(完整word版)流式细胞术步骤.docx

流式细胞术样品制备技术流式细胞术对细胞的分析检测必须基于单细胞的基础上，这是流式细胞术的基本要求。

因此就必须把实体组织制备成单细胞悬液。

在应用FCM技术中，制备出合格的单分散细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。

它要求这种分散细胞方法既要使细胞成为单个细胞，又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。

流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤：①取材：取手术或活检组织必须具有代表性，如取手术肿瘤组织，必须取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜；一般在室温1个小时之内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存；②对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色；③按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储；④再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析；⑤检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。

第1节样本单细胞悬液的制备方法一新鲜实体组织样本的制备FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。

尽管标本制备已形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题。

在实体组织分散为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。

所以，在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响。

目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种。

（一）酶消化法1 作用原理：对实体组织分散的作用原理主要有3方面：①可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；②可以水解组织间的粘多糖等物质；③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。

酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。

常用的酶类试剂有：蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。

胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。

流式细胞术操作规程
《流式细胞术操作规程》
流式细胞术是一种用于研究细胞表型和功能的重要技术。

在进行流式细胞术时，操作规程的严谨性和标准化是非常重要的。

以下是流式细胞术操作规程的一般步骤：
1. 样品准备：首先，需要准备好待测的细胞样品。

这包括细胞的培养和收集，以及必要的处理和染色。

2. 仪器准备：在进行流式细胞术之前，需要确保流式细胞术仪器的正常运行。

这包括检查流式细胞仪和细胞分选仪的通电和冷却系统，以及其它相关设备的准备。

3. 校准仪器：在进行流式细胞术之前，需要对流式细胞仪进行校准，以确保其准确测量样品中细胞的特定参数。

4. 样品测量：将准备好的细胞样品加入流式细胞仪，并进行测量。

测量完毕后，需要对数据进行分析和记录。

5. 数据分析：对测量得到的数据进行分析，包括确定细胞的表型和功能，以及对其它相关参数进行分析和比较。

6. 结果解释：根据数据分析的结果，进行结果的解释和报道，并对相关实验现象进行讨论和总结。

在进行流式细胞术时，需要严格遵守操作规程，以确保实验结果的准确性和可靠性。

此外，对于一些特殊的实验操作，可能
还需要根据具体情况进行相应的调整和改进。

流式细胞术的操作规程是一个很重要的研究工具，它可以帮助研究人员进行高效、准确的实验，从而为科学研究和医学诊断提供更为可靠的数据和方法。

流式细胞术检测细胞周期的原理及技术流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

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流式细胞仪原理及操作步骤流式细胞仪（FCM）是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。

其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。

活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。

（一）原理活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。

（二）操作步骤制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法）↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb（5～50μl）的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1 ∶20（用DPBS稀释）灭活正常兔血清（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇↓ 4 ℃30min 用洗涤液洗涤2 次，每次加液2ml 左右1000rpm×5min↓加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入1ml 固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl 固定液）↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察（标本在试管中可保存5～7 天）（三）试剂和器材1. 各种特异性单克隆抗体。

2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。

3. 10％FCS RPMI1640, DPBS 、洗涤液、固定液（见附录）。

4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。

（四）注意事项1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10 倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。

流式细胞术实验方法PI 染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。

2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。

3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。

4、离心，弃上清液。

5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。

6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。

7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。

8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。

9、混匀，过300目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。

GFP PI染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。

2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。

3、加入2ml预冷PFA，PFA的浓度根据细胞的特点进行调节，4℃固定30min。

以下步骤同PI 染色操作步骤的（4-9）细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。

2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。

3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。

用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。

4、离心弃上清液。

5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。

6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。

细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤3、用PBA稀释的第一抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1、5-2h。

离心，弃上清。

4、 PBS 1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。

查看文章流式细胞仪-细胞凋亡检测Ⅰ2008-11-01 10:20一PI单染色法基本原理其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。

这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：1. 细胞核的改变：由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。

研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。

许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。

2. 光散射特性：凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。

在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。

在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。

此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。

细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。

但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。

因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。

根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。

也可用于活细胞的分类。

试剂与仪器l PBS溶液（配制方法见附录）；l PI染液：将PI溶于PBS（pH7.4）中，终浓度为100ug/ml。

用棕色瓶4℃避光保存。

l 70%乙醇l 400目筛网l 流式细胞仪实验步骤1. 收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500 ~ 1000 r/min离心5min，弃去培养液。

利用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡1.细胞按每孔4×105个的密度接种于60 mm细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理细胞。

(设置实验组和对照组，实验组依辛伐他汀浓度分为3组，2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L 辛伐他汀组正常对照组(NC组)：胰岛素终浓度0.058mg/LA组：辛伐他汀终浓度2μmol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L；B组：辛伐他汀终浓度5μmol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L；C组：辛伐他汀终浓度10μmol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L；于37℃，5%CO2培养箱中孵育48h）2.胰酶消化收集细胞，并用1 mL PBS缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML管中。

3.800 rpm离心5分钟，去除上清，加5 mL PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复两次，最后重悬细胞于0.5mL PBS中。

4.用低速振荡器边震动边加入5 mL预冷的70%乙醇，固定，4℃过夜。

5.次日将固定好的细胞以1000 rpm的转速离心5分钟，弃上清，加入4 mL PBS清洗一次，用0.4 mL PBS重悬细胞。

6.加入5 μL RNaseA（10 mg/ml）37℃消化1小时，加入终浓度50 mg/mL碘化丙啶（propidium iodide PI）4℃避光染色过夜（或者37℃避光染色1小时），在EPICS XL流式细胞仪上分析。

利用流式细胞抗体检测检测细胞膜表面蛋白的变化1.细胞按每孔4×105个的密度接种于60 mm细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理细胞。

2．胰酶消化收集细胞，并用1 mL PBS缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML管中。

3 . 800 rpm离心5分钟，去除上清，加5 mL PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复两次，最后重悬细胞于0.1mL PBS中，并转移到1.5 mL离心管中。

4. 按照1:100加入1UL一抗（如下图对应），置于垂直混合液上室温孵育1-2小时。

流式细胞术检测脾脏CD4+、CD8+
一、准备实验：
1640、PBS缓冲液、铜网、小平皿、剪刀、镊子、离心管、红细胞裂解液、枪头、抗体、细胞计数板、杀鸡用大剪刀、1ml注射器
二、实验操作步骤：
1、取一小块雏鸡脾脏，放入装有1ml 1640的1.5ml离心管中
2、铜网+平皿中加入1ml 1640
3、将脾放入铜网中，磨脾
4、吸取磨好的脾汁放入1.5ml离心管中，离心2000r,5min
5、弃去上清，向脾汁沉淀中加入500µl红细胞裂解液，混匀作
用3min,离心2000r 5min
6、若离心后得到沉淀不变白可重复上述操作
7、裂解完成，离心完成，弃去上清，向试管中加入1ml PBS混匀
8、向1.5ml离心管中加入490µLPBS，再加入10µL步骤7脾汁，
计数
9、取106个细胞加PBS定容至100µL，此处用1.5ml离心管
10、向细胞悬液内加入抗体，每只鸡两管细胞悬液，每管10µL
11、4℃避光保存45min
12、向细胞悬液中加入1mlPBS 2000r 5min
13、弃上清，向管中加入200µL PBS 上机。

临床检测项目操作流程1：淋巴细胞亚群测定2：HLA-B27测定3：CD55／CD59测定4：血小板抗体测定5：红细胞抗体测定6：粒细胞抗体测定7：白血病免疫分型测定8：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定9：XL操作步骤淋巴细胞亚群测定(CD系列)方法流式细胞仪(BD)原理：双/三色直接免疫荧光法。

荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数。

淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD5+，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK细胞：CD3-CDl6+56+等。

根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。

标本采集与处理受检者的准备：检查对象生活饮食处于日常状态，空腹静脉采血。

抗凝剂：EDTA或肝素抗凝血要求： 1．样本量至少1ml。

2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。

3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。

若>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。

4．溶血样本不能用。

试剂品牌规格贮存贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 1ML 2—8℃2：全血溶血试剂A：甲酸70ML 室温B：碳酸钠等32ML 室温C：多聚甲醛14ML 室温3：鞘液 20L 室温4：清洗液 5L 室温5：荧光微球 10ML 2-8℃质控品BD产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。

样本制备：1) 按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照2) 分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。

临床检测项目操作流程1：淋巴细胞亚群测定2：HLA-B27测定3：CD55／CD59测定4：血小板抗体测定5：红细胞抗体测定6：粒细胞抗体测定7：白血病免疫分型测定8：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定9：XL操作步骤淋巴细胞亚群测定(CD系列)方法流式细胞仪(BD)原理：双/三色直接免疫荧光法。

荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数。

淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD5+，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK细胞：CD3-CDl6+56+等。

根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。

标本采集与处理受检者的准备：检查对象生活饮食处于日常状态，空腹静脉采血。

抗凝剂：EDTA或肝素抗凝血要求： 1．样本量至少1ml。

2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。

3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。

若>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。

4．溶血样本不能用。

试剂品牌规格贮存贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 1ML 2—8℃2：全血溶血试剂A：甲酸70ML 室温B：碳酸钠等32ML 室温C：多聚甲醛14ML 室温3：鞘液 20L 室温4：清洗液 5L 室温5：荧光微球 10ML 2-8℃质控品BD产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。

样本制备：1) 按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照2) 分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。

流式细胞术检测脾脏CD4+、CD8+
一、准备实验：
1640、PBS缓冲液、铜网、小平皿、剪刀、镊子、离心管、红细胞裂解液、枪头、抗体、细胞计数板、杀鸡用大剪刀、1ml注射器
二、实验操作步骤：
1、取一小块雏鸡脾脏，放入装有1ml 1640的1.5ml离心管中
2、铜网+平皿中加入1ml 1640
3、将脾放入铜网中，磨脾
4、吸取磨好的脾汁放入1.5ml离心管中，离心2000r,5min
5、弃去上清，向脾汁沉淀中加入500µl红细胞裂解液，混匀作
用3min,离心2000r 5min
6、若离心后得到沉淀不变白可重复上述操作
7、裂解完成，离心完成，弃去上清，向试管中加入1ml PBS混匀
8、向1.5ml离心管中加入490µLPBS，再加入10µL步骤7脾汁，
计数
9、取106个细胞加PBS定容至100µL，此处用1.5ml离心管
10、向细胞悬液内加入抗体，每只鸡两管细胞悬液，每管10µL
11、4℃避光保存45min
12、向细胞悬液中加入1mlPBS 2000r 5min
13、弃上清，向管中加入200µL PBS 上机。

组织流式细胞术的基本步骤
组织流式细胞术的基本步骤：制备单细胞悬液、进行特异性染色以及上机分析。

具体来说，这些步骤包括：
制备单细胞悬液：首先需要将组织样本剪碎、消化，以制备成单细胞悬液。

特异性染色：将单细胞悬液与荧光标记或未标记的抗体进行孵育，以特异性地标记目标分子。

上机分析：最后，将标记后的细胞悬液上机，利用流式细胞仪进行定量分析。

在操作过程中，需要注意尽可能的制成单细胞悬液，减少细胞黏连，以确保实验的准确性和可靠性。

流式细胞术实验流程
流式细胞术实验流程：
一、准备实验样本：将患者的血液采集完毕，或者采集感染细胞，分离细胞，细胞培养，获得饱满的细胞。

二、细胞活化：将细胞加入活化剂，使细胞经历增殖、修复、活化，使细胞拥有良好的活性。

三、标记细胞：使用条件标记细胞，将抗体与特异性抗原结合，
以标记细胞标记物一定的细胞，以便采用流式细胞术识别处理。

四、流式细胞术：将标记后的细胞放入流式细胞术仪器的机体内，识别标记细胞的特性，分析细胞含量，并能在细胞图像上显示分析结果。

五、细胞存储：将分析后的细胞存入氮气管内，存放在低温处，
以便下次使用。