证工作的管理。

7.3.1.2确定验证项目及验证项目负责人。

7.3.1.3负责验证方案的批准工作。

7.3.1.4负责验证资料及结果的审核工作。

7.3.1.5负责验证报告的批准工作。

7.3.2验证项目小组职责7.3.2.1负责验证方案的起草工作。

7.3.2.2参与验证方案的讨论、确认工作。

7.3.2.3负责验证方案的实施。

7.3.2.4负责验证结果的分析、统计、报告工作。

7.3.2.5参与验证结果的评价工作。

7.3.3质量部职责7.3.3.1负责公司验证日常管理工作。