第六章 固定化酶和固定化活性细胞

酶的pH值低； 催化反应的产物为中性时，固定化酶的最适pH值一般不
变；
这是由于固定化载体成为扩散障碍，使反应
产物向外扩散受到一定的限制所造成的。当
反应产物为酸性时，由于扩散受到限制而积
累在固定化酶所处的催化区域内，使此区域 内的pH比降低，必须提高周围反应液的pH， 才能达到酶所要求的pH。为此，固定化酶的 最适pH比游离酶要高一些。反之，反应产物
固定化酶作用的最适温度可能会受到固定方法和固定化载 体的影响。
5． 底物特异性变化
固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同， 其变化与底物相对分子质量的大小有一定关系。
作用于小分子底物的酶
特异性没有明显变化
既可作用于小分子底物又可作用于大分子底物的酶 特异性往往会变化。
Eg：胰蛋白酶：高分子蛋白、低分子（二肽、多肽），固定在羧甲基 纤维素上，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酪蛋白的作用仅为游 离酶的3%；
为碱性时，由于它的积累使固定化酶催化区 域的pH升高，故此使固定化酶的最适pH比游 离酶的最适pH要低一些。
固定化酶最适温度的变化
一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化
Eg：用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其 作用的最适温度比游离酶高5—10
以共价结合法固定化的色氨酸酶，其最适温度比游离酶高
——这种固定化的酶既具有酶的催化特性， 又具有一般化学催化剂能回收、反复使 用等优点，并且生产工艺可以连续化、 自动化。
3
进展
1916年Nelson和Griffin利用活性炭吸附蔗糖酶
固定化酶的研究从20世纪50年代开始
1953年德国的Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯 乙烯树脂为载体，经重氮法活化后，分别与羧肽 酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，而 制成固定化酶。

第二节 酶和菌体固定化
半透膜包埋法制成的固定化酶小球，直径—般只有几 ㎛至几百㎛，称为微胶囊。制备时，—般是将酶液分散在 与水互不相溶的有机溶剂中，再在酶液滴表面形成半透膜， 将酶包埋在微胶囊之中。例如：将欲固定化的酶及亲水性 单体(如已二胺等)溶于水制成水溶液，另外将疏水性单体 (如癸二酰氯等)溶于与水不相混溶的有机溶剂中，然后将 这两种互不相溶的液体混和在一起，加入乳化剂（如司盘 -85等）进行乳化，使酶液分散成小液滴，此时亲水性的 已二胺与疏水住的癸二酰氯就在两相的界面上聚合成半透 膜，将酶包理在小球之内。再加进吐温-20(Tween-20)， 使乳化破坏，用离心分离即可得到用半透膜包埋的微胶囊 型的固定化酶。
第二节 酶和菌体固定化
用离子键结合法进行酶固定化，条件温和，操作简便。 只需在一定的pH值、温度和离子强度等条件下，将酶液 与载体混合搅拌几个小时，或者将酶液缓慢地流过处理好 的离于交换柱，就可使酶结合在离于交换剂上，制备得到 固定化酶。例如：将处理成-OH型的DEAE-葡聚糖凝胶加 至含有氨基酰化酶的0.1mo1/L的pH7.0磷酸缓冲液中，于 37℃条件下，搅拌5h，氨基酰化酶就可与DEAE-葡聚糖 凝胶通过离子键结合，制成固定化氨基酰化酶。或者将处 理过的DEAE-葡聚糖凝胶装进离子交换柱，用氢氧化钠处 理，使之成为-OH型，用无离子水冲洗，再用pH 7.0的 0.1mo1/L磷酸缓冲液平衡备用。另将一定量的氨基酰化酶 溶于pH7.0的0.1mol／L磷酸缓冲液中配成一定浓度的酶液， 在37℃的条件下，让酶液慢慢流过离子交换柱，就可制备 成固定化氨基酰化酶。用于拆分乙酰—DL—氨基酸，生 产L—氨基酸
酶工程
第六章 酶与细胞固定化
第二节 酶和菌体固定化
将酶与水不溶性的载体结合，制备固定化酶的过程称 为酶的固定化。

再加DEAE-纤维素结合 结果：结合力增大(吸附量也大),也相当稳定，使
用寿命长，有时可以连续使用3个星期
吸附方法：
1.静态吸附，自然吸附、解吸、再吸附的固定化方法。 效率低，时间比较长，而且不完全。
2.电沉积，在载体附近加电极，酶移向载体表面的固 定化方法。需要酶在电场中不破坏，保持原来酶性 能。。
➢ 特点：操作简便、条件温和、不会引起酶变性失活， 载体廉价易得，可反复使用，但结合力较弱，酶与 载体结合不牢固易脱落。
物理吸附(氢键、疏水键等作用力将酶固定于不溶性载体上) 无机吸附剂（高岭土、皂土、硅酸、氧化铝等）
吸附量小、有些酶发生吸附变性 有机吸附剂（纤维素、胶原等）
吸附量略大(～50mg/g载体),不产生变性失活，比较 受重视。
吸附力弱，不适宜的pH,高盐浓度，高底物浓 度，高温等都能把吸附的酶解吸下来。
可以改善的方法： 1.选择最佳条件操作（如温度、pH） 2.选吸附量大的载体，控制酶和载体量
如烃基-琼脂糖衍生物吸附在酸性pH的酶(脲 酶)用亲和吸附剂 ConA-葡聚糖能专一吸附糖蛋白
对酶进行修饰以后再与载体结合，胰蛋白酶+丙 烯酸与顺丁烯二酸酐的水溶性共聚体共价偶联
避免影响酶的活性构型和相应基团
酶的偶联量: 单位载体上偶联酶的总量与“相对酶活力”之间的
平衡。
相对酶活力： 指固定化酶和蛋白量与相等的原酶的活力比。
由于固定化时，受到载体、方法、条件、酶反应系 统的影响，即使以上因素一定，还会受到酶偶联量的影响。
1.只有达到一定的偶联量，酶活性达到最高。 2.超过一定的偶联量，酶过多集中于载体的局部， 造成空间位阻效应，部分酶无法表现活性。随酶偶联量上 升酶活性反而下降。
寻找二者平衡点关系，才能使固定化酶活性达到最高。

点。
（1）差速离心特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。
（2）密度梯度离心特点：：
区带内的液相介质密度小于样品物质颗粒的密度。
适宜分离密度相近而大小不同的固相物质。
（3）等密度梯度离心特点：
介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。
适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。
5、酶的分离纯化过程中常用沉淀法的种类及原理。
第一章 绪论
1、 何谓酶工程，试述其主要内容和任务。 答：酶的生产、改性与应用的技术过程称为酶工程。 酶的生产：微生物发酵产酶、动植物培养产酶、酶的提取和分离纯化 酶的改性：酶分子修饰、酶固定化、酶非水相催化和酶的定向进化 酶的应用：通过酶的催化作用获得人们所需的酶，并通过各种方法使 酶的催化特性得以改进，充分发挥其催化功能。 酶工程的内容：微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提 取与分离纯化，酶分子的修饰，酶、细胞、原生质体固定化，酶非水 相催化，酶定向进化，酶反应器和酶的应用等。
第二章 酶的生物合成与发酵生产
1、提高酶的产量的措施。 （一）遗传控制 诱变育种 (1)使诱导型变为组成型——选育组成型突变株 (2)使阻遏型变为去阻遏型
选育营养缺陷型突变株 解除反馈阻遏
选育结构类似物抗性突变株 解除分解代谢物阻遏——选育抗分解代谢阻遏突变株 基因工程育种 改变细胞调节基因，使菌种由诱导型变为组成型。 增加结构基因的拷贝数，增加细胞专一性酶的生产。 （二）条件控制 （1）添加诱导物
缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。 ④共价结合法：结合牢固，不易脱落，可连续使用较长的时间 载体活化操作复杂，对酶的活性有影响。 ⑤交联法：交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时 间使用。交联法也用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。 2、酶固定化后性质会发生什么变化？原因是什么？酶固定化后稳定性 提高中,包括哪几方面的稳定性？ （1）酶的活性 ：通常低于天然酶（有例外）。 （2）酶的稳定性 酶的耐热性、对变性剂、抑制剂、蛋白酶的抵抗力增加，固定化可以 增强贮存稳定性和操作稳定性。 可能的原因：①固定化增加了酶活性构象的牢固程度，可防止酶分子 伸展变形； ②抑制酶的自身降解。 ③固定化部分阻挡了外界不利因素对酶的侵袭。 包括：（一）酶的最适温度 最适温度与酶稳定性有关。 多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升（有例外）。 （二）酶的最适pH 带负电荷载体 ：最适pH 向碱性偏移。 带正电荷载体 ：最适pH 向酸性偏移 （三）酶的动力学特征 固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。 固定化载体与底物电荷相反,固定化酶的表观Km值降低。

• 固定化细胞意义：用完整的细胞作为生物催化剂， 以充分有效地利用生物细胞内的特定酶或多酶系 统。
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优点
①省去对酶的提取过程，使酶的损失和生产 成本降到最低程度；
②可以利用细胞的多酶系统直接生产有价值 的产物。
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第一节 酶和细胞的固定化
一、固定化酶和细胞的定义及特点 二、固定化方法 三 细胞的固定化方法
缺点：结合力弱，易解吸 附。
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2.共价偶联法（covalent binding or covalent coupling）
借助共价 键将酶的活性 非必需侧链基 团和载体的功 能基团进行偶 联。
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1）载体：亲水载体优于疏水载体
如:天然高分子衍生物:
纤维素
葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差
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戊二醛有两 个醛基，均可与 酶或蛋白质的游 离氨基反应,使酶 蛋白交联。
此法与共价偶联法利用的均是共价键， 不同之处：交联法不使用载体。
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交联反应既能发生在分子间，也可 发生在分子内。
• 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶 仍保持溶解状态。 • 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶 变为不溶态。
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优越性：
(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作; (2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系
完成部分代谢过程。 局限性： (1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副
产物。 (2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制
作用。
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3.固定化原生质体
意义： (1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障 碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和 胞内产物的分泌。 (2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后， 由于载体的保护作用，稳定性提高。

硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等。
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离子吸附法 ?离子吸附法 (ion adsorptio是n)通过离子键使酶与含
有离子交换基团的水不溶性载体相结合的固定化 方法。 ?此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、 β-淀粉 酶、纤维素酶等，在工业上用途较广。
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? 离子吸附法常用的载体： ?阴离子交换剂： DEAE纤- 维素、四乙氨基乙基
响酶的原有构象，又能使固定化酶能有效回收贮藏，利于反 复使用。 ? （3）固定化应有利于自动化、机械化操作。这要求用于固 定化的载体必须有一定的机械强度，才能使之在制备过程中 不易破坏或受损。
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? （4）固定化酶应有最小的空间位阻。 ? （5）固定化酶应有最大的稳定性。在应用过程中，
所选载体应不和底物、产物或反应液发生化学反 应。 ?1）凝胶包埋法 ?将聚合物的 单体与酶溶液混合，再借助于聚合 促进剂(包括交联剂 )的作用进行聚合，酶被包 埋在聚合物中以达到固定化。 ?凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉 菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等 天然凝胶以 及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等 合成 凝胶或树脂 。
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? （2）微胶囊包埋法 ?微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的 半 透膜微胶囊 内的方法。它使酶存在于类似细胞 内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外 的环境直接接触，从而增加了酶的稳定性。常 用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋 酸纤维素等。
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?（3）溴化氰法 即用溴化氰将含有羟基的载体，如 纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，活化生成亚 氨基碳酸酯衍生物，然后再与酶分子上的氨基偶联， 制成固定化酶。
? 任何具有连位羟基的高聚物都可用溴化氰法来活化。
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?（4）烷基化和芳基化法 以卤素为功能团的载体 可与酶蛋白分子上的氨基、巯基、酚基等发生烷 基化或芳基化反应而使酶固定化。

1）网格型包埋法 （gel (lattic) entrapment）
又称凝胶包埋法
使用的多孔载体及其特点
凝胶
包埋条件 酶活性
天然凝胶 琼脂、海藻酸钙、温和 角叉菜胶、明胶
不变
强度 差
树脂
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海藻酸钙凝胶包埋法： 滴至
海藻酸钠溶液＋E (or cell) CaCl2 溶液中
②细胞固定化的基本技术和原理； ③简要介绍固定化酶基本性质的影响及辅因
子的固定化方法和辅酶的再生体系。
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游离酶的缺点：
1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有 机溶剂对其有影响）。 2.不能回收，使用成本高。 3.酶在游离体系中更容易自水解 4.分离纯化困难，也使产物中混杂酶蛋白
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• 固定化酶（定义）：用物理或化学手段定位在限定 的空间区域，并使其保持催化活性，可重复利用的 酶。（1971年在美国召开的第一届国际酶工程会议）
第6章 固定化酶与固定化细胞
概述 第一节 酶和细胞的固定化
一、固定化酶和细胞的定义及特点 二、酶的固定化方法 三 细胞的固定化方法 四 原生质体的固定化方法 第二节 固定化酶和固定化细胞的性质与表征 第三节 固定化酶与固定化细胞的应用 第四节 辅酶的固定化
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本章讲授
①固定化生物催化剂的概念以及吸附法、包 埋法、共价结合法、无载体固定化酶的基 本技术和原理；
• 固定化细胞（定义）：将具有一定生理功能的生物 细胞（如微生物细胞、植物细胞或动物细胞等），用一定的方 法将其固定，作为固体生物催化剂而加以利用的一 门技术。
• 固定化细胞意义：用完整的细胞作为生物催化剂， 以充分有效地利用生物细胞内的特定酶或多酶系统。
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优点

固定化多酶反应
生化代谢产物,需由多种酶经多步酶促反应才能合成. 生化代谢产物,需由多种酶经多步酶促反应才能合成. 多酶反应器,为制造那些在有机合成上很棘手的, 多酶反应器,为制造那些在有机合成上很棘手的,结构 复杂的生化代谢物开辟了一条新的途径. 复杂的生化代谢物开辟了一条新的途径.
固定化细胞
直接把微生物细胞固定化
包埋法是制备固定化细胞最常用的方法. 包埋法是制备固定化细胞最常用的方法.将 产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶, 产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶,琼脂糖 凝胶,琼脂,海藻酸,卡拉胶, 凝胶,琼脂,海藻酸,卡拉胶,二和三醋酸纤 胶原,明胶和戊二醛等包埋起来, 维,胶原,明胶和戊二醛等包埋起来,发挥酶 或酶系的作用. 或酶系的作用. 例如: 3m1细胞悬浮液加人到 例如:海藻酸包埋 3m1细胞悬浮液加人到 2% 溶液中,置冰箱10h 10h, 20ml 2%CaCl2溶液中,置冰箱10h,用 100ml生理盐水洗二次 生理盐水洗二次. 100ml生理盐水洗二次. 注意:如果反复使用固定化细胞,需要避免 注意:如果反复使用固定化细胞, 其他微生物的污染, 其他微生物的污染,在工业生产中细胞的固 定化是在严格无菌条件下进行. 定化是在严格无菌条件下进行.
酶分子被结合到水不溶性 载体上共价结合形成水不 溶性的固定化酶
交联法
使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互 交联呈网状结构的固定化方法. 交联呈网状结构的固定化方法. 最常用的双功能试剂有戊二醛, 最常用的双功能试剂有戊二醛,顺丁稀二酸 酐和乙烯共聚物等.酶蛋白中的游离氨基, 酐和乙烯共聚物等.酶蛋白中的游离氨基,酚 咪唑基及巯基均可参与交联反应. 基,咪唑基及巯基均可参与交联反应. 双功能试剂: 双功能试剂: 常用的是戊二醛 常用的是戊二醛 O O

IE (or IC)
b. 微囊型包埋(microencapsulation)： 又称半透膜包埋法：
将酶包埋于由各种高分子聚合物（直径几十微 米～几百微米，厚约25mm的半透膜）制成的小球 内，制成固定化酶。 ① 常用半透膜有：聚酰胺膜、火棉胶膜 ② 制备方式：界面沉降法、界面聚合法、表面活性 剂乳化液包埋法。 分述如下：
第六章 酶、细胞、原生质体固定化
游离酶的缺点：
(1) 酶的催化效率不够高
(2) 酶的稳定性较差（热、酸碱、有机溶剂对其有 影响）。
(3)酶使用后通常不能回收，这种一次性使用酶的 方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产， 从而导致酶的使用效率低，产品成本高。
(4)产物的分离纯化较困难 ，酶在催化反应结束后 与产物混在一起，给产物的进一步分离纯化带来一 定的困难。
物理吸附法（physical adsortion） 作用力：氢键、疏水键 常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔 玻璃、硅胶、羟基磷灰石、纤维素、大孔合成 树脂等。
优点：酶的活性中心不易被破坏， 酶活力损失小。
缺点：结合力弱，易解吸附。
（3）制备方法：
a. 静态法 (statia procedure) ：
该法可提高吸附时局部浓度，增加吸附量，但要注意 酶法 (mixing or shaking bath loading) ：
是实验室常用方法，载体与酶液混和后，要在搅 拌下或摇床连续振摇下完成固定化。
该法固定化较为均匀，要注意搅拌或振摇速率， 既不破坏酶和载体结构，又要达到充分混和目的。
界面沉降法： 利用高聚物在水相和有机相的界面上溶解度降
低而凝聚，易形成皮膜而将酶包埋于中。 例： 以火棉胶（硝酸纤维素）包埋酶时，先将