聚六亚甲基胍对异育银鲫的急性毒性试验

四种抗菌药物对鲫鱼苗的急性毒性试验刘晓强;刘海侠;梁拓;梁欣欣【摘要】在水温22 ℃～25 ℃条件下,选取来源一致、规格齐整、健康无病,体重4 g±0.2 g鲫鱼苗,用培氟沙星、氟苯尼考、甲砜霉素、痢菌净4种抗菌药对鲫鱼苗进行急性毒性试验.确定每种药物在不同时间对鲫鱼苗的半致死浓度( LC50),并求出4种药物相应的安全浓度(SC).结果显示,4种药物对鲫鱼苗24 h的LC50分别为1 935.98、1 314.14、1 265.03、135.46 mg/ L;48 h的 LC50分别为1 863.62、1 154.23、1 177.05、130.53 mg/L;96 h的LC50分别为1 840.01、1 129.54、1 121.59、126.57 mg/L,SC分别为538.19、304.13、328.56、37.73 mg/L.表明培氟沙星、氟苯尼考和甲砜霉素对鲫鱼可安全使用,痢菌净毒性较大,应谨慎使用.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2010(031)001【总页数】5页(P49-53)【关键词】急性毒性;半致死浓度;安全浓度;鲫鱼【作者】刘晓强;刘海侠;梁拓;梁欣欣【作者单位】西北农林科技大学动物医学院,陕西杨陵,712100;西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨陵,712100;西北农林科技大学动物医学院,陕西杨陵,712100;西北农林科技大学动物医学院,陕西杨陵,712100【正文语种】中文【中图分类】S859.81鲫鱼(Carassius auratus)俗称鲫瓜子、喜头、鲋鱼、寒鲋等,隶属于鲤形目(Cyprininae)、鲤科(Cyprinidae)、鲤亚科(Cyprinidae)、鲫属 (Carassius),是我国分布广泛的优质经济鱼类之一。

鲫鱼肉质细嫩、肉味甜美、价格低廉、营养价值很高,深受广大人民的喜爱[1]。

鲫鱼性味甘、平、温,入胃、肾,具有和中补虚、除湿利水、补虚赢、温胃进食、补中生气之功效,药用价值很高。

南京地区异育银鲫出血性败血症病原的鉴定近年来,鲤疮疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV2)感染的流行对我国异育银鲫的养殖造成了严重的经济损失。

该病原在中国大陆部分省市地区引起的疫情已受到越来越多的关注,特别是在江苏省主要水产养殖地区。

此外,其它细菌性病原,特别是嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)也引起鲫鱼的出血性败血症。

2015年,南京地区的部分异育银鲫饲养塘口相继出现了出血性败血症疫情。

本试验采集病料42份,首先分离纯化细菌,基于气单胞菌DNA促旋酶B亚单位(gyrB)基因序列设计引物,PCR扩增后测序,进行细菌性病原的检测;同时,提取各病料样本基因组,PCR扩增CyHV2解旋酶(hel)基因,进行病毒性病原的鉴定。

结果表明,28份检测样本有气单胞菌感染,其中6份为维氏气单胞菌(A.veronii),11份为简达气单胞菌(A.jandaei),3份为温和气单胞菌(A.sobria),8份为嗜水气单胞菌(A.hydrophila)。

在42份病料中,34份为CyHV2阳性,其中在30份病死鲫鱼样本中,26份为CyHV2阳性;在12份临床健康鱼样本中,8份为CyHV2阳性,阳性率分别为86.66%和66.67%。

其中值得注意的是,CyHV2和气单胞菌均阳性的样本共20份,占47.62%;两者均阴性的样本1份;CyHV2阴性而气单胞菌阳性的样本8份。

结果表明,CyHV2和气单胞菌的混合感染是引起此次鲫鱼出血性败血症的主要致病原,其中,CyHV2的分布更为广泛。

在病原鉴定的基础上,选择3株嗜水气单胞菌进行毒力测定,其对斑马鱼的半数致死量在1.4×103～3.7×103CFU/fish,且多位点序列分型显示均为ST251型。

同时,采用差速离心结合蔗糖浓度梯度离心,进行了 CyHV2病毒粒子的纯化,电镜观察显示,在各浓度层及层交界处均有病毒粒子分布,特别是在25%与35%蔗糖溶液交界处和35%蔗糖溶液层CyHV2病毒粒子浓度及纯度均较高。

生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第16卷第5期2021年10月V ol.16,No.5Oct.2021㊀㊀基金项目:上海市自然科学基金资助项目(17ZR1424400);上海市技术性贸易措施应对专项(16TBT009)㊀㊀第一作者:王绿平(1986 ),女,硕士,工程师,研究方向为生态毒理学,E -mail:*************.cn;*******************㊀㊀*通讯作者(Corresponding author ),E -mail:*************.cn;*******************DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20201105002王绿平,张京佶,赵华清.稀有鮈鲫作为鱼类胚胎急性毒性试验受试鱼种的敏感性研究[J].生态毒理学报,2021,16(5):102-112Wang L P,Zhang J J,Zhao H Q.Sensitivity of Chinese rare minnows (Gobiocypris rarus )for fish embryo acute toxicity test [J].Asian Journal of Ecotox -icology,2021,16(5):102-112(in Chinese)稀有鮈鲫作为鱼类胚胎急性毒性试验受试鱼种的敏感性研究王绿平*,张京佶,赵华清上海市检测中心生物与安全检测实验室,上海201203收稿日期:2020-11-05㊀㊀录用日期:2021-01-04摘要:通过验证稀有鮈鲫在鱼类胚胎急性毒性试验中的敏感性,评价其在鱼类替代试验中的应用潜力,为相关化学品测试国家标准的制定提供依据㊂选取3,4-二氯苯胺(3,4-DCA)㊁五水硫酸铜(CSP)㊁2,3,6-三甲基苯酚(2,3,6-TMP)㊁二甲基亚砜(DMSO)㊁七水硫酸锌(ZSH)㊁三甘醇(TEG)㊁氯化钠(SC)㊁十二烷基硫酸钠(SDS)㊁重铬酸钾(PD)㊁甲基异噻唑啉酮(MIT)㊁二苯甲酮(BP)㊁二氯苯氧氯酚(TCS)㊁1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)㊁三唑酮(T)㊁多菌灵(C)和N -(4-氯苯基)-N -(3,4-二氯苯基)脲(三氯卡班,TCC)16种化学品,按照‘OECD 化学品测试准则No.236鱼类胚胎急性毒性试验“,分别进行稀有鮈鲫胚胎急性毒性试验,将结果与稀有鮈鲫成鱼急性毒性试验结果比较,评价稀有鮈鲫在不同生命周期对同一化学品的敏感性差异;同时与已有的或试验所得的斑马鱼胚胎急性毒性试验结果比较,评估稀有鮈鲫胚胎与国际标准试验鱼种胚胎间的敏感性差异㊂稀有鮈鲫胚胎急性毒性试验96h 半数致死浓度(96h -LC 50)值与其成鱼及斑马鱼相比,敏感性类似,毒性值差异均未超过一个数量级㊂稀有鮈鲫作为一种中国本土的标准试验鱼种,其胚胎生物学特征与斑马鱼类似,其胚胎敏感性不亚于成鱼和其他国际标准鱼种,适宜进行鱼类胚胎急性毒性试验的应用㊂关键词:稀有鮈鲫;胚胎;急性毒性;敏感性文章编号:1673-5897(2021)5-102-11㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:ASensitivity of Chinese Rare Minnows (Gobiocypris rarus )for Fish Embryo Acute Toxicity TestWang Lvping *,Zhang Jingji,Zhao HuaqingBioassay and Safety Assessment Laboratory,Shanghai Academy of Public Measurement,Shanghai 201203,ChinaReceived 5November 2020㊀㊀accepted 4January 2021Abstract :This study aims to evaluate the sensitivity of Chinese rare minnow (Gobiocypris rarus )as test organisms used in fish embryo acute toxicity test,and to lay a foundation for the proposed national standards of chemical tes -ting which uses fish embryo as an alternative to fish itself in acute toxicity test.According to the procedures of OECD Guidelines for the Testing of Chemicals No.236:Fish Embryo Acute Toxicity Test ,newly fertilized eggs of rare minnow were exposed to sixteen chemicals,i.e.,3,4-dichloroaniline (3,4-DCA),copper sulfate pentahydrate (CSP),2,3,6-trimethylphenol (2,3,6-TMP),dimethyl sulfoxide (DMSO),zinc sulfate (ZSH),triethylene glycol (TEG),sodium chloride (SC),sodium dodecyl sulfate (SDS),potassium bichromate (PD),2-methyl -4-isothiazolin . All Rights Reserved.第5期王绿平等:稀有鮈鲫作为鱼类胚胎急性毒性试验受试鱼种的敏感性研究103㊀3-one(MIT),benzophenone(BP),triclosan(TCS),1,2-benzisothiazolin-3-one(BIT),triadimefon(T),carbendazim(C)and triclocarban(TCC),and then,the respective median lethal concentration of the96h exposure(96h-LC50) were obtained for each chemical.By comparing the rare minnow embryo test data with the corresponding data from adult fish tests as well as those resulted from the zebra fish embryo tests,it can be found that the differences in toxicity values of different test organisms are not more than an order of magnitude,implying that the sensitivity of rare minnow embryos to studied chemicals in acute toxicity test is similar to adult rare minnow and zebra fish embryos.In conclusion,the endemic fish species Gobiocypris rarus is one of the promising candidates of standard fish species,and its embryos can produce reliable data in fish embryo acute toxicity tests.Keywords:Gobiocypris rarus;embryo;acute toxicity;sensitivity㊀㊀水生生物毒性测试广泛应用于评估化学品的水生态环境安全,而鱼类作为水生生态环境体系中的顶级脊椎动物,具有不可替代的地位,其生态毒性数据为水生生态风险评估与风险管理提供基础,具有重要的作用和意义[1-4]㊂随着替代(replacement)㊁减少(reduction)㊁优化(refinement)(3Rs)原则[5]在哺乳动物毒性测试中的广泛认可,近年来,该理念在环境毒理学领域的延伸也逐渐被关注[6]㊂欧盟分别于2009年和2013年,禁止用化妆品原料进行脊椎动物试验以及禁止销售用动物试验检测的化妆品原料及成品㊂此外,欧洲‘化学品的注册㊁评估㊁授权和限制“(REACH)法规也高度关注化学品毒性测试中实验动物福利问题,提倡减少测试中脊椎动物的数量,推动非动物测试(如胚胎㊁细胞和组织等)和替代策略的开发和验证[7]㊂目前,国际上首选鱼类急性毒性试验的替代方法,在2012年完成验证[8-9],于2013年由国际经济合作与发展组织(OECD)颁布,鱼类胚胎急性毒性试验(Test No.236:Fish embryo acute toxic-ity(FET)test,简称OECD236)[10]方法中指定的实验生物为斑马鱼(Danio rerio)受精卵㊂采用胚胎进行毒性试验除了可满足现行动物福利法规的要求,还存在以下几个优势㊂(1)亲鱼体型小,易于饲养㊁管理方便㊂(2)产卵量大㊂通常情况下亲鱼每次可产卵几百枚至上千枚不等,对于单个试验而言,同一来源的大批量受精卵可满足统计学意义上的各类分析㊂(3)试验体系小㊂整个试验可在24孔细胞板中完成,节约了空间和成本的同时,还减少了样品的用量和废液的排放㊂(4)测试周期短,试验周期为96h㊂从受精卵开始,通过卵黄囊吸收营养,胚胎可在24孔细胞板中存活多天,完全可以满足试验需求㊂且与传统鱼类急性毒性试验一致,结果具有一定可比性㊂(5)斑马鱼胚胎具有光学透明性[11],可通过显微镜观察各发育阶段的形态特征,定期观察各种效应指标(致死或致畸),为毒理学研究提供依据㊂(6)运用一定的标记技术,可透过细胞膜,准确地观察某个基因在组织器官或个体中的表达㊂鱼类胚胎急性毒性试验在技术上操作方便,试验结果稳定性及重复性较高[12]㊂与传统的成鱼或幼鱼的急慢性试验相比,更为灵敏且能提供更多的观察效应指标㊂不仅可用于研究化学品的环境毒性,还可用于对污水㊁废水的监测和控制㊂在德国,斑马鱼胚胎已经作为水质监测的标准实验材料,取代了用成鱼进行的毒理学研究[13-14]㊂由于胚胎期对外源化学物质相对敏感,研究也表明,鱼类胚胎急性毒性数据与鱼类急性毒性数据之间有着高度相关性[15]㊂因此,很多欧美国家已逐渐避免使用成鱼或幼鱼作为毒性研究材料,越来越多改用胚胎试验获取毒性数据㊂目前全球大部分生态毒性测试,从方法到试验物种,都是在欧美国家的应用研究基础上提出来的,对保护我国生态环境安全没有针对性㊂就鱼类胚胎急性毒性试验而言,OECD236中指定的试验物种为斑马鱼(Danio rerio)受精卵,并没有涉及其他鱼种㊂然而生态环境保护是具有区域特异性的,研究化学品对特定区域环境的毒性效应需要有符合我国环境保护特点的试验物种进行测试㊂稀有鮈鲫(Go-biocypris rarus)是我国特有的一种小型鲤科鱼类[16],我国‘化学品测试方法“已将稀有鮈鲫列为推荐受试鱼种之一[17-19]㊂其亲鱼性成熟时间短,繁殖季节长,产卵量大,可常年人工繁殖,因此具有成为中国特有模式鱼种的潜能㊂由于其胚胎也具有光学透明性,可透过卵膜清晰观察胚胎发育,同时其胚胎的形态特征㊁发育过程及孵化时间也与多数淡水硬骨鱼类似[20]㊂因此,以稀有鮈鲫为实验材料,开展相关的胚胎毒理学研究有一定的基础依据㊂此外,稀有鮈鲫生物学特征研究已较为系统,研究工作涉及鱼病学㊁. All Rights Reserved.104㊀生态毒理学报第16卷遗传学㊁环境科学㊁胚胎学和生理学等领域[21-24]㊂在此基础上,开展稀有鮈鲫在胚胎领域的毒理学研究将推动我国特有标准试验鱼种用于生态毒性测试的可持续战略,拓展稀有鮈鲫在毒性测试中的使用范围,为其最终成为国际公认的标准试验物种创造条件㊂无论是科学研究㊁环境监测还是毒性检测,实验动物的质量是实验数据可重复性(repeatability)㊁再现性(reproducibility)和敏感性(sensibility)的基石㊂研究表明,稀有鮈鲫在鱼类胚胎急性毒性试验中的结果重复性良好[25],需评估稀有鮈鲫在鱼类胚胎急性毒性试验中的敏感性㊂本研究选取16种不同种类的化学品开展稀有鮈鲫胚胎急性毒性试验,通过试验和已有文献资料相结合的方式,分别将稀有鮈鲫胚胎与斑马鱼胚胎,稀有鮈鲫胚胎与其成鱼进行比较,研究稀有鮈鲫胚胎的敏感性和可比性㊂1㊀材料与方法(Materials and methods)1.1㊀材料1.1.1㊀实验动物本研究中所使用的稀有鮈鲫亲鱼源自中国科学院水生生物研究所,为野生型封闭群(Ihb:IHB),或引种后自行繁育㊂为保证良好的受精率,选择实验室驯养条件下无肉眼可观察到感染或疾病㊁未经任何药物处理且已繁殖至少2次以上的稀有鮈鲫㊂鱼类驯养室内昼夜由定时器控制,提供12h(光)ʒ12h (暗)的循环光照;水温维持在(23ʃ2)ħ,每日投喂冷冻水蚯蚓(Limnodrilus hoffmeisteri)2次(早晚各1次)㊂试验用鱼卵以分组产卵方式获得,即将6尾性成熟的稀有鮈鲫(雌雄比为1ʒ2),于试验当天早晨置于交配盒中,为防止亲鱼捕食鱼卵,在交配盒中放入网架(孔径大小约为(2ʃ0.5)mm)㊂为能够获得足够数量的鱼卵,平行准备6组㊂待灯光转暗后1~2h,取出亲鱼,收集鱼卵㊂斑马鱼亲鱼来源于国家斑马鱼资源中心,为野生型AB系㊂实验室驯养条件下的斑马鱼无肉眼可观察的感染或疾病,且未经任何药物处理㊂试验所使用的亲鱼已繁殖至少2次以上,以保证有良好的受精率㊂鱼类驯养室内昼夜由定时器控制,提供12 h(光)ʒ12h(暗)的循环光照;水温维持在(23ʃ2)ħ,每日投喂冷冻水蚯蚓(Limnodrilus hoffmeisteri)2次(早晚各1次)㊂试验用鱼卵以分组产卵方式获得,即将6尾性成熟的斑马鱼(雌雄比为1ʒ2),于试验前一天晚上置于交配盒中,为防止亲鱼捕食鱼卵,在交配盒中放入网架(孔径大小约为(2ʃ0.5)mm)㊂为能够获得足够数量的鱼卵,平行准备6组㊂第2天待灯光转亮后1~2h,取出亲鱼,收集鱼卵㊂采用体视显微镜观察,选择受精且无明显不规则分裂(如不对称㊁囊泡形成)或破损的鱼卵进行试验㊂如果试验用鱼卵为n,则取总数为2n的鱼卵进行镜检,挑选出合格受精卵(x)备用,并计算其受精百分率(x/2nˑ100%)㊂1.1.2㊀受试化学品参考OECD斑马鱼胚胎急性毒性试验验证报告[9]和实验室已有数据,选取16种不同类别的化学品(表1)进行鱼类胚胎急性毒性试验㊂同时,进行其中14种化学品的鱼类急性毒性试验㊂1.1.3㊀试验用水试验用水为标准稀释水(表2),并在恒温储水箱中连续曝气至氧饱和,恒温(23ʃ2)ħ㊂水硬度为100~300mg㊃L-1(以CaCO3计),pH为6.5~8.5㊂1.1.4㊀仪器设备和试验容器体式显微镜(Lumar V12,Carl Zeiss,德国);药品稳定性试验箱(MT-750B,施都凯仪器设备有限公司,中国);多参数水质分析仪(WTW3430,Thermo Fisher,美国);电子分析天平(AL204,Mettler Toledo,瑞士);精密型照度仪(KIMO HQ210,法国);总有机碳分析仪(Multi N/C3100,耶拿公司,德国);微电脑总硬度浓度测定仪(HI96735,HANNA仪器公司,德国)㊂灭菌24孔标准带盖板;5L玻璃圆缸㊂1.2㊀鱼类胚胎急性毒性试验方法按照‘OECD化学品测试准则No.236鱼类胚胎急性毒性试验“[10]进行试验设计并制定试验方案,选用3,4-二氯苯胺(3,4-DCA)㊁五水硫酸铜(CSP)㊁2,3,6-三甲基苯酚(2,3,6-TMP)㊁二甲基亚砜(DMSO)㊁七水硫酸锌(ZSH)㊁三甘醇(TEG)㊁氯化钠(SC)㊁十二烷基硫酸钠(SDS)㊁重铬酸钾(PD)㊁甲基异噻唑啉酮(MIT)㊁二苯甲酮(BP)㊁二氯苯氧氯酚(TCS)㊁1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)㊁三唑酮(T)㊁多菌灵(C)和N-(4-氯苯基)-N -(3,4-二氯苯基)脲(三氯卡班,TCC)16种化学品分别进行稀有鮈鲫和斑马鱼胚胎急性毒性试验,评价稀有鮈鲫胚胎对化学品的敏感性㊂1.2.1㊀试验原理将新受精的鱼类胚胎暴露于不同浓度的样品水溶液中96h㊂期间每24h,观察并记录以下1~4个死亡表征:(1)卵凝结;(2)体节缺失;(3)尾部未分离;(4)无心跳㊂当暴露结束时,通过上述4个表征的阳性结果确定急性毒性,并计算半数致死浓度(LC50)值㊂. All Rights Reserved.第5期王绿平等:稀有鮈鲫作为鱼类胚胎急性毒性试验受试鱼种的敏感性研究105㊀表1㊀受试化学品基本信息Table1㊀The basic information of the test chemicals化学品名Chemical name分子式Molecular formulaCAS号CAS number纯度Purity批号Batch No生产商Manufacturer3,4-二氯苯胺(3,4-DCA)3,4-dichloroaniline(3,4-DCA)C6H5Cl295-76-1>98%FHJ01-AMNI TCI 五水硫酸铜(CSP)Copper sulfate pentahydrate(CSP)CuSO4㊃5H2O7758-99-899%C10000665Macklin 2,3,6-三甲基苯酚(2,3,6-TMP)2,3,6-trimethylphenol(2,3,6-TMP)C9H12O2416-94-6>98.0%N6BDM-IL TCI二甲基亚砜(DMSO)Dimethyl sulfoxide(DMSO)C2H6OS67-68-5ȡ99.5%BCBV2983Sigma-Aldrich 七水硫酸锌(ZSH)Zinc sulfate(ZSH)ZnSO4㊃7H2O7446-20-0ȡ99.5%BCBS9911Sigma-Aldrich 三甘醇(TEG)Triethylene glycol(TEG)C6H14O4112-27-699%STBG9386Sigma-Aldrich 氯化钠(SC)Sodium chloride(SC)NaCl7647-14-599.5%C10042430Macklin 十二烷基硫酸钠(SDS)Sodium dodecyl sulfate(SDS)C12H25SO4Na151-21-3ȡ98.5%SLBR9016V Sigma-Aldrich重铬酸钾(PD) Potassium dichromate(PD)K2Cr2O77778-50-9ȡ99.8%20140708国药集团化学试剂有限公司Sinopharm ChemicalReagent Co.LTD2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MIT) 2-methyl-4-isothiazolin-3-one(MIT)C4H5NOS2682-20-495%L6C0S119百灵威J&K Chemical二苯甲酮(BP)Benzophenone(BP)C6H5COC6H5119-61-9>99.0%5VW2J-RO TCI二氯苯氧氯酚(TCS)Triclosan(TCS)C12H7Cl3O23380-34-5>98.0%5SP7D-EQ TCI 1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)1,2-benzisothiazolin-3-one(BIT)C7H5NOS2634-33-5>98.0%EJQ4C-CC TCI 三唑酮(T)Triadimefon(T)C14H16ClN3O243121-43-398.0%5-HBN-152-1TRC(加拿大Canada)多菌灵(C)Carbendazim(C)C9H9N3O210605-21-798.0%LHA0R15百灵威J&K Chemical N-(4-氯苯基)-N -(3,4-二氯苯基)脲(三氯卡班,TCC)Triclocarban(TCC)C13H9Cl3N2O101-20-2>98.0%GF01-CCOJ TCI表2㊀标准稀释水的配制方法Table2㊀The preparation method of standard diluted water化学品名Chemical name分子式Molecular formula浓度/(g㊃L-1)Concentration/(g㊃L-1)贮备液a Stock solution a CaCl2㊃2H2O11.76贮备液b Stock solution b MgSO4㊃7H2O 4.93贮备液c Stock solution c KCl0.23贮备液d Stock solution d NaHCO3 2.59标准稀释水Standard diluted water 去离子水的电导率ɤ10⋈S㊃cm-1,将上述4种贮备液各25mL加以混合并用去离子水稀释至1L,使用前连续曝气24h以上待用The conductivity of deionized water isɤ10⋈S㊃cm-1.25mL of each stock solution were mixed and diluted to1L with deionized water,and continuously aerated for more than24h before use注:贮备液及标准稀释水均使用分析纯试剂和去离子水配制而成㊂Note:Both the stock solutions and standard diluted water were prepared with pure analytical reagent and deionized water. . All Rights Reserved.106㊀生态毒理学报第16卷1.2.2㊀试验条件试验用水为标准稀释水,并在储水箱中24h连续曝气;试验温度(26ʃ1)ħ;每天12h光照㊂暴露时间:96h㊂试验开始:最晚在16细胞期前暴露于试验溶液中㊂试验方式:更新式,更新频率为24h㊂试验溶液:在已预处理24h的24孔板中,每孔注入新鲜制备的试验溶液㊂1.2.3㊀试验操作母液制备:可溶化学品(CSP㊁DMSO㊁ZSH㊁TEG㊁SC㊁SDS㊁PD和MIT)均于试验当天,称取适量样品直接溶于一定体积的试验用水中配制成高浓度的样品母液,其中CSP和ZSH用去离子水配制㊂低水溶性化学品(3,4-DCA㊁2,3,6-TMP㊁BP㊁TCS㊁BIT㊁T 和C)于试验前3d,称取适量样品添加到一定体积的的试验用水中,避光连续磁力搅拌72h,经0.45μm硝酸纤维素膜过滤后配制成试验体系下的样品饱和溶液作为样品母液㊂难溶性化学品(TCC)用助溶剂DMSO配制系列浓度的样品母液㊂试验溶液制备:根据母液实测浓度,将适量的样品母液添加到试验用水中,配制成一定浓度的试验溶液㊂暴露浓度:根据文献数据和预试验结果,各化学品设置5或6个试验浓度组(表3),均以几何级数分布,浓度的间隔系数不超过2.2,同时,每组设1个空白对照组(试验用水),对于斑马鱼,另设置1个4mg㊃L-1的3,4-DCA阳性对照组,所有试验组均不设平行㊂胚胎分配:所有试验均在标准24孔板中完成,每孔1个受精卵㊂样品组各浓度20个/板;以试验用水为介质,在上述各板中另放入4个鱼卵作为板内质控;空白对照组24个/板;阳性对照组(3,4-DCA,4mg㊃L-1,斑马鱼适用)(图1)㊂观察与记录:按1.2.4描述的原则进行观察和记录㊂试验结束时,如板内质控死亡超过1个,则整板无效,该浓度组剔除㊂水质参数测定:在试验开始和结束时测定对照组和最高浓度样品组的硬度和电导率,试验期间每次更新前后测定空白对照组和最高浓度样品组的pH㊂在试验结束时,测定空白对照组和最高浓度样品存活胚胎组的溶解氧浓度㊂试验期间,每日测定1次温度,测定温度时,随机选取3个试验容器进行测定㊂1.2.4㊀死亡表征的观察和判定每个受试胚胎每24h观察以下几个终点:卵凝结㊁体节未形成㊁尾部未与卵黄囊分离㊁失去心跳,观察到上述表征之一即可判定死亡㊂此外,从48h开始,每日观察1次样品组和空白对照组的孵化数㊂表3㊀各化学品在鱼类胚胎急性毒性试验中的浓度设置Table3㊀Concentrations of each chemical in Fish Embryo Acute Toxicity(FET)test化学品Chemical稀有鮈鲫胚胎Gobiocypris rarus embryo斑马鱼胚胎Danio rerio embryo3,4-DCA/(mg㊃L-1)5㊁7㊁10㊁13㊁200.5㊁1㊁2㊁4㊁8*CSP/(mg㊃L-1)0.7㊁1㊁1.5㊁2.3㊁3.50.15㊁0.3㊁0.6㊁1.2㊁2.4*2,3,6-TMP/(mg㊃L-1)10㊁15㊁22㊁33㊁508㊁12㊁18㊁27㊁40.5*DMSO/(g㊃L-1)20㊁30㊁45㊁67㊁10010㊁17㊁28.9㊁49.13㊁83.521*ZSH/(mg㊃L-1)4㊁6㊁9㊁13.5㊁2093.6㊁148㊁222㊁333㊁500TEG/(g㊃L-1)15㊁24㊁39㊁63㊁10020㊁30㊁45㊁67.5㊁101.25*SC/(g㊃L-1)2㊁3.2㊁5.1㊁8.2㊁131㊁2㊁4㊁8㊁16*SDS/(mg㊃L-1)4㊁6.8㊁11.6㊁19.7㊁33.5 1.2㊁1.8㊁2.7㊁4㊁6PD/(mg㊃L-1)198㊁297㊁445㊁667㊁1000482㊁578㊁694㊁833㊁1000MIT/(mg㊃L-1)9.48㊁14.2㊁21.4㊁32㊁4814.2㊁21.4㊁32㊁48㊁72BP/(mg㊃L-1) 5.0㊁8.0㊁12㊁19㊁30 5.0㊁8.0㊁12㊁19㊁30TCS/(mg㊃L-1)0.0886㊁0.124㊁0.174㊁0.243㊁0.340㊁0.4760.0886㊁0.124㊁0.174㊁0.243㊁0.340BIT/(mg㊃L-1) 3.0㊁4.15㊁6.75㊁10.1㊁15.2 2.62㊁3.28㊁4.10㊁5.12㊁6.4㊁8.0T/(mg㊃L-1)14㊁18㊁24㊁31㊁4014㊁18㊁24㊁31㊁40C/(mg㊃L-1)0.370㊁0.555㊁0.833㊁1.25㊁1.87㊁2.800.370㊁0.555㊁0.833㊁1.25㊁1.87㊁2.80TCC/(mg㊃L-1)0.0709㊁0.130㊁0.230㊁0.414㊁0.7450.0443㊁0.0709㊁0.113㊁0.181㊁0.290㊁0.464注:*文献数据[12]㊂Note:*literature data[12].. All Rights Reserved.第5期王绿平等:稀有鮈鲫作为鱼类胚胎急性毒性试验受试鱼种的敏感性研究107㊀图1㊀鱼类胚胎急性毒性(FET )试验24孔板布局图注:1~5为5个试验浓度样品组;nC 为空白对照组(试验用水);iC 为板内质控(试验用水);pC 为阳性对照组(3,4-DCA ,4mg ㊃L -1,斑马鱼适用)㊂Fig.1㊀Layout of 24-well pate for Fish Embryo Acute Toxicity (FET)testNote:1~5represent five test concentration groups;nC represents blank control group (test water);iC represents quality control in test plate (test water);pC represents positive control group (3,4-DCA,4mg ㊃L -1,for Danio rerio ).1.2.5㊀试验有效性判断参照OECD TG 236,本试验有效性判断原则为:试验用胚胎总受精率ȡ70%;试验期间,试验容器中温度维持在(26ʃ1)ħ之间;试验结束时,空白对照组胚胎存活率ȡ90%,空白对照组胚胎孵化率ȡ80%,阳性对照组(3,4-DCA ,4mg ㊃L -1,斑马鱼适用)死亡率至少为30%,空白对照组和最高浓度样品组试验溶液的溶解氧含量ȡ80%空气饱和值㊂1.2.6㊀数据处理计算试验开始后24㊁48㊁72和96h 各试验组(各板)胚胎的累计死亡率,绘制浓度-死亡率曲线图㊂采用点估计法估算96h -LC 50值及95%置信限㊂分析用软件ToxCalc(v5.0.32)完成㊂1.3㊀鱼类急性毒性试验方法按照‘OECD 化学品测试准则No.203鱼类急性毒性试验“[12]进行试验设计并制定试验方案,选用CSP ㊁2,3,6-TMP ㊁DMSO ㊁ZSH ㊁TEG ㊁SC ㊁SDS ㊁MIT ㊁BP ㊁TCS ㊁BIT ㊁T ㊁C 和TCC 14种化学品进行鱼类急性毒性试验,评价稀有鮈鲫对化学品的敏感性㊂1.3.1㊀试验原理在规定条件下,将试验鱼暴露于不同浓度的样品水溶液中96h ㊂在24㊁48㊁72和96h 时分别记录试验鱼的死亡数,确定96h -LC 50㊂1.3.2㊀试验条件试验用水为标准稀释水,并在储水箱中24h 连续曝气;试验温度(23ʃ2)ħ;每天12h 光照㊂暴露时间96h ,试验方式为更新式,更新频率为24h ㊂1.3.3㊀试验操作母液制备:可溶化学品(CSP ㊁DMSO ㊁ZSH ㊁TEG ㊁SC ㊁SDS 和MIT)均于试验当天,称取适量样品直接溶于一定体积的试验用水中配制成高浓度的样品母液㊂低水溶性化学品(2,3,6-TMP ㊁BP ㊁TCS ㊁BIT ㊁T 和C)于试验前3d ,称取适量样品添加到一定体积的的试验用水中,避光连续磁力搅拌72h ,经0.45μm 硝酸纤维素膜过滤后配制成试验体系下的样品饱和溶液作为样品母液㊂难溶性化学品(TCC)用助溶剂DMSO 配制系列浓度的样品母液㊂试验溶液制备:根据母液实测浓度,将适量的样品母液添加到试验用水中,配制成一定浓度的试验溶液㊂暴露浓度:根据预试验结果,13种化学品设置5. All Rights Reserved.108㊀生态毒理学报第16卷或6个试验浓度组(表4),均以几何级数分布,浓度的间隔系数不超过2.2;化学品C设置1个试验浓度组进行限度试验,同时,每组设1个空白对照组(试验用水),对于使用助溶剂的样品,另设置1个助溶剂对照组,所有试验组均不设平行㊂试验鱼分配:所有试验均在盛有4L试验溶液的5L玻璃圆缸中完成,所有试验对照组和各浓度组均放入7尾鱼㊂试验开始前在驯化群随机选择10尾鱼进行体质量和总长的测定,并计算试验鱼的承载量㊂观察与记录:在试验开始后0㊁24㊁48㊁72和96h观察并记录各试验容器内试验鱼的死亡数和异常表征㊂水质参数测定:在试验开始前测定一次试验用水的硬度和总有机碳(TOC)㊂在试验开始㊁每一次更新前后及试验结束时,测定并记录所有试验溶液的pH值㊁溶解氧和温度㊂1.3.4㊀试验有效性判断参照OECD TG203,本试验有效性判断原则为:试验结束时,空白对照组试验鱼的死亡率ɤ10%,试验期间,试验容器中温度维持在(23ʃ2)ħ之间,溶解氧含量ȡ60%空气饱和值㊂1.3.5㊀数据处理计算试验开始后24㊁48㊁72和96h各试验组试验鱼的累计死亡率,绘制浓度-死亡率曲线图㊂采用点估计法估算96h-LC50值及95%置信限㊂分析用软件ToxCalc(v5.0.32)完成㊂2㊀结果与讨论(Results and discussion)2.1㊀化学品对2种鱼类胚胎急性毒性结果比较各次试验开始时胚胎受精率均超过70%,空白对照组存活率为100%,孵化率为91.7%~100%;斑马鱼试验中,阳性对照组(3,4-DCA,4mg㊃L-1)死亡率为95.0%~100%;样品组板内质控均无死亡发生㊂试验溶液温度维持在(26ʃ1)ħ之间,空白对照组和最高浓度样品组试验溶液的溶解氧含量均超过80%空气饱和值,根据1.2.5描述的原则,本试验有效㊂如表5所示,16种化学品对稀有鮈鲫胚胎和斑马鱼胚胎的96h-LC50值比较可知,稀有鮈鲫胚胎和斑马鱼胚胎对其中15种化学品的敏感性相近,其中TEG㊁PD㊁MIT和BIT等4种化学品,稀有鮈鲫胚胎的敏感性优于斑马鱼㊂ZSH对稀有鮈鲫胚胎的96h-LC50值为10.4mg㊃L-1,斑马鱼的为238mg㊃L-1,两者差异约22.9倍,可见稀有鮈鲫胚胎对ZSH异常表4㊀各化学品在鱼类急性毒性(FAT)试验中的浓度设置Table4㊀Concentrations of each chemical in FishAcute Toxicity(FAT)test化学品Chemical稀有鮈鲫成鱼Adult Gobiocypris rarus 3,4-DCA/(mg㊃L-1) 2.0㊁3.6㊁6.5㊁12㊁21*CSP/(mg㊃L-1)0.50㊁0.84㊁1.4㊁2.4㊁4.02,3,6-TMP/(mg㊃L-1)9.80㊁14.7㊁22㊁33㊁50DMSO/(g㊃L-1)20㊁30㊁45㊁67㊁100ZSH/(mg㊃L-1)10㊁20㊁39㊁76㊁150TEG/(g㊃L-1)30㊁45㊁67㊁100㊁150SC/(g㊃L-1)8.0㊁8.85㊁9.80㊁10.8㊁12SDS/(mg㊃L-1)5㊁6.2㊁7.7㊁9.5㊁12PD/(mg㊃L-1)50㊁85㊁145㊁250㊁425*MIT/(mg㊃L-1)8.19㊁10.2㊁12.8㊁16.0㊁20.0BP/(mg㊃L-1) 2.81㊁4.19㊁6.31㊁9.43㊁14.2㊁21.2TCS/(mg㊃L-1)0.184㊁0.239㊁0.311㊁0.404㊁0.525BIT/(mg㊃L-1) 2.62㊁3.28㊁4.10㊁5.12㊁6.40T/(mg㊃L-1)7.13㊁8.20㊁9.43㊁10.8㊁12.5㊁14.3C/(mg㊃L-1)100%饱和溶液100%saturated concentration TCC/(mg㊃L-1)0.046㊁0.065㊁0.091㊁0.128㊁0.179注:*文献数据[27]㊂Note:*literature data[27].表5㊀化学品对2种鱼类胚胎的96h半数致死浓度(96h-LC50)Table5㊀The median lethal concentration of chemicalsat96h(96h-LC50)to two kinds of fish embryos 化学品Chemical稀有鮈鲫胚胎Gobiocyprisrarus embryo斑马鱼胚胎Daniorerio embryo 3,4-DCA/(mg㊃L-1)12.8 2.7*CSP/(mg㊃L-1) 1.760.291*2,3,6-TMP/(mg㊃L-1)14.110.8*DMSO/(g㊃L-1)51.734.1*ZSH/(mg㊃L-1)10.4238TEG/(g㊃L-1)52.054.8*SC/(g㊃L-1)10.4 5.14*SDS/(mg㊃L-1)18.2 5.13PD/(mg㊃L-1)534815MIT/(mg㊃L-1)31.438.9BP/(mg㊃L-1)25.417.9TCS/(mg㊃L-1)0.2600.154BIT/(mg㊃L-1) 3.697.08T/(mg㊃L-1)23.222.7C/(mg㊃L-1) 1.280.904TCC/(mg㊃L-1)0.2950.0704注:*文献数据[12]㊂Note:*literature data[12].. All Rights Reserved.第5期王绿平等:稀有鮈鲫作为鱼类胚胎急性毒性试验受试鱼种的敏感性研究109㊀敏感㊂此外,3,4-DCA㊁CSP㊁2,3,6-TMP㊁DMSO㊁SC㊁SDS㊁BP㊁TCS㊁T㊁C和TCC等11种化学品,斑马鱼胚胎的敏感性略优于稀有鮈鲫胚胎,但毒性值差异在1.02倍~6.05倍之间,有很好的可比性㊂鉴于化学品理化性质的不同和生物物种间的差异,稀有鮈鲫胚胎的敏感性不亚于斑马鱼胚胎,适宜鱼类胚胎急性毒性试验的应用㊂2.2㊀化学品对稀有鮈鲫胚胎和成鱼急性毒性结果比较㊀㊀鱼类胚胎阶段作为鱼类全生命周期的最初期,通常其敏感性会优于或不亚于其他时期㊂如表6所示,16种化学品对稀有鮈鲫胚胎及其成鱼的96h-LC50值比较可知,稀有鮈鲫胚胎及其成鱼对其中15种化学品的敏感性相近,其中2,3,6-TMP㊁ZSH㊁TEG㊁TCS㊁BIT和C等6种化学品,稀有鮈鲫胚胎的敏感性优于稀有鮈鲫成鱼㊂对于3,4-DCA㊁CSP㊁DMSO㊁SC㊁SDS㊁PD㊁MIT㊁BP㊁T和TCC等10种化学品,稀有鮈鲫成鱼的敏感性略优于稀有鮈鲫胚胎,这可能是化学品试验溶液暴露条件的不同导致的[28],但毒性值差异在1.13倍~5.57倍之间,有很好的可比性㊂此外,通过分析软件SPSS Statistics17.0对稀有鮈鲫胚胎及其成鱼96h-LC50值进行相关性分析,得出两者具有较好的相关性(P=0.879)㊂由此可见,稀有鮈鲫胚胎与其成鱼相比,敏感性类似,具有成为成鱼急性毒性试验替代方法的应用潜力㊂Dang等[29]和Lammer等[30]的研究表明,部分化学品理化性质的差异会导致化学品对成鱼的敏感性优于胚胎,但胚胎和成鱼之间均具有较好的相关性,试验数据为鱼类胚胎急性毒性试验替代鱼类急性毒性试验提供了有力的科学支持,与本文结论一致㊂此外,关于胚胎急性毒性试验(FET)作为成鱼急性毒性试验(AFT)的替代测试,有研究通过985个斑马鱼胚胎试验和1531个成鱼试验,建立数学模型[15],借助FET数据预测AFT值,实现试验和非试验相结合,在尽可能减少动物试验的前提下,为化学品环境管理提供更多基础数据㊂研究将16种化学品的FET试验数据代入公式(log FET LC50=(0.989ˑlog AFT LC50)-0.195[15]),预测AFT值(表7)㊂结果可见,所有AFT预测值和试验值相比,差异均未超过一个数量级,表明2种数据间相互预测和使用具有一定的可操作性㊂如后续有更多数据累积,可通过相互关系,建立稀有鮈鲫特有的FET与AFT的推表6㊀化学品对稀有鮈鲫胚胎和成鱼的96h-LC50 Table6㊀The96h-LC50of chemicals to Gobiocypris rarus embryos and adult Gobiocypris rarus化学品Chemical胚胎Embryo成鱼Adult fish 3,4-DCA/(mg㊃L-1)12.8 6.52*CSP/(mg㊃L-1) 1.76 1.292,3,6-TMP/(mg㊃L-1)14.117.0DMSO/(g㊃L-1)51.724.5ZSH/(mg㊃L-1)10.437.5TEG/(g㊃L-1)52.065.2SC/(g㊃L-1)10.49.19SDS/(mg㊃L-1)18.28.81PD/(mg㊃L-1)534116*MIT/(mg㊃L-1)31.415.6BP/(mg㊃L-1)25.410.3TCS/(mg㊃L-1)0.2600.293BIT/(mg㊃L-1) 3.69 4.41T/(mg㊃L-1)23.29.48C/(mg㊃L-1) 1.28>6.51TCC/(mg㊃L-1)0.2950.053注:*文献数据[27]㊂Note:*literature data[27].表7㊀化学品对稀有鮈鲫的FET和成鱼急性毒性试验(AFT)与非试验结果Table7㊀The results of chemicals to Gobiocypris rarus in FET,adult fish acute toxicitytest(AFT)and non-test results化学品ChemicalFET LC50试验值TestedFET LC50AFT LC50预测值PredictedAFT LC50AFT LC50试验值TestedAFT LC50 3,4-DCA/(mg㊃L-1)12.820.4 6.59CSP/(mg㊃L-1) 1.76 2.79 1.292,3,6-TMP/(mg㊃L-1)14.122.917.0DMSO/(g㊃L-1)51.785.124.5ZSH/(mg㊃L-1)10.416.837.5TEG/(g㊃L-1)52.085.665.2SC/(g㊃L-1)10.416.89.19SDS/(mg㊃L-1)18.229.68.81PD/(mg㊃L-1)534902116MIT/(mg㊃L-1)31.451.415.6BP/(mg㊃L-1)25.441.510.3TCS/(mg㊃L-1)0.2600.4030.293BIT/(mg㊃L-1) 3.69 5.90 4.41T/(mg㊃L-1)23.237.89.48C/(mg㊃L-1) 1.28 2.02>100TCC/(mg㊃L-1)0.2950.4580.053. 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