微生物限度方法学验证 ppt

微生物限度检查方法学验证一、检验方法依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。

表4试剂稀释液：（1）pH6.8取，摇匀，既得。

（2）0.9%（3）0.05用。

（420ml徐徐滴入。

1细菌、霉菌、酵母菌接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。

上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。

菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。

2控制菌接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。

用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu的菌悬液。

菌悬液在室温下放置应在122.130～35℃培养48小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉1ml(内含菌约50～100cfu)，注入无菌平皿中（取用黑曲霉时应注意自身安全），立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数。

同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验，作为对照。

其大小、形态应与对照培养基一致，且数量应不小于对照培养基的70%。

细菌、霉菌及酵母菌培养基适用性检查证明此批次培养基可以准确的检测出相应微生物情况。

微生物限度检查法微生物限度检查在环境的洁净度10000级和局部100级的单向流空气区域内进行，其全过程应严格遵守无菌操作，以防再污染。

单向流空气区域、工作台面及环境必须定期按国家《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌测试方法》现行标准进行洁净度验证。

隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。

灭菌和培养温度：细菌培养温度为30～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23～28℃；控制菌培养温度为35～37℃检验量：检验量指供试品一次检验的用量。

一般为10g或10ml；化学药膜剂为100cm2；贵重或微量包装的药品可酌减（不得少于3g）。

检查沙门菌的供试品其检验量增加10g或10ml。

一般随机抽样不少于检验用量（2个以上最小包装）的3倍量。

供试液的制备：用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液制备供试液或选用适宜的乳化剂、分散剂、中和剂制备供试液；其用量应验证，在该检验条件无抗菌作用。

供试液制备妥后不得超过1h就加入检验用培养基具抑菌活性的供试品当供试品具有抑菌活性时，应将供试液中的抑菌活性消除后，方能依法检查。

常用的方法有：⏹稀释法——降低供试品的相对浓度⏹薄膜法——利用体积差异分离⏹中和法——利用化学（生物）专属性灭活⏹离心法——利用沉降系数差异分离一、微生物限度检查法验证对药品进行微生物限度检查法时，首先应进行检测方法的验证。

如细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认该计数方法是否科学、准确、客观。

若供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。

验证时，按供试液的制备，细菌、霉菌和酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。

对各试验菌的回收率应逐一进行验证。

验证用菌株及菌液的制备菌株大肠埃希菌CMCC（B）44102、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、枯草芽孢杆菌、CMCC（B）63501白色念株菌CMCC (F) 98001、黑曲霉菌CMCC(F)98003 。

微生物限度检验方法验证概述说明1. 引言1.1 概述微生物限度检验方法验证是一项重要的实验技术，用于评估和确认微生物对产品的影响程度和存在情况。

它可以帮助我们了解产品中是否存在有害微生物，并确保产品在使用过程中的安全性。

本文旨在介绍微生物限度检验方法验证的概念、重要性以及一般流程，并详细介绍常见的验证技术及其特点。

1.2 文章结构本文将分为五个部分进行阐述。

首先，在引言部分可以了解到微生物限度检验方法验证的概述、目的和文章结构。

接下来，在第二部分中探讨微生物限度检验方法验证的重要性，包括其背景与意义、验证方法的必要性以及验证结果的影响和应用。

第三部分将介绍微生物限度检验方法验证的一般流程，包括设计验证方案和实验步骤、样品的准备与处理，以及实验操作及数据分析。

在第四部分中，则具体介绍常见微生物限度检验方法验证技术，包括营养琼脂培养基平板计数法验证方法、膜过滤法验证方法以及PCR法验证方法。

最后，在第五部分中进行总结，对微生物限度检验方法验证的重要性进行归纳，并展望未来的发展方向。

1.3 目的本文的目的是为读者提供一个清晰全面了解微生物限度检验方法验证的文章。

通过介绍其概述、重要性、一般流程和常见技术，希望读者能够理解微生物限度检验方法验证在产品质量控制中的作用，并对未来方向有所思考。

同时，本文也为从事相关研究和实验工作的科研人员提供了参考和指导，以提高微生物限度检验方法验证技术的应用水平。

2. 微生物限度检验方法验证的重要性2.1 微生物限度检验的背景和意义微生物限度检验是一项重要的质量控制方法，用于评估药品、食品、化妆品以及其他消费产品中是否存在病原微生物和致病菌。

微生物污染可能引发严重的健康问题，包括细菌感染、传染病传播和中毒等。

因此，确保产品符合相关标准和法规对于保护公众健康至关重要。

2.2 验证方法的必要性验证微生物限度检验方法的准确性和可靠性是非常必要的。

通过验证方法，可以确认该方法能够准确地检测出有害微生物存在，并排除误报或漏报的可能性。

药品微生物限度检查方法验证一般步骤1.样品及确定验证项目样品要求：不含菌或少量菌验证项目：根据药品用药途径、处方、制法确定。

细菌、霉菌及酵母菌计数验证（一般必作）；控制菌检查如为中药制剂必须查标准，根据用药途径、处方、制法确定控制菌检查项目。

特殊的如滴眼剂、用于烧伤、严重创伤等应根据制剂通则项下要求及微生物限度标准来确定。

2. 确定供试液制备方法3. 方法选择预试验（1）目的：确定样品对试验菌有无抑菌活性及计数验证各试验菌的回收试验方法。

（2）查资料，根据样品的功能、主治及所含成分等确定方法选择预试验方案。

（3）根据预试验结果确定各试验菌计数验证方法控制菌验证方法4. 验证试验：选择3个批号样品进行3次独立实验，证明方法的有效性；5. 据验证结果优化试验条件，建立微生物限度检查方法SOP。

6. 写出验证资料。

示教内容11.5.上午：菌液制备方法：一. 新鲜浓菌液制备（要求学员练习操作的内容）新鲜浓菌液接种：细菌大肠埃希菌[CMCC（B）44102]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]生孢梭菌[CMCC（B）64941]（厌氧梭菌）铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]培养基：营养肉汤3-5ml、硫乙醇酸盐流体培养基3-5ml接种及培养：1.分别取各试验菌半个--1个菌落分别接种营养肉汤（充分研匀、摇匀），36±1℃培养16-18小时。

2.生孢梭菌新鲜培养物取0.1ml接种硫乙醇酸盐流体培养基（临用前排氧）36±1℃培养18-24小时。

霉菌及酵母菌白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]培养基：改良马丁培养基3-5ml；改良马丁琼脂培养基斜面1.取白色念珠菌的菌落接种改良马丁培养基23-28℃培养24小时（可用36±1℃培养18-24）。

2.黑曲霉孢子悬液的制备：沾取黑曲霉孢子接种改良马丁琼脂培养（红字为示教内容基，培养5-7天待培养物黑色孢子生长（全部变黑，已制备好斜面培养物示教）加入5-10ml0.9%氯化钠溶液，小心振挡洗脱表面的黑色孢子1-2次，吸出洗脱液（注意不要触到菌丝体）即为孢子悬液。

微生物限度方法学验证 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】微生物限度检查方法学验证一、检验方法依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。

二、菌种、培养基及稀释液表2培养基表3对照用培养基表4试剂稀释液：（1）缓冲液取L磷酸二氢钾溶液250ml,加L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml，摇匀，既得。

（2）%无菌氯化钠溶液取氯化钠，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。

（3）％（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液取聚山梨酯80 ，用％无菌氯化钠溶液溶解并稀释至1000ml，滤过，分装，灭菌，备用。

（4）靛基质试液取对二甲氨基苯甲醛，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml徐徐滴入。

三、菌液的制备1细菌、霉菌、酵母菌接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。

上述培养物用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入5ml含％（ml/ml）聚山梨酯80的%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数50～100cfu的孢子悬液。

菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。

2控制菌接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。

用%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～100cfu 的菌悬液。

《中国药典》 2005年版微生物限度检查法的方法验证试验目录一、微生物限度检查的意义二、微生物限度检查的范围三、验证的目的四、验证的类型五、验证的过程一、微生物限度检查的意义药品是治病防病，关系患者生命健康的特殊商品，必须保证其质量,用药的安全与有效。

微生物污染药品引起的药源性疾病屡见不鲜，在国内外均有报道。

为保证药品质量，必须对微生物污染进行必要的控制和检验。

其意义在于(1)保证药品质量已有许多实例表明，药品污染微生物不仅危机病人用药安全，而且也直接影响药品的有效性，所以药品卫生质量是药品质量不可分割的部分。

(2) 反映药品生产工艺的科学性，合理性及质量管理水平，通过检验，凡工艺条件，生产管理水平，生产人员的素质差，不注意文明生产的单位和企业，其生产的药品，染菌必然严重，不合格率无疑就高。

微生物限度的检验是提供药品卫生质量的重要依据，因而在保证销售与使用过程中药品的有效性和安全性，是促进与提高生产单位全面质量管理水平与提高药品质量的重要措施。

二、微生物限度检查的范围1．根据药品使用要求，把药品化为两大类:(1) 规定灭菌药品:包括注射剂和输液剂，及用于体腔，严重烧伤,溃疡,出血用药等制剂。

(2) 非规定灭菌药品:包括常用口服制剂与一般外用制剂。

对这一部分制剂一般不要求绝对无菌，允许一定限量的微生物存在，但同时规定不得有可疑致病的细菌存在。

由于致病菌的范围很广，各国药典都规定了几个常见的致病菌或指示菌作为控制菌。

2．在非灭菌的各种制剂中，对每克或每毫升的药品按剂型或品种不同规定(1)染菌量检查:包括细菌数，霉菌数及酵母菌数测定，以检查这几类微生物对药品的污染程度。

(2) 控制菌检查:包括大肠埃希菌，大肠菌群，沙门菌，金黄色葡萄球菌及铜绿假单孢菌，生孢羧菌。

3．药品微生物限度检验中的困难，最根本的原因在于检验对象本身的特殊性。

(1) 不确定性:药品受外来微生物的污染，这种污染是可有可无;在有中又可多可少;其种类可以多样.污染的情况依生产,设备,原材料,管理,剂型等等条件而定,非药品本身所固有.所以微生物限度检验的对象是不确定的。