一颅锁骨发育不全综合征家族的RUNX2基因分析研究
目的检测一个颅锁骨发育不全综合征（CCD）家系RUNX2基因突变情况。方法采用先证者查证法，对CCD家系各成员进行全身健康状况及口腔专科检查，拍摄X线片；抽取先证者及其父母、姐姐外周静脉血，提取基因组DNA，聚合酶链反应（PCR）扩增RUNX2基因并测序，将先证者及其父母、姐姐RUNX2基因测序结果进行Blastn比较分析。结果在先证者RUNX2基因的外显子2上发现了一个C→T突变，此突变来自母系染色体该基因568位点的基因突变；密码子CGG→TG G引起RUNX2编码的转录因子第190位保守的精氨酸变成色氨酸，突变型为c.568C>T。结论 c.568C>T突变是导致该家系发病的分子基础。
标签：颅锁骨发育不全综合征；RUNX2；基因突变
颅锁骨发育不全综合征（cleidocranial dyspla-sia，CCD）是一种累及骨骼和牙齿的常染色体显性遗传性疾病[1]，具有明显的家族聚集性，男女发病率无明显差别，临床发病率约为1：1 000 000。CCD常见的临床症状有囟门闭合延迟或不闭合，颅骨缝增宽，锁骨钙化不良、缺失或部分缺失，锥形胸，耻骨联合增宽而致骨盆发育不良，身材矮小等；口腔表现常见上颌骨发育不足，有多生牙，乳牙滞留，恒牙萌出延迟或埋伏牙等症状[2-5]。目前CCD的发病机制尚不清楚，本研究采用分子生物学的方法对1个颅锁骨发育不全家系的患者进行RUNX2基因测序分析研究。
1 材料和方法
1.1 研究对象
CCD家系1个，来自山东省济南市，家系图见图1。先证者，女，29岁，2010年6月因“牙齿不齐，咀嚼困难”到济南市口腔医院修复科就诊，要求修复上下牙列缺损。采用先证者查证法，对家系各成员进行全身健康状况及口腔专科检查。查体：先证者反，混合牙列，恒牙仅16、17、26、27、36、37、46萌出，全部乳牙均滞留，11～15、21～25、31～
35、41～45未萌，65、71、72、73、75、81、82、83、85松动Ⅱ度；颅骨和面部比例失调，头大面小，前额及顶部突出呈方形，前囟门未闭合，从额部到枕部中线区有明显凹陷；面中部发育不足，凹面型，眶距增宽；上颌骨及颧骨发育不足，下颌骨发育相对正常；肩部窄小，胸部呈圆锥形，锁骨短小，仅在近胸骨处可扪及，双肩下垂并可在胸前并拢。X线（图2）检查：上下颌骨内有埋伏牙，滞留乳牙牙根未见明显吸收，前囟门未闭合，颅缝增宽，并见多块缝间骨，双侧肩胛骨较小，呈翼状，位置下垂，双侧锁骨肩峰端部分缺如，耻骨联合间隙增宽，骶髂关节轻度增宽。先证者及其母亲的临床表现和X线特征均符合CCD 特征。该家系中3代共15位成员，其中CCD患者2例：先证者及其母亲，其母亲自述先证者姥姥、姥爷和其兄弟姐妹无类似症状。
箭头所指为先证者，Ⅰ～Ⅳ代表代数。
图 1 患者家族谱系图
Fig 1 The pedigree of the involved family
1.2 基因组DNA提取及测序ⅡⅢ
1.2.1 DNA提取抽取先证者及其父母、姐姐外周静脉血各2 mL，放入干冰冻存，使用Universal Ge-nomic DNA Extraction Kit试剂盒进行DNA 提取，取 1 μL进行琼脂糖凝胶电泳，获得基因组DNA。
1.2.2 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增参照文献[6]的方法设计7对寡核苷酸引物（表1），然后对RUNX2 基因分别使用TaKaRa LA Taq?、TaKaRa MightyAmp DNA Polymerase?进行套式PCR 扩增，反应体系及方法按照说明书进行。
1.2.3 基因测序及突变位点分析使用TaKaRa Aga-rose Gel DNA Purification Kit切胶回收目的片段进行测序，测序由宝生物工程（大连）有限公司完成，并对测序结果进行Blastn比较分析。
2 结果
将先证者的RUNX2基因测序结果进行Blastn比较分析，在Exon 2上发现了一个C→T突变，实际测序图谱显示双峰结构（C、T）；对于其CCD母亲的基因检测结果表明，此突变来自母系染色体该基因568位点的基因突变；密码子CGG→TGG可能引起RUNX2编码的转录因子第190位（R190W）保守的精氨酸变成色氨酸。该突变型为c.568C>T，CGG>
TGG。先证者的父亲、姐姐的测序结果显示，在同一位点显示C的单峰，即与Blastn中健康人的序列相同（图3）。
3 讨论
目前的研究表明，颅锁骨发育不全的致病基因是RUNX2，该基因定位于染色体6p21[7-8]，基因的错意表达、基因插入、缺失或者移码突变等都是造成颅锁骨发育不全综合征的重要原因[9]。
锁骨颅骨发育不全呈常染色体显性遗传，有很高的外显率和不同的表现型，轻症仅有牙齿异常，严重者表现为全身骨质受累[2]。本研究家系中母女两人受累，家系其他成员表型正常，考虑基因突变为突发性，突发后呈常染色体显性遗传。
锁骨颅骨发育不全的致病基因RUNX2是哺乳动物编码转录因子
PEBP2/CBF异二聚体d亚单位的
3个基因之一，此α亚单位包含了有结合DNA能力的128个氨基酸残基，并且这一结构在进化中为保守区域，与果蝇的runt区域具有较高的同源性，因而得名[6]。
研究发现RUNX2基因敲除小鼠模型没有骨组织和成骨细胞，这表明该转录因子为成骨细胞分化所必需，其在维持正常的骨骼生长发育中起着重要的作用[10-11]。RUNX2基因突变存在热点区域，该基因外显子1、2、3、5、7编码蛋白质的3个重要功能域：谷氨酸-丙氨酸富集区（QA功能域）、runt功能域和脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸富集区（PST功能域）[12-14]。本研究检测到的R190W突变发生在RUNX2中，位于runt功能域内，这个碱基改变将导致位于runt 结构域中第190 位保守的精氨酸编码为色氨酸（R190W）。在runt区域中的精氨酸拉伸物对DNA的结合有重要作用，因此，这个区域的破坏可以导致DNA结合能力的丧失[13]，精氨酸侧链是DNA结合的主要区域，当被不同的疏水性的色氨酸代替后，干扰了runt区域的结构，降低了DNA的结合能力。2001年Berg-witz 等[15]首次报道了这个突变位点，本研究结果则进一步证实了RUNX2中的R190W错义突变为CCD的致病突变，推测R190W（c.568C>T）为一个突变热点。典型CCD一般根据患者的典型面容、咬合关系、X线片检查以及全身情况即可诊断，X线检查方法为确诊本病的主要手段。由于CCD的X线征象具有特殊性，所以诊断并不困难，关键在于是否能想到本病。但对于轻症特别是仅有牙齿萌出异常患者的临床诊断较困难，通过检测RUNX2是否存在突变位点可以辅助诊断CCD。由于本病目前尚无确切有效的治疗手段且外显率高，即使检测基因发现有突变位点也并无好的治疗方法，因此CCD患者愿意进行抽血基因检测的比例很少。尽管目前已有80～90个RUNX2不同的突变位点被报道，约500个独立的CCD患者家族经过突变检测的筛选，但是此疾病致病基因的筛选和验证分析工作仍远远不够，新基因位点的鉴定将保证进一步的系统突变分析工作的开展，这可以为探讨CCD致病机制的分子遗传学机制打下坚实的基础。对于已经发现的CCD患者应进行遗传咨询，通过产前诊断及时发现携带有致病基因的胎儿[16]。
目前对CCD并无确切有效的治疗方法。对于处于生长发育期的患者可以采用正畸的方法进行治疗，必要时拔除滞留乳牙，减小恒牙萌出的阻力，或者采用牵引的办法帮助恒牙萌出；对于骨缺损导致的鼻梁塌陷等，可采用整形外科手术的方法进行骨移植，恢复患者的容貌；对于缺失牙齿，可采用种植或活动义齿等修复方法来进行修复。总之，对于CCD患者需要多学科联合修复治疗，长期的临床效果尚需要进一步观察。
[参考文献]
[1] Mundlos S，Otto F，Mundlos C，et al. Mutations involving the transcription factor CBFA1 cause cleidocranial dyspla-sia[J]. Cell，1997，89（5）：773-779.
