甲型肝炎病毒IgM抗体测定.ppt

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甲型肝炎汇报ppt课件

养成良好的卫生习惯，如勤洗手、不喝生水、不生食海鲜等。
饮食卫生
加强食品卫生监管，确保食品清洁安全，避免食用被甲肝病毒污染的食物。
疫苗接种
接种甲肝疫苗是预防甲型肝炎的有效手段，疫苗可提高人体免疫力，降低感染风险。
患者教育与心理支持
知识普及
向患者及家属普及甲型肝炎的相关知识，包括传播途径、症状表
分型
根据临床表现可分为轻型、中型和重型三种类型。轻型患者症状轻微，病程较短；中型患者症状较重，病程较长；重型患者症状严重，可出现肝衰竭等严重并发症。
02
诊断与鉴别诊断
诊断依据与方法
01
02
03
流行病学史
发病前2-6周内有不洁饮食史或与甲型肝炎患者密切接触史。
临床表现
急性起病，有畏寒、发热、食欲减退、恶心、疲乏等症状，部分患者有肝大、肝区疼痛等体征。
实验室检查
血清抗-HAV IgM阳性，或抗-HAV IgG急性期阴性、恢复期阳性，且滴度升高4倍以上。
鉴别诊断相关疾病
乙型肝炎
与甲型肝炎相似，但乙型肝炎病程较长，多呈慢性经过，且常有肝外表现。
丙型肝炎
药物性肝炎
有明确的服药史，停药后肝功能可逐渐恢复。
主要通过血液传播，临床表现较轻，易漏诊。
易感人群
人群普遍易感，但儿童、青少年及免疫力低下者更易感染。感染后可获得持久免疫力，再次感染少见。
临床表现及分型
临床表现
潜伏期一般为2～6周，平均4周。临床上分为急性黄疸型和无黄疸型两种类型。急性黄疸型患者起病较急，有发热、乏力、食欲减退、恶心、呕吐等症状，随后出现黄疸、肝肿大及肝功能异常等表现。无黄疸型患者症状较轻，仅表现为轻度乏力、食欲减退等，无黄疸表现。

肝炎病毒抗原抗体检测的PPT课件

21.09.2020
9
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 竞争法测抗体
1.其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。
2.标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。
3. 抗HBc.抗 Hbe: ELISA一般采用此法。
21.09.2020
10
试剂盒选择
◎卫生部规定乙肝试剂，丙肝试剂，艾滋病试剂，梅毒试剂及血型试剂必须使用经卫生部生物制品检定所检定合格，并贴有防伪标签的产品，试剂应从灵敏度，特异性，精密度，稳定性，简便性，安全性及经济性作出全面的评价。 ◎灵敏度：
1）为试剂检出被检物质的最低量的能力； 2）为试剂对人群或大量样品中阳性检出的能力（假阴性
越少越好），取决于包被物的全面性。 3) 每一批新试剂应作实验对照
21.09.2020
11
血液检测HBsAg ELISA阳性结果确证分析中华医学实践杂志 > 2004年第3卷第5期 >
1.以卫生部临床检验中心的1ng/ml HBsAg质控血清，用正常血清稀释随标本检测，国产试剂检测灵敏度为0.5ng/ml，进口试剂为0.10ng/ml。
3.其中进口试剂S/CO值分布以>3为大多数，占91.7%，表明进口试剂灵敏度高，不易漏检。国产试剂S/CO值分布以1～10之间为多数占65.5%，而 1～0.7区间有11例，占9%，表明试剂灵敏度欠佳。
21.09.2020
4
两对半与美国Abbott试剂的比较
1.本次试验Abbott Axsym系统检测标本中HBsAg结果最高至210 S/CO，HBsAb结果最高至6000 mIU/mL，HBeAg最高至11600 PEIU/mL，以Abbott 试剂测定标本的S/CO值为横坐标，五家试剂测定相应标本的OD值为纵坐标，分别绘出了HBsAg、 HBsAb及HBeAg的浓度关系图，故在实际应用中的许多一步法试剂仍有HOOK效应存在。对于 HBsAg,A、C、D三家试剂存在HOOK效应；对于 HBsAb,A试剂存在HOOK效应；对于HBeAg，D试剂存在HOOK效应。此结果可供临床检验部门参考。

甲肝抗体IGM的检测课件

ELISA类型
夹心法间接法测抗体竞争法捕获法
捕获法测IgM抗体
血清中针对某些抗原的特异性 IgM 常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM 抗体的测定。因此测定 IgM 抗体多用捕获法
➢ 包被抗体：用抗人μ链抗体包被固相载体上,形成固相抗人μ链;
➢ 加入病人的血清标本; ➢ 加入特异性抗原试剂;， ➢ 加入针对特异性抗原的酶标抗体， ➢ 加底物显色．
抗HAV总抗体抗HAV-IgM
临床意义
• 血清中抗HAVIgM出现于感染的早期(发病后数日)抗体的效价很快升到峰值并持续较长时间(2-4周),经1-2个月后抗体的效价和阳性率明显不降,于3个月后消失.因此抗HAVIgM阳性,尤其是效价较高时,表明处于感染的早期,被公认为早期诊断甲肝的依据,是区别是急性感染还是慢性感染的有力佐证。
甲型肝炎病毒IgM抗体的测定 (捕获法)
黄艳
酶联免疫吸附试验（ELISA法）
将抗体(抗原)包被在固相表面后，按不同的步骤加入待测抗原(抗体)和酶标抗体(抗原)，充分反应后用洗涤的方法，使固相上形成的抗原抗体复合物与其他物质分离，洗去游离的酶标抗体(抗原)，最后加入底物，根据酶对底物催化的显色反应程度，而对标本中的抗原(抗体)进行定性或定量。
操作步骤
1．将微孔条固定在支架上，按顺序编号。 2．分别将待测标本，阴、阳性对照100μl（2滴）加入相应的孔中，设空白对照孔。置37℃20分钟。 3．洗涤：甩去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置5秒，共三次，每次洗后均需扣干。 4．每孔加HA·Ag50μl，酶结合物50μl（空白对照除外），振荡混匀，置37℃20分钟。 5．洗涤：重复上述3 6．显色：每孔加显色剂A液50μl，再加显色剂B液50μl，振荡混匀，置37℃15分钟。 7.每孔加终止液50μl

甲型肝炎病毒IgM抗体操作步骤

甲型肝炎病毒IgM抗体操作步骤1．检验目的：检测人血清或血浆中的抗HA V-IgM。

2．检测原理：本品系用抗人-IgM（u链）包被的微孔板，配以纯甲型肝炎抗原（HA V-Ag）和酶标记的甲型肝炎病毒抗体（抗HA V-HRP）及其它试剂，采用捕获法原理，检测人血清或血浆中的抗-HA V-IgM。

34．操作：4.1 配液：浓缩洗涤液配制前充分摇匀（如有结晶析出应充分溶解）浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按1：19稀释后使用。

4.2 编号：将微孔条固定于支架，按序编号。

4.3 加样：待测样本用生理盐水作1：1000稀释，每个样本检测孔加入稀释样本100 uL。

设阴阳对照各1孔，每孔加入100 uL，并设空白对照1孔。

4.4 温育：置37℃温育20分钟，室温平衡2分钟。

4.5 洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完后扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）。

4.6 加抗原、酶：每孔加入抗原（HA V-Ag）30 uL、酶标记抗体50uL（1滴），充分混匀。

4.7 温育：置37℃温育20分钟。

4.8 洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完后扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）。

4.9 显色：每孔加底物A、B各50uL，轻拍混匀，置37℃暗置15分钟。

4.10 终止：每孔加终止液50uL，混匀。

4.11 测定：用酶标仪单波长450nm/630nm测定各孔OD值（用单波长测定需设定空白对照一孔，30分钟完成测定，并记录结果）。

5. 结果判定：5.1 临界值（C.O.）的计算：临界值=阴性对照孔OD均值N×2.1阴性对照OD值低于0.050←0.050计算，高于0.050按实际OD值计算。

5.2结果判定：样品OD值S/C.O.≥1者为HA V-IgM阳性样品OD值S/C.O.＜1者为HA V-IgM阴性5.3 失效：如果阳性对照OD均值小于0.05，则表明不正常的操作或试剂盒已变质损坏。

在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试剂盒重新测试。

甲型病毒性肝炎演示课件

与甲肝症状相似，但病原体不同，通过检测特异性抗体和病
毒RNA进行鉴别。
药物性肝损害
某些药物可引起肝损害，表现为肝功能异常，需详细询问用药史，结合实验室检查进行鉴别。
酒精性肝病
长期大量饮酒可导致肝功能异常，结合饮酒史、肝功能检查和影像学检查进行鉴别。
自身免疫性肝病
可出现肝功能异常和自身抗体阳性，需检测相关自身抗体并
症状较轻，主要为全身乏力、食欲减退、恶心、呕吐、腹胀等症状。肝肿大、质较软，有压痛和叩痛。此型肝炎症状轻常被忽视诊断。病程长短不一，部分患者迁延不愈，反复发作，可发展为慢性肝炎和重型肝炎。
临床表现及分型
• 瘀胆型：旧称毛细胆管性肝炎，现证明其原发病变在肝细胞泌胆机制而不在毛细胆管，故原称病名已不用。主要是急性甲型肝炎引起的肝细胞裂解导致胆汁分泌下降，血液中胆红素水平上升和胆酸浓度增加，引起黄疸和全身皮肤瘙痒。起病类似急性黄疸型肝炎，但消化道症状较轻。该病病程较长，黄疸至少持续3～6个月。本型为黄疸型的一种特殊表现，临床特点是胃肠道症状较轻，发热时间较长，肝内梗阻性黄疸持续较久（数周至数月），可有腹胀、皮肤瘙痒、一过性大便颜色变浅，尿色深呈浓茶色，肝肿大、有压痛。需与其他肝内、外梗阻性黄疸鉴别。
免疫调节治疗
通过调节患者免疫系统功能，增强机体抗病毒能力，已成为甲肝治疗的新方向。例如，采用免疫调节剂、细胞因子等治疗手段，可改善患者免疫功能，降低病毒载量。
肝移植治疗
对于严重肝功能衰竭的患者，肝移植是一种有效的治疗手段。随着移植技术的不断发展和完善，肝移植在甲肝治疗中的应用前景广阔。
未来发展趋势预测
流行病学特点
地区分布
全球范围内均有分布，但在发展中国家尤为常见。

甲型肝炎 PPT课件

ppt课件
4
直径27－28nm，无包膜，球形，32个壳粒组成的20面体
ppt课件
5

单股正链RNA，7500个核苷酸，不同 HAV毒株具有相同的序列，可用此区的核苷酸序列作探针，进行核酸杂交，或用RT-PCR检测标本中的HAV 迄今为止，世界各地HAV一个血清型。抗体: 抗HAV-IgM，起病后3～6个月之内，近期感染的标志；抗HAV-IgG，可保存多年，既往感染的标志
ppt课件
26
慢加急性（亚急性）肝衰竭
（acute-on-chronic liver failure, ACLF）
在慢性肝病基础上出现的急性肝功能失代偿
慢性肝衰竭（chronic liver failure, CLF）
在肝硬化基础上，肝功能进行性减退导致的以腹水或门脉高压、凝血功能障碍和肝性脑病等为主要表现的慢性肝功能失代偿
ppt课件
46
肝衰竭：综合支持疗法
热卡:1800-2200佧/天，液体 1200ml---2000ml左右注意电解质酸碱平衡补充蛋白及血浆 NH3中毒抗生素

ppt课件 47
预防和治疗出血胃粘膜保护药输凝血酶原复合物鲜血浆，鲜血，纤维蛋白原等促进肝细胞增生的药物防治肾功能不全：多巴胺、前列腺素E1等
高，患者多因脑水肿、脑疝、消化道出血、肝肾功能衰竭等死亡，
病程不超过3周。
ppt课件
25
亚急性肝衰竭（subacute liver failure, SALF）:
又称亚急性肝坏死
起病较急，发病15d～26周内出现肝衰竭症候群
脑病型: 首先出现Ⅱ度以上肝性脑病者
腹水型: 首先出现腹水及相关症候者晚期可有难治性并发症: 脑水肿，消化道大出血，严重感染，电解质紊乱及酸碱平衡失调，肝肾综合征

病毒性肝炎血清学检测的基础与实践PPT课件

HBsAg 抗- HBeAg 抗- 抗-
HBs
HBe HBc
临床意义
+
-
+
-
+
感染、传染性强
+
-
-
+
+
感染、有传染性
+
-
-
+
-
感染、有传染性
+
-
-
-
+
感染、有传染性
+
-
+
-
-
感染、传染性强
+
+ +/- +/- +/- 感染、有传染性、病毒
可能变异
+
-
-
-
- 感染潜伏期、有传染性
+
-
-
-
- 接种疫苗后、无传染性
Fab段
CH1
CL s-s
s-s
s-s
CH2 s-s
CH3 Fc段
CDR1 CDR2 CDR3
Fab段
IgM是五聚体，与抗原具有5或10价结合力。
Fab：fragment antigen-binding CDR：complementarity determining region
抗体产生过程简图
间接ELISA检测抗体
HBV双层壳膜结构，外层是HBsAg，内层是HBcAg
HBV基因与基因产物
pre-S1 pre-S1
pre-S2 pre-S2
ORF S
HBsAg
HBcAg ORF C HBeAg pre-C
- + 5’ 5’
ORF X HBxAg

教学查房甲肝PPT课件

黄疸期患者皮肤、巩膜黄染在发病后10天自觉症状加重。患者病程中未出现肝区痛，肝脏肿大，无压痛和叩痛，未出现脾肿大。出现肝功能明显异常。会持续2～6 周，此患者至今3周多。
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六、实验室检查
1血尿常规：外周血常规白细胞计数一般减少或在正常范围，可伴有轻度淋巴细胞或单核细胞比例增高，病程早期尿中尿胆原增加，黄疸期尿胆红素及尿胆原均增加。肝功能检查以血清ALT、AST、总胆红素水平检测最为有用，有研究显示甲型肝炎患者的 ALT平均峰值可达1952IU/L,AST可达1442IU/L,多数
及炝虾等水产品被彻底纳入“禁食”行列。
4
定义
甲型病毒性肝炎，简称甲型肝炎、甲肝，是由甲型肝炎病毒（HAV）引起的，以肝脏炎症病变为主的传染病，主要通过粪-口途径传播，临床上以疲乏，食欲减退，肝肿大，肝功能异常为主要表现，部分病例出现黄疸，主要表现为急性肝炎，无症状感染者常见。任何年龄均可患本病，但主要为儿童和青少年。成人甲肝的临床症状一般较儿童为重。冬春季节常是甲肝发病的高峰期。本病病程呈自限性，无慢性化，引起急性重型肝炎者极为少见，随着灭活疫苗在全世界的使用，甲型肝炎的流行已得到有效的控制。此次教学查房
性感染。 1.急性黄疸型（1）潜伏期甲型肝炎潜伏期为15～45日，平均持续30天。患者在此期常无自觉症状，但在潜伏期后期，大约感染25天以后，粪便中有大量的HAV排出，潜伏期的患者的传染性最强。（2）黄疸前期起病急，急数患者有发热畏寒，体温在38～39℃之间。平均热程3日，少数达5日，全身乏力、食欲不振、厌油、恶心、呕吐、上腹部饱胀感或轻度腹泻。少数患者以上呼吸道感染症状为主要表现，尿色逐渐加深呈浓茶色。本期持续5～7日。（3）黄疸期自觉症状好转，热退后黄疸出现，可见巩膜、皮肤不同程度黄染，肝区痛，肝脏肿大，有压痛和叩痛，部分患者有脾肿大。本期可有短期大便颜色变浅，皮肤瘙痒。肝功能明显异常。持续2～6周。（4）恢复期黄疸逐渐消退，症状好转以至消失，肝脾回缩到正常，肝功能逐渐恢复正常，IgG介导的免疫系统建立。本期持续2周至4月，平均1个月。

医学检验·检查项目：甲型肝炎抗体检测(抗-HAV)_课件模板

正常值：抗-HAIgM阴性。
医学检验·各论：甲型肝炎抗体检测（抗-HAV） >>>
相关检查：抗肝细胞膜抗原抗体(ALMA)、纤溶酶、精氨酰琥珀酸裂解酶、甲型肝炎抗体、抗甲型肝炎病毒IgA抗体。
医学检验·各论：甲型肝炎抗体检测（抗-HAV） >>>
相关症状：肢端接连出现苍白、发组和潮红反应、肝肿大、恶心与呕吐、食欲异常、消瘦。
医学检验·各论甲型肝炎抗体检测（抗-
ห้องสมุดไป่ตู้HAV）内容课件模板
医学检验·各论：甲型肝炎抗体检测（抗-HAV） >>>
别名：甲型肝炎抗体。
医学检验·各论：甲型肝炎抗体检测（抗-HAV） >>>
简介：甲型肝炎由甲型肝炎病毒（HAV）所
引起。血清中抗体（抗-HA）分为两种，即抗-HAIgM和抗-HAIgG。
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相关疾病：
肝炎后综合征、肝炎双重感染、丙型病毒性肝炎、戊型病毒性肝炎、新生儿肝炎、甲型肝炎、乙型病毒性肝炎、庚型病毒性肝炎、病毒性肝炎。
谢谢！
医学检验·各论：甲型肝炎抗体检测（抗-HAV） >>>
临床意义：
抗-HAIgM阳性可诊断为甲型肝炎，若检得低滴度时，应隔2周复测，但应注意风湿因子所致假阳性。抗-HAIgG阳性提示曾受过HAV感染，但双份抗-HAIgG滴度4倍以上增长，也有诊断意义。
医学检验·各论：甲型肝炎抗体检测（抗-HAV） >>>

甲型肝炎医学PPT课件

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四. 甲型肝炎易感染人群
我国是甲型肝炎的高发地区，甲型肝炎病毒感染率很高。那么哪些人群易感染甲型肝炎呢？这是人们比较关心的一个问题，肝病专家说凡是未感染过甲型肝炎病毒的人和没有接种史的人群，无论是儿童还是成人均是易感者。
15
甲型肝炎病毒感染者，会出现一系列症状体征，同时体内会产生抗甲型肝炎病毒的抗体，这种抗体可以持续存在多年，是人获得了较持久的免疫力，凡是体内有相当水平抗体的正常人，对甲型肝炎病毒的侵袭就有抵抗力。
一. 甲型肝炎病原学
1.形态结构与分子生物学
小RNA病毒科嗜肝病毒属
直径27～32nm
无包膜，球形，由32个壳粒组成
20面体对称球形颗粒
内含单股正链RNA，7500个左右
核苷酸
1
负染后镜下可见病毒有实心和空心颗粒两种形态，实心者为完整病毒，具有传染性；空心者则无传染性，但具有抗原性。
病毒表面有32个亚单位结构（称壳粒），每个亚单位具有4个多肽，分别为病毒蛋白VP1、VP2、VP3和VP 4，其中VP1基因主要为病毒核壳蛋白基因，含有产生中和抗体的抗原决定。 2
9
主要通过患者粪便污染的手、用具、餐具、玩具、衣服等，直接或间接经口传播，如在托儿所、幼儿园、学校和军队中的发病。
3、经食品传播：主要是食用了被污
染的食物引起，特别是未经蒸煮就生
吃的瓜果与蔬菜，或煮的半生半熟的
贝壳类海产品如牡蛎、蚬子、哈蜊和
毛蚶等。
10
4、苍蝇和蟑螂也是传播本病的重要媒介。
29
七. 甲型肝炎预防措施
1、从根本上说，应发展经济，提高人
民的物质文化生活水平，改善居住条
件，普及卫生常识，搞好环境及个人

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ELISA类型
• 夹心法
• 间接法测抗体
• 竞争法 • 捕获法
捕获法测IgM抗体
血清中针对某些抗原的特异性IgM 常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法。
• （1）包被抗体：用抗人μ 链抗体包被固相载体上,形成固相抗人μ 链; • （2）加入病人的血清标本; • （3）加入特异性抗原试剂;， • （4）加入针对特异性抗原的酶标抗体，
• （5）加底物显色．来自免疫球蛋白的结构一、基本结构：四肽链结构由两条相同的轻链（Light Chain）和两条相同的重链（Heavy chain）通过链间二硫键连结形成。分子式为：H2L2 四条肽链两端游离的 NH2和COOH方向一致分别命名为N端和C端
（一）轻链和重链
轻链（L链） κ链轻链决定型别 κ型正常人κ：λ≈2 ：1 λ链 λ型
结果判定
• 酶标仪读数：450nm波长630nm副波长读数， • 临界值=阴性对照孔 OD 均值 × 2.1( 阴性对照 OD 小于 0.05 以 0.05 计算) • 结果判定: S/CO≥1 为 HAV-IgM 阳性， • S/CO<1为 HAV-IgM 阴性。
Cut off value(临界值)
试剂盒组成
• • • • • • 1 抗-μ 链包被干板条 4×12 孔 2 抗-HAVIgM 阴性对照 1 ml×1 瓶 3 抗-HAVIgM 阳性对照 1 ml×1 瓶 4 HA-Ag 2.6 ml×1 瓶 5 酶结合物 2.6 ml×1 瓶 6浓缩洗涤液 20 ml×1 瓶（用蒸馏水 1： 20 稀释） • 7 显色剂 A 3 ml×1 瓶 • 8 显色剂 B 3 ml×1 瓶
甲型肝炎病毒IgM抗体的测定 (捕获法)
酶联免疫吸附试验（ELISA法）
• 将抗体(抗原)包被在固相表面后，按不同的步骤加入待测抗原(抗体)和酶标抗体 (抗原)，充分反应后用洗涤的方法，使固相上形成的抗原抗体复合物与其他物质分离，洗去游离的酶标抗体(抗原)，最后加入底物，根据酶对底物催化的显色反应程度，而对标本中的抗原(抗体)进行定性或定量。
思考题
• 血清的类风湿因子及其它非特异 IGM是影响捕获法检测中的主要物质，如何避免这些物质的影响？
Cut off value(临界值)：阴阳性判断值，简称 CO值。夹心法：若S/CO值>1，为阳性； S/CO值<1，为阴性；竞争抑制法：若S/CO值<1，为阳性； S/CO值>1，为阴性。
HAV HBV 肝炎病毒---- HCV HDV HEV 其他（HGV、TTV）（SEN、TLMV）
甲型肝炎急性期血清标志物出现过程
重链（H链）:根据其抗原性的差异，人类Ig的H链分为链链链链链重链决定Ig类别 IgG IgA IgM IgD IgE
捕获法
• 主要用于血清中某种抗体亚型成分（如 IgM）的测定。
实验原理
• 用抗人μ链抗体包被酶标板，用以捕获血清中 IgM 类抗体，然后用特异性 HAVAg 与 IgM 抗体结合，再加酶标抗 HAV 抗体，最后加底物显色，显色深浅与 HAVIgM 的含量成正相关。
要点： 1. HAV的传播途径(粪—口) 2. HAV的潜伏期(30天±2周) 3. 血清标志物出现的规律 4. 免疫学检测指标—HAV Ag 抗HAV总抗体抗HAV-IgM
临床意义
• 血清中抗HAVIgM出现于感染的早期(发病后数日),抗体的效价很快升到峰值并持续较长时间 (2-4周),经1-2个月后抗体的效价和阳性率明显不降,于3个月后消失.因此抗HAVIgM阳性,尤其是效价较高时,表明处于感染的早期,被公认为早期诊断甲肝的依据,是区别是急性感染还是慢性感染的有力佐证。
• 9 终止液 3 ml×1瓶
操作步骤
• 1．将微孔条固定在支架上，按顺序编号。 • 2．分别将待测标本，阴、阳性对照100μl（2滴）加入相应的孔中，设空白对照孔。置37℃20分钟。 • 3 ．洗涤：甩去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置5秒，共三次，每次洗后均需扣干。 • 4．每孔加HA· Ag50μl，酶结合物50μl（空白对照除外），振荡混匀，置37℃20分钟。 • 5．洗涤：重复上述3 • 6．显色：每孔加显色剂A液50μl，再加显色剂 B液50μl，振荡混匀，置37℃15分钟。 • 7.每孔加终止液50μl