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毒理学作业农药2,4-滴钠盐原药为白色粉末，水溶性，表1是其对SD大鼠的急性经口试验结果，请根据表中结果，给出该农药的90天亚慢性试验的试验方案，以及如何对保证实验质量予以控制。
表1 2，4-滴钠盐原药对SD大鼠急性毒性实验结果剂量设置高剂量为25%LD50，中剂量为12.5%, 低剂量为6.3%。
雌性LD50为584mg/kg，高剂量为146mg/kg,中剂量为73mg/kg,低剂量为37mg/kg；雄性为501mg/kg，高剂量为125mg/kg，63mg/kg,低剂量为31mg/kg。
根据GB15670《农药登记毒理学实验方法》的农药急性毒性分级标准，2，4-滴钠盐原药的LD50>500mg/kg，属于低度农药。
因此试验时选择SD大鼠的LD50为584mg/kg。
农药2,4-滴钠盐原药SD大鼠亚慢性毒性试验目的;研究喂饲农药2,4-滴钠盐原药对大鼠的亚慢性毒性。
方法：取初断乳 SD大鼠80只，雌雄各半按照体重随机分为4组。
将2,4-滴钠盐原药按146、73、37mg/kg mg/kg剂量分别拌入饲料内经口喂饲染毒90d。
观察：大鼠外观体征、体质量、进食情况等。
在实验中期和末期采血检测检测血液学。
试验末期检测血生化指标以及尿常规检查。
实验结束时处死实验动物，计算脏器指数，并对主要脏器进行病理组织学观察。
1 材料和方法1.1 受试物农药2,4-滴钠盐原药，白色粉末，水溶性，由某地某农药公司提供。
SPF级初断乳大鼠80只，雌雄各半，体质量50~100 g，由XXX实验动物研究所繁育场提供，动物合格证号为医动字第XX-XXXX号。
1.2 饲养与管理SPF 环境条件下，同组同性别两只一笼喂养，自由进食和饮水。
环境温度 21～25℃，相对湿度 40%～60%。
严格控制昼夜交替。
1.3实验方法试验前将雌、雄大鼠各半按体重随机分为3个剂量组和1个对照组，每组20只，将2,4-滴钠盐原药按146、73、37mg/kg mg/kg剂量分别均匀混入饲料中制成颗粒饲料辐照灭菌后分别供高、中、低剂量组动物食用，连续每日一次喂养90d；对照组给予不加受试物的正常饲料。
亚慢性毒性试验2.3.9.1 目的（1)检测消毒剂较长期染毒对实验动物的毒性作用及其靶器官，并确定其最大未观察到有害作用剂量。
（2)为慢性毒性和致癌试验的剂量设计提供依据。
2.3.9.2 实验动物一般用啮齿类动物，首选大鼠。
所用大鼠应为 4周～6 周龄者。
全部试验至少需用 80 只动物。
2.3.9.3 试验分组将实验动物随机分为4组(3个剂量组和1个对照组)，每组20只动物，雌雄各半。
选择受试物剂量时，高剂量组应出现明显的毒性反应，但不引起死亡，如果出现动物死亡应不超过 10%；中间剂量组应可观察到轻微的毒性效应；低剂量组应不引起任何毒性效应(属未观察到有害作用剂量)。
至于具体的剂量选择，可考虑高剂量为LD50的1/20~1/5，高、中、低3个剂量间的组距以3倍~5倍为宜，最低不小于2倍。
另以受试物溶剂代替受试物进行试验，作为阴性对照组。
2.3.9.4 操作程序（1）采用灌胃方式或将受试物掺入饲料经口染毒。
（2）灌胃法每天灌胃1次，每周称体重，并按体重调整受试物给予量。
如受试物掺入饲料时，应定期称饲料消耗量，计算消毒剂摄入量。
（3）试验期为3个月(90d)，末次染毒后24h检测各项观察指标，然后处死实验动物，做病理学检查。
2.3.9.5 观察指标观察指标，可因消毒剂毒理作用不同而异，一般至少包含以下方面。
（1）临床观察：观察动物中毒表现，每周称量体重1次，食物消耗量至少1次~2次。
（2)血液学检查：包括血红蛋白含量、红细胞数、白细胞及其分类计数、血小板数、网织红细胞数等。
（3)血液生物化学检查：例如天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、尿素氮、肌酐、血清总蛋白和白蛋白、总胆固醇、总胆红素等。
必要时，可根据所观察到的受试物毒性效应，或与受试物化学结构相似物质的毒性作用，选择其他一些生化指标。
（4)脏器重量：测量主要脏器(如肝、肾、肾上腺、睾丸等)的脏器重量和脏器系数。
（5)病理学检查：实验结束时，处死所有动物，进行系统解剖和肉眼观察，并将主要器官和组织（如心、肺、肝、肾、脾、脑、肾上腺、睾丸、卵巢、胃肠和系统解剖时发现的异常组织等）固定、保存。
第 1 题:亚慢性毒性试验中一般化验指标有（a ）。
A．血象、肝肾功能B．病理学检查C．灵敏指标的检查D．特异指标的检查E．特异基因的测试第2 题:接触化合物的途径不同，其毒性大小的顺序是（e ）。
A．静脉注射＞经呼吸道B．静脉注射＞腹腔注射C．腹腔注射＞经口D．经口＞经皮E．以上都是第3 题:目前常用的化学物质有（ e ）。
A．500 万种B．300 万种C．100 万种D．10 万种E．67 万种第 4 题:急性亚慢性慢性毒性试验分别选择动物年龄为（a ）。
A．初成年性刚成熟初断乳B．初断乳性刚成熟初成年C．初断乳初成年性刚成熟D．初成年初断乳性刚成熟E．性刚成熟初断乳初成年第5 题:急性经口染毒，为了准确地将受试物染入消化道中，多采用（a ）。
A．灌胃B．喂饲C．吞咽胶囊D．鼻饲E．饮水第6 题:最小有作用剂量是（ e ）。
A．一种化合物按一定方式与人接触出现了亚临床症状的最小剂量B．一种化合物按一定方式与人接触造成显微镜下可观察到的损伤的最小剂量C．一种化合物按一定方式与人接触引起免疫功能减低的最小剂量D．DNA 大段损伤的最小剂量E．一种化合物按一定时间内按一定方式与机体接触使某项指标开始出现异常变化的最低剂量第7 题:亚慢性毒性试验对动物的要求是（ b ）。
A．成年动物B．大鼠100g 左右小鼠15g 左右C．大、小鼠，狗，家兔均可用D．必须为啮齿类或非啮齿类动物E．仅使用单一性别第8 题:碱基转换的后果是出现（ e ）。
A．同义密码B．错义密码C．终止密码D．氨基酸改变E．以上都对第9 题:苯环上的一个氢被烷基取代，其毒性发生改变（a ）。
A．苯对造血功能主要是抑制作用，而甲苯为麻醉作用B．苯主要从呼吸道排泄，对呼吸系统有毒性作用，而甲苯没有C．苯中毒产生过量的儿茶酚胺刺激心肌细胞发生心室颤动，而甲苯没有D．甲苯的肝脏中氧化，对肝有损害作用，而甲苯没有E．苯为致癌物，甲苯为工业毒物第10 题:化学结构与毒效应（d ）。
毒理学作业农药2,4-滴钠盐原药为白色粉末，水溶性，表1是其对SD大鼠的急性经口试验结果，请根据表中结果，给出该农药的90天亚慢性试验的试验方案，以及如何对保证实验质量予以控制。
表1 2，4-滴钠盐原药对SD大鼠急性毒性实验结果剂量设置高剂量为25%LD50，中剂量为12.5%, 低剂量为6.3%。
雌性LD50为584mg/kg，高剂量为146mg/kg,中剂量为73mg/kg,低剂量为37mg/kg；雄性为501mg/kg，高剂量为125mg/kg，63mg/kg,低剂量为31mg/kg。
根据GB15670《农药登记毒理学实验方法》的农药急性毒性分级标准，2，4-滴钠盐原药的LD50>500mg/kg，属于低度农药。
因此试验时选择SD大鼠的LD50为584mg/kg。
农药2,4-滴钠盐原药SD大鼠亚慢性毒性试验目的;研究喂饲农药2,4-滴钠盐原药对大鼠的亚慢性毒性。
方法：取初断乳SD大鼠80只，雌雄各半按照体重随机分为4组。
将2,4-滴钠盐原药按146、73、37mg/kg mg/kg剂量分别拌入饲料经口喂饲染毒90d。
观察：大鼠外观体征、体质量、进食情况等。
在实验中期和末期采血检测检测血液学。
试验末期检测血生化指标以及尿常规检查。
实验结束时处死实验动物，计算脏器指数，并对主要脏器进行病理组织学观察。
1 材料和方法1.1 受试物农药2,4-滴钠盐原药，白色粉末，水溶性，由某地某农药公司提供。
SPF级初断乳大鼠80只，雌雄各半，体质量50~100 g，由XXX实验动物研究所繁育场提供，动物合格证号为医动字第XX-XXXX号。
1.2 饲养与管理SPF 环境条件下，同组同性别两只一笼喂养，自由进食和饮水。
环境温度21～25℃，相对湿度40%～60%。
严格控制昼夜交替。
1.3实验方法试验前将雌、雄大鼠各半按体重随机分为3个剂量组和1个对照组，每组20只，将2,4-滴钠盐原药按146、73、37mg/kg mg/kg剂量分别均匀混入饲料中制成颗粒饲料辐照灭菌后分别供高、中、低剂量组动物食用，连续每日一次喂养90d；对照组给予不加受试物的正常饲料。
1.4 观察指标1.4.1一般情况试验期间观察动物的一般情况包括外观体征和行为活动、粪便性状、食物摄入量及体重变化等。
1.4.2血常规在实验中期和末期按常规方法测定血液学指标1.4.3血液生化指标试验末期检测血液生化指标1.4.5尿常规检查尿常规测定颜色、pH值、比重(SG)、尿糖(GLU)、尿蛋白，将尿液离心，并对尿中沉淀物进行镜检。
1.4.6脏器病理解剖动物，取心、肝、脾、肺、肾、胃肠、肾上腺、胸腺、脑和卵巢、睾丸等脏器，观察大体变化并称重（胃肠除外），计算脏器指数[脏器质量/体重）×100%]。
将解剖取得的脏器福尔马林固定，常规制片，HE 染色，光学显微镜进行病理组织学检查。
1.5 统计学分析亚慢性毒性试验结果经正态性检验后，符合正态的指标采用SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析，否则经变换后分析。
２结果2.1 一般状况2.2 体重变化见表22.3 血常规检验结果见表32.4 血生化检测结果见表42.5 尿常规检查2.5 脏器指数见表52.6 病理组织学检查表2 2，4滴原药大鼠90 d亚慢性毒性试验体质量变化情况表3 2，4-滴钠盐原药大鼠90 d亚慢性毒性试验血液常规检验雄性试验前0 37 73 146雌性试验后0 37 73 146雄性试验后03773146表4 2，4-滴钠盐原药大鼠90 d亚慢性毒性试验血生化检测结果表5 脏器指数%3.讨论控制实验质量1 大鼠毒理学实验中实验技术因素的质量控制1. 1 动物临床观察指标的质量控制在药品临床前大鼠毒理学实验研究过程中, 其临床观察指标主要包括行为活动、体质量、增质量、饲料生物利用度等，而体质量、增质量、饲料生物利用度指标均为需要统计分析的客观指标。
因其贯穿于整个实验周期,数据的客观性与实验环境、给药过程中动物感受是否舒适、动物密度、动物健康状况等因素相关。
在动物临床指标统计分析前控制体系中, 实验环境应选择S P F级动物实验室;每笼2只;体质量在实验前应适应环境周期≥1周; 计算饲料摄入量每日应称质量, 每周给药完毕即计算大鼠的饲料生物利用度,比较分析各组动物饲料生物利用度的统计学意义; 分析产生差异的原因,讨论差异是否与动物自发性疾病( 如大鼠自发性糖尿病会引起大鼠饲料生物利用度明显增大) 有关, 同时应排除营养因素或给药途径对动物的损伤因素; 在动物行为活动指标观察中应在每日投药过程中重点观察大鼠投药部位是否发生充血、水肿、呕血,是否发生动物争斗外伤、皮毛稀疏竖散、粪便性状改变等变化,并及时处理与药物因素无关的改变,并详细记录,认真分析。
1. 2 血液学样本的质量控制大鼠慢性毒理学实验中血液学常规的检测项目主要有红细胞计数( R B C ) 、血红蛋白定量( H b ) 、白细胞计数及其分类计数( WB C+D C ) 、血小板计数( P T ) 、凝血时间( C T ) ; 血清生物化学检测项目主要有天门冬氨酸氨基转移酶( A S T ) 、丙氨酸氨基转移酶( A L T ) 、碱性磷酸酶( A L P ) 、总蛋白( T P ) 、清蛋白( A L B ) 、总胆固醇( T -C H O ) 、总胆红素( T - B I L ) 、空腹血糖( G L U ) 、尿素氮( B U N ) 、肌酐( C r ) 。
选择合适的血样采集法，不仅对动物损伤小、样本溶血率低、可重复采样等优势,而且使大鼠慢性毒理实验中分阶段检测药物对造血系统、生化系统的影响成为可能。
1. 3 动物病理组织标本分析前的质量控制组织病理学检查对于判断实验动物的毒性靶器官或靶组织具有重要意义。
在长期毒理学实验中有重要地位, 是评价药物毒性的重要依据。
组织病理学检查对判断动物的毒性靶器官或靶组织具有重要意义。
实践中使用的组织学检测前优质标本取材流程可以为: ①根据实验取材项目设计表格,需要取得脏器系数的器官或组织和其他器官或组织分别标示于一个完整的记录单元中; ②使用250 m L广口瓶贮存新鲜配制的10%甲醛溶液180 ～200 m L 备用; ③对拟取材的大鼠进行解剖分组顺序编号; ④大鼠麻醉状态下,股动脉放血致死→胸腔组织( 胸腺、心、肺) →腹腔组织( 胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、直肠、肝、脾、胰腺、肾上腺、肾、卵巢、子宫、膀胱、前列腺、睾丸、附睾) →颈、脑部组织( 甲状腺、脑、垂体、脊髓) 。
其中胸腺、胰腺、肾上腺、卵巢、甲状腺、垂体、脊髓等腺体组织或微小组织应使用擦镜纸或纱布非挤压式包裹置于3. 6% ～4. 0%甲醛。
这样使浸泡于甲醛溶液中的易混淆脏器在进行石蜡包埋时容易分辨,同时保证病理组织学检查中组织样本数目完整; 其他组织除大体观察有明显病灶的组织外,要求动物组织样本均取自该组织的代表区。
1. 4 动物实验中的给药途径不同而引起的取材质量控制因临床给药途径不同, 在大鼠慢性毒理实验项目中存在不同的给药方式, 主要给途径有主要给药途径有灌胃、直肠、舌下、腹腔注射、肌注射、皮肤涂抹等。
在毒理学研究中可能通过对直接接触药物部位的检测结果分析药物慢性刺激对直接刺激局部组织的影响,还可以分析药物吸收和给药技能合理与否。
2 影响大鼠毒理学实验结果的环境、动物福利、误差控制2. 1 毒理学实验中的环境控制在不同环境中进行动物实验的大鼠,对照组和药物组动物均不同程度地存在因环境所致的炎性细胞浸润或间质性肺炎等病理变化,这些变化与实验环境级别及日常消毒措施合理与否息息相关。
样本固定前的大体解剖观察处理与组织学检查结果具有直接关系,取样以肉眼能观察到病灶的肺叶和表面观察正常的肺叶各取一为原则,在同一个受试动物肺组织中不可单一地单纯选择大体观察异常的小叶或大体观察正常的小叶样本。
2. 2 毒理学实验中的动物福利控制动物在毒理学研究过程中，会产生紧、疼痛、呼吸困难、痉挛、颤抖、腹泻、孔道出血、瘫痪、休克, 甚至死亡的情况。
因此,它们在遇到恐惧或恶劣环境时,生理和心理都可能患病。
控制原则为实验人员投药过程时间宜短不宜长, 抓取动物轻拿轻放, 血清采样宜快不宜慢,尽量提供人为因素影响小的实验环境，要验研究人员具备爱护动物之心和熟练的动物实验技能并贯穿于整个实验周期。
2. 3 毒理学实验中的误差质量控制在大鼠慢性毒理学实验中系统误差主要与样本的随机性、实验操作的一致性、流程的恒定性有关。
①抽样误差: 一般情况下,慢性毒性实验中每个实验组应使用相等数量的雌、雄动物。
每组动物大鼠至少20只。
差异应不超过平均体质量的20%。
②系统误差。
包括下列两类情况。
实验技术熟练因素造成的误差: 在毒理学实验研究中,为了真实反映外来化合物的毒性,除了要统一各种实验条件外, 每日的给药时间应一致。
一是可比性强,二是为了避免错误而影响其他药理实验甚至临床用药。
因此, 应将实验人员的技术熟练因素以一定的模式贯穿于各实验组中,在整个给药期中给药人员每天应互换给药的组别,同时应保证给药时间的准确性和一致性；流程造成的误差控制: 系统误差可因分析方法、仪器校正错误、试剂纯度不够、检测者的感观、环境因素改变等因素造成;随机可能因动物实验过程中各种随机因素的共同作用等因素造成。
如实验过程的温度波动- 电压变化- 仪器故障- 操作技术差别等; 过失误差可因工作人员不负责任( 器皿不净、加样错误、计算错误) 而造成。
这些误差因素与实验结果判断有直接关系。
在药物安全性评价中,系统误差与动物是否接受了足够的药物及其在动物体的代时间相关。
比如空腹抽血与进食后抽血,对临床患者的T G 、C K 、C h o 、G L U等有明显影响。
因此每个实验期进行动物抽样时,就要求严格按照同等的禁食时间对大鼠禁食。
因此要特别注意各组实验大鼠采样的随机性与均一性。
