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多克隆抗体制备的技术_PPT幻灯片

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大学精品课件：多克隆抗体-ELISA

大学精品课件：多克隆抗体-ELISA

JLU
37℃ ，40min. ❖ 洗 涤: 加洗液200ul/孔，轻磕板1分钟，弃上清，洗三次 . ❖ 酶标抗体: 加入HRP标二抗100 µL/孔37℃ 40min. ❖ 洗 涤: 加洗液200ul/孔，轻磕板1分钟，弃上清，洗三次 . ❖ 显 色: 加入底物100 µL/孔，避光15min ❖ 加终止液: 加2M硫酸 50 µL/孔 ❖ 测 量: 酶标仪测定OD 490nm值.
稀释度 （倍）
OD值
阴性 200 400 800 1600 3200 6400 12800 对照 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.11 0.08
抗体效价 ≈ 6000
数据统计方法（结果示意图）
注意事项
❖ EP管做好标记 ❖ 离心配平 ❖ 移液器操作：缓吸缓吐，用后恢复到最大量程 ❖ 加板：贴壁 ❖ 磕板：轻柔，防止交叉污染 ❖ 弃上清：甩板或倒扣
JLU
多克隆抗体制备-ELISA
王飞 fei@
实验材料
❖ 96孔ELISA板、移液器、镊子、离心管 ❖ 抗原包被液：50ug/ml OVA in 0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6 ❖ 封闭液：5%脱脂奶粉 in PBS pH7.4 ❖ 抗体稀释液：PBS pH7.4 ❖ 二抗：HRP标记羊抗鼠抗体 ❖ 洗涤液(PBST)：0.1%Tween-20 in PBS pH7.4 ❖ 显色液：0.04%OPD、0.15%H2O2 in 柠檬酸-磷酸缓冲液 pH5.0 ❖ 终止液：2M硫酸
加板方法
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12源自A1:200B
1:400
C
1：800
D
1:1600
E
1:3200
F

多克隆抗体ppt课件

多克隆抗体ppt课件
• 所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞免疫 （二级学科）
多克隆抗体
二、概述
• 抗原刺激机体，产生免疫学反应，由机体的浆细胞合成并 分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白，这就是免 疫球蛋白，这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就 是抗体。
• 抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇 刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之 为单克隆抗体（Monclone antibody）。由多种抗原决定簇 刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单 克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内所产生的抗 体就是多克隆抗体；除了抗原决定簇的多样性以外，同样 一类抗原决定簇，也可刺激机体产生IgG、IgM、IgA、IgE 和IgD等五类抗体。
细胞免疫二级学科多克隆抗体抗原刺激机体产生免疫学反应由机体的浆细胞合成并分泌的与抗原有特异性结合能力的一组球蛋白这就是免疫球蛋白这种与抗原有特异性结合能力的免疫球蛋白就是抗体
多克隆抗体
简述多克隆抗体的定义、制备及鉴定等 相关知识
多克隆抗体
一、定义
• 中文名称：多克隆抗体 • 英文名称：polyclonal antibody • 定义1：由多个B细胞克隆所产生的抗体，可与不
多克隆抗体
（三）操作方法 1、免疫方法 • 可以采用以下各种方法之一进行免疫。 （1）淋巴结注射法： A、在兔的两后足跖部皮下（或皮内）注射活卡介苗 50mg（每
侧约0.30ml） 。7～10 天后，兔跖及腘肌淋巴结肿大； B、于肿大的两侧淋巴结内各注射加有完全佐剂的IgG 乳化抗原
0.50ml(含 IgG 5mg/ml、青霉素 1 000U/ml、链霉素 1 000μg/ml)； C、必要时，14 天后，重复步骤B一次； D、再过 7 天后，于两侧淋巴结内各注射加有完全佐剂的 IgG 乳化抗原0.50ml（含IgG5mg/ml、青霉素 1 000U/ml、链霉素 1 000μg/ml） ； E、5～7天后，耳静脉采血。测定血清效价。

克隆抗体技术及其应用幻灯片PPT

克隆抗体技术及其应用幻灯片PPT
➢由杂交瘤细胞系产生的，针 对同一抗原决定簇的抗体— —高度均质。
➢由同一个B细胞克隆产生的 同异质的抗体组成，是针对 抗原的单一决定簇抗体。
➢单抗纯度高，专一性强、重 复性好。无披次差异。
➢易于标准化。
➢能保证无限量供应。
免疫血清
又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。
➢无法在HAT选择培养剂中生长
➢能无限地快速增殖 ➢既不合成轻链又不合成重链
HAT
小鼠脾细胞 （B-Cell ）：
✓合成和分泌特异性抗体 ✓无法进行体外长期培养
脾细胞－SP2/O融合细胞：
➢HGPRT＋，能在HAT选择培养剂中生长 ➢能无限地快速增殖 ➢合成和分泌特异性抗体
Fish Disease Research Center
克隆抗体技术及其应用幻 灯片PPT
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Hale Waihona Puke Fish Disease Research Center
Fish Disease Research Center
Fish Disease Research Center
单克隆技术的原理
骨髓瘤细胞 （SP2/O-Ag14 ）：
➢丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转 移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase， HGPRT－）
蛋白质等生物活性分子的纯化； 细胞生物学——组织定位； 分子病毒学——结构分析； 特定生物分子的功能研究；

医学免疫学创新性实验----伤寒沙门菌多克隆抗体的制备PPT课件

医学免疫学创新性实验----伤寒沙门菌多克隆抗体的制备PPT课件

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实验材料: 1. 新西兰雄性大白兔共16只,2只/班,昆明鼠48只,6只/班 2. 灭活伤寒沙门菌 3. 注射器(免疫用、采血用)、碘酒酒精棉球等 4. 肥大氏反应用实验材料
一、大白兔耳缘静脉免疫方法 1. 将大白兔固定,将耳缘静脉附近的毛剪去,并用酒精棉球消毒。 2. 用2ml注射器吸取1ml (初次0.5ml)伤寒沙门菌液经耳缘静脉注入大白兔体内。 3. 每周免疫1次,连续3-4次。 注意:先自耳缘静脉远端注射。
二、大白兔皮内免疫方法 先将大白兔固定,剪去背部兔毛,注意不要剪破皮肤。然后用酒精棉球进行消毒。 用2ml注射器吸取1ml伤寒沙门菌液进行皮内注射,共4-6点,每点大约0.2ml。 3. 每周免疫1次,连续3-4次。
三、小鼠腹腔免疫方法 1.用左手抓取小鼠固定,消毒腹部皮肤。 2.用1ml注射器吸取伤寒沙门菌0.2ml进行腹腔注射。 3.每周免疫1次,连续3-4次。
进行实验记录: 包括实验名称 指导教师 年级专业 参加实验学生 整个实验过程 意见和建议
兔标记方法: 1班:剪去头左侧毛 5班:剪去腹左侧毛
一、大白兔耳缘静脉免疫方法: 1.将大白兔固定,将耳缘静脉附近的毛剪去,并用酒精棉球消毒。 2.用2ml注射器吸取1ml(初次0.5ml)伤寒沙门菌液经耳缘静脉注入大白兔体内。 3.每周免疫1次,连续3-4次。 注意:先自耳缘静脉远端注射。
二、大白兔皮内免疫方法 1.先将大白兔固定,剪去背部兔毛,注意不要剪破皮肤。然后用酒精棉球进行消毒。 2.用2ml注射器吸取1ml伤寒沙门菌液进行皮内注射,共4-6点,每点大约0.2ml。 3. 每周免疫1次,连续3-4次。
三、小鼠腹腔免疫方法 1.用左手抓取小鼠固定,消毒腹部皮肤。 2.用1ml注射器吸取伤寒沙门菌0.2ml进行腹腔注射。 3.每周免疫1次,连续3-4次。

多克隆抗体制备PPT课件

多克隆抗体制备PPT课件

2021/7/23
12
血液采集
采血量
采血部位
少量
尾静脉，耳静脉，眼 底静脉
中量
耳中央动脉，颈动/静 脉，心脏
②初次应答最早产生的抗体为 IgM，可在几天内达到高峰， 然后开始下降，接着才产生 IgG，IgG 抗体产生的潜伏期比 IgM 长，如果抗原剂量少，可能仅产生 IgM，IgA 产生最迟， 而且含量少；
③初次应答产生的抗体总量较低，维持时间也短，通常以 IgM 为主，且抗体的平均亲和力较低。
2021/7/23
鸡的IgG常称IgY,其特点是不会激活哺乳动物的补体 成分C1,也不会与细菌蛋白A或蛋白质G、哺乳动物的 Fc受体或类风湿因子等发生反应。在极端条件下,鸡 IgY的稳定性不如家兔IgG,不过,鸡的IgY在鸡蛋内可保 持稳定达数月之久,纯品IgY在中性缓冲液和冷藏条件 下则可保存数年之久。用鸡IgY已经制备出Fc和单价 的Fab或Fab′等片段。
( 二) 增生分化阶段(proliferative and differentiative stage) 又称反应阶段 (reactive stage)，是抗原特异性淋巴细胞识别抗原后活化，进行增殖与分 化，以及产生效应性淋巴细胞和效应分子的过程。T 细胞增殖分化为淋 巴母细胞，最终成为效应 T 细胞(或称致敏 T 细胞)，并产生多种细胞因子； B 细胞增殖分化为浆细胞，合成并分泌抗体。一部分 T、B 淋巴细胞在分 化过程中成为记忆细胞(Bm 和 Tm)。在此阶段，有多种细胞间的协作和多 种细胞因子的参加。
机体初次接受适量的抗原刺激后，引起体内抗体产生的过程 称为初次应答，主要特点为：
①机体初次接触抗原后，需经一定的潜伏期血清中才能出现 抗体，潜伏期的长短取决于抗原的性质、抗原进入机体的途 径、所用的佐剂类型、受体情况等，潜伏期之后为抗体的对 数上升期，抗体含量直线上升，然后为持续期，抗体产生和 排出相对平衡，最后为下降期；

多克隆抗体的制备ppt课件

多克隆抗体的制备ppt课件
化学法：是利用某些功能基团把半抗原连接到蛋白 质类或多肽类聚合物载体上。不同的半抗原应选用不 同的方法进行连接。
多克隆抗体的制备
根据化学基团不同，连接方法主要有以下几类：
带游离氨基或羧基以及二种基团皆有的半抗原：羧基可用混合酸酐 法和碳二亚胺法与载体氨基形成稳定的肽键，带氨基的半抗原则可与 载体羧基缩合。
带有羟基、酮基、醛基的半抗原：不能直接与载体连接，需要用化 学方法如琥珀酸酐法、O-羧甲基、羟胺法等方法将之转变为带有羧基 的
半抗原衍生物后才能与载体连接。
带有酚基的半抗原，可用一氯醋酸钠法或重氮化的对氨基苯甲酸法， 生成带有羧基的半抗原衍生物。
多克隆抗体的制备
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多克隆抗体的制备
多克隆抗体的制备及 抗体活性测定
张江中试平台
多克隆抗体的制备
主要内容
• 多克隆抗体制备的基本原理 • 多克隆抗体制备的操作步骤 • 抗体活性的实验原理、操作流程和结果判断
多克隆抗体的制备
原理
1、克隆(clone)： 是指无性繁殖细胞系，由单一个祖先细胞 分裂繁殖而形成的一簇细胞系。在这个家族的所有成员中， 如无发生突变其基因是完全相同的。
选择性沉淀：
选择某抗原理化特性，采用相应沉淀剂或溶液环境， 如：
核酸去除 盐析沉淀法 有机溶剂沉淀法 高分子聚合物沉淀法
多克隆抗体的制备 50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出血清球蛋白；
超滤法： 利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小
的抗原物质进行滤筛。 电泳
多克隆抗体的制备
精分离
层析法： 凝胶过滤层析 离子交换层析 亲和层析 疏水层析 反相层析
改变抗体类型，使产生抗体由IgM型转变为IgG型；

多克隆抗体的制备ppt课件

增强吞噬细胞的吞噬作用（被佐剂吸附的抗原易被吞噬细 胞吞噬），促进对抗原的处理，刺激淋巴细胞增生，从而增 强和扩大免疫应答的效应。
多克隆抗体的制备
动物免疫
免疫动物的选择：
抗原来源与动物种属的关系：抗原的来源与免疫动物种 属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越好，而同种系 或亲缘关系越近，免疫效果越差。
人工合成佐剂：如双链多聚肌苷酸：胞苷酸（poly I：C）、 双链多聚腺苷酸：尿苷酸（poly A：U）；油剂：如弗氏完全 佐剂、花生油乳剂等；
纳米佐剂
多克隆抗体的制备
弗氏佐剂（Freund’s adjuvant）
分为弗氏不完全佐剂和完全佐剂两种： 前者是由油剂（矿物油或花生油）和乳化剂（羊 毛脂或吐温-80）按1：1～1：5比例混合而成；
选择性沉淀：
选择某抗原理化特性，采用相应沉淀剂或溶液环境， 如：
核酸去除 盐析沉淀法 有机溶剂沉淀法 高分子聚合物沉淀法
多克隆抗体的制备 50%饱和硫酸铵盐溶液可沉淀析出血清球蛋白；
超滤法： 利用孔径大小不同的特制薄膜对不同分子大小
的抗原物质进行滤筛。 电泳
多克隆抗体的制备
精分离
层析法： 凝胶过滤层析 离子交换层析 亲和层析 疏水层析 反相层析
多克隆抗体的制备及 抗体活性测定
张江中试平台
多克隆抗体的制备
主要内容
• 多克隆抗体制备的基本原理 • 多克隆抗体制备的操作步骤 • 抗体活性的实验原理、操作流程和结果判断
多克隆抗体的制备
原理
1、克隆(clone)： 是指无性繁殖细胞系，由单一个祖先细胞 分裂繁殖而形成的一簇细胞系。在这个家族的所有成员中， 如无发生突变其基因是完全相同的。
多克隆抗体的制备

[课件]第3章抗体的人工制备PPT


一、嵌合抗体
嵌合抗体 （chimeric antibody)是指同一 抗体分子中含有不同种属来源抗体片段 的看体，又称杂种抗体．主要有“鼠－ 人类型。”Fab或Ｆ（ab）2来源于鼠类， Fc来源于人类。这种杂交瘤细胞分泌的 抗体特异性和亲和力与原杂交瘤细胞相 同，但减少了鼠源性成分。
二、重构抗体
为进一步减少鼠源蛋白在嵌合抗体中 的含量，将鼠抗体超变区基因嵌入人 抗体Fab骨架区的编码基因中，在将 此基因片段与人Ig恒定区基因相连， 然后转染杂交瘤细胞，使之表达V区 抗体，即为重构抗体（reshaping antibody）
三、单链抗体
单链抗体（single—chain antibody）又 称Fv分子。由VL区氨基酸序列VH区氨 基酸序列经肽连接物（linker）连接而成。 肽连接物还可以将药物、毒素或同位素 与单链抗体相连。这种抗体分子小，免 疫原性低；在血清中清除快；无FC片段， 避免非特异性杀伤；能进入实体瘤周围 的微循环等。
四、Ig相关分子
将抗体的部分片段连接到一些有治 疗作用的毒素或药物上，取代Fc片 段，可直接发挥毒素或药物的治疗 作用，起“生物导弹”作用。 例如：CD4免疫黏附素治疗AIDS。
五、噬菌体抗体
噬菌体抗体（phage antibody）是 将一直特异性抗体分子的所有V区 基因在噬菌体中构成基因库，用噬 菌体感染细菌，模拟免疫选择过程， 具有相应特异性重链和轻链可变区 即可在噬菌体表面呈现出来。这种 技术成为噬菌体表面展示技术 （phage display technology）
脾
B 细 胞
骨髓瘤小鼠 取腹水
抗原
骨髓瘤细胞 + PEG, 融合 杂交瘤细胞
Ab1 Ab2 Ab3 Ab4

详细介绍抗体的生产制备ppt课件

半抗原－载体连接方法：常用物理法和化学法。
物理吸附的载体有羟甲基纤维素等，其借助电荷和微孔吸附半抗原；
化学法则是利用某些功能基团把半抗原连接到载体上。
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四）免疫佐剂
某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，可增强机体对该抗原的特 异性免疫应答或改变免疫应答类型，此类物质称为免疫佐剂 (immunoadjuvant)，简称佐剂。
抗血清的效价：就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价测定的方法常 用的是放射免疫法，此法对所有的抗体均适用。某些由大分子（如蛋白类） 抗原所产生的抗体，可用双向扩散等方法测定。前者测定的效价极为精确。 而后者则粗糙得多。
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放射免疫法： 以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原（放射 性核素标记）混合，孵育24h后，测定其结合率（用液体闪烁 计数仪测定Ag*－Ab或游离Ag*）。通常以结合率为50%的血清 稀度为效价。如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为1： 15000，则该血清的效价就是1：15000。抗血清的效价，除由 抗血清本身的性质决定外，还受标记抗原的质量、孵育时间， 所用稀释液的成分及其pH等因素的影响，在工作中必须引起 注意。
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（二）免疫方法
选定动物后，在免疫过程中应考虑免疫剂量、免疫途径、免疫次数、免疫间 隔等因素。
1、免疫原的剂量：免疫原的接种剂量按免疫原性的强弱、动物的个体状态 和免疫时间来确定。首次免疫时，剂量不宜过大，以免产生免疫麻痹。 2、免疫途径与免疫间隔时间
免疫途径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结等，视不同的免 疫方案而异。对于不易获取的宝贵抗原可采用淋巴结免疫法。
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1、佐剂的种类
佐剂一般包括以下几类：
①无机佐剂：如氢氧化铝、明钒等
②生物性佐剂：如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰 阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的B亚单位、胞壁酰二肽和细胞因子等；
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• 纯化：盐析法
•
凝胶过滤法
•
离子交换层析法
•
亲和层析法
•
电泳分离法
• 浓缩：吸收浓缩
•
蒸发浓缩
•
超滤浓缩
• 研钵乳化法 • 直接在旋涡振荡器上乳化 • 组织捣碎器乳化 • 注射器乳化 • 胶体磨
二、动物免疫
（一）免疫动物的选择
选择动物时应考虑以下因素： ①抗原来源与动物种属的关系。抗原的来源与免疫 动物种属差异越远，其免疫源性越强，免疫效果越 好，而同种系或亲缘关系越近，免疫效果越差。 ②动物个体的选择。适龄、健康、体重符合要求的 正常动物（以雄性为佳）；抗体需要量少时，选用 家兔、豚鼠和鸡等小动物；抗体需要量大时，可选 用绵羊、山羊、马、驴等大动物。 ③抗原性质与动物种类
•
合成类载体：人工合成的多肽聚合
物
2.连接方法
半抗原与载体的连接有物理法和化学法。
• 物理法 是用物理吸附法将载体与半抗原连 接，其原理是通过电荷和微孔来吸半抗原， 吸附载体主要有PVP和CMC等；
• 化学法 是利用某些功能基团把半抗原连接 到蛋白质类或多肽类聚合物载体上。不同的 半抗原应选用不同的方法进行连接。
（二）免疫方法
• 根据抗原的性质、免疫原性和动物的免疫 反应性来决定免疫途径、免疫次数和间隔 时间等肉注射
•
静脉注射
•
腹腔注射以及淋巴结内注射
• 注射间隔时间：
• 带佐剂的皮内、皮下注射，一般为间隔 2～ 4 周免疫一次。
• 不带佐剂的皮下或肌肉注射，一般为 1～2 周间隔时间；肌肉或静脉免疫的，可 5 天 左右的间隔时间。
抗原的提取与纯化
• 提取：
• 水溶液提取法 • 有机溶剂提取法 • 纯化： • 超滤，盐析，电泳，凝胶过滤，离子交换，
亲和层析，高压液相法。
人工抗原
• 半抗原+大分子载体=免疫原
• 半抗原：相对分子量小，不具有免疫原性 多肽，核酸，甾体激素，化学药物
• 载体：天然蛋白质载体：人血清蛋白，牛 血清蛋白….
佐剂：弗氏不完全佐剂（incomplete Freund's adjuvant,IFA）
•
弗氏完全佐剂（complete Freund's
adjuvant,CFA）
• 初次免疫时，最好用弗氏完全佐剂，以刺 激机体产生较强的免疫反应。再次免疫时，
一般不用完全佐剂，而采用弗氏不完全佐
剂。但在研究分枝杆菌及相关抗原时，一
抗体的制备技术经历了三代：
• 第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免 疫动物后获得抗体，称为多克隆抗体 （polyclonal antibody）；
• 第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中 某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体 (monoclonal antibody, McAb)；
• 第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为 基因工程抗体(genetic engineering antibody)。
般不用弗氏完全佐剂，以免卡介苗的干 扰。
2. 佐剂的免疫生物学作用
①增强抗原免疫原性：使无或微弱免疫原性的 物质变成持久或强的免疫原； ②增强机体对抗原刺激的反应性，提高初次应 答和再次应答所产生的抗体滴度； ③改变抗体类型，使产生抗体由IgMG型转变 为IgG型； ④引起或增强迟发性超敏反应。
乳化作用
重组多克隆抗体
• Sarantopoulos首次提出的。
• 模拟了天然多抗的产生过程，克服了抗血 清和单克隆抗体的缺点，成为治疗复杂疾 病安全有效的制剂。
• 技术：全人抗体库的构建
•
筛选和位点特异性整和技术
多克隆抗体制备流程
• （一）抗原的制备 • （二）免疫动物 • （三）免疫血清的收集 • （四）免疫血清的分离纯化
三、动物采血
采集免疫血清前，要预先测试抗体效价测 定，若效价达到要求，应在末次免疫后一周 及时采血，否则抗体效价会下降。 ➢颈动脉采血法 ➢心脏采血法 ➢静脉采血法
四 抗体的分离和纯化技术
• 以理化性质提取均质的免疫球蛋白部分， 去除无关蛋白。
• 从免疫学角度提取与某特定抗原结合的特 异性抗体。用吸附抗原的免疫亲和柱进行 精细纯化。