利用In-Fusion技术构建存活素-增强型绿色荧光蛋白融合基因重组慢病毒表达载体

T细胞衔接活化因子-绿色荧光蛋白真核表达质粒的构建及其在Jurkat细胞的定位秦云;高美华;王冰;姬静;张蓓【期刊名称】《中国免疫学杂志》【年(卷),期】2013(029)005【摘要】目的:构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与T细胞衔接活化因子(Linker for activated ofT cells,LAT)融合蛋白的真核表达载体,观测LAT-EGFP在Jurkat细胞中的定位表达.方法:利用RT-PCR技术提取并扩增LAT除去终止密码子外的全部序列,克隆到真核表达载体PEGFP-N3,酶切鉴定并测序.瞬时转染到Jurkat细胞中进行表达,荧光共聚焦显微镜观察LAT-EGFP在Jurkat细胞中的表达及细胞定位.提取转染后细胞总RNA,通过RT-PCR的方法检测LAT-EGFP在转录水平的表达.利用Western blot法进一步鉴定融合蛋白的表达.结果:重组载体经酶切鉴定,切出片段长度在750 bp左右与插入序列长度相符,并进一步进行测序鉴定证实连接完全正确.共聚焦显微镜观察表达的LAT-EGFP融合蛋白定位在细胞膜上,并呈点簇状聚集状态.RT-PCR扩增证实了LAT和EGFP的融合蛋白在Jurkat细胞中在转录水平的表达,Western blot分析进一步证明了LAT和EGFP融合蛋白构建成功,并在蛋白水平上有明显的融合表达.结论:成功构建真核表达载体LAT-EGFP,且融合蛋白LAT-EGFP与野生型LAT在Jurkat细胞中的定位一致,具有功能表达效应,这为后续准确研究具有棕榈酰化位点的跨膜接头蛋白的信号转导作用提供了一种良好的研究载体和方法.【总页数】5页(P526-529,533)【作者】秦云;高美华;王冰;姬静;张蓓【作者单位】青岛大学医学院免疫学教研室,青岛266071;青岛大学医学院免疫学教研室,青岛266071;青岛大学医学院免疫学教研室,青岛266071;青岛大学医学院免疫学教研室,青岛266071;青岛大学医学院免疫学教研室,青岛266071【正文语种】中文【中图分类】R392.12【相关文献】1.β-连环素融合绿色荧光蛋白真核表达质粒的构建及表达 [J], 张爱红;徐雅飞;王建枝2.稳定表达绿色荧光蛋白的HEK293T细胞的构建 [J], 阳小飞;余意;刘孟雪;荣伊;林显光3.α2B-肾上腺素能受体与增强型绿色荧光蛋白标记的活化T细胞核因子2共表达稳转细胞株的构建 [J], 王震;李玉蕾;周培岚;苏瑞斌;傅风华4.尼罗罗非鱼绿色荧光蛋白/GH融合表达载体的构建及其在NIH293T细胞中的表达 [J], 王茂元;张平;邹芝英;李大宇;杨弘5.颗粒溶素活性肽与增强型绿色荧光蛋白融合基因真核表达质粒的构建及其在小鼠黑色素瘤细胞中的表达 [J], 何永林;朱道银;伊正君;杨春;徐蕾;王瑜伟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

人LIF基因与增强型绿色荧光蛋白融合表达载体的构建及转染林雪梅;李芳菲;姜蓉;王莎莉;王亚平【期刊名称】《西南大学学报：自然科学版》【年(卷),期】2007(29)3【摘要】目的:构建携带人LIF基因与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的融合表达载体,并转染人胚肺成纤维细胞,为研究LIF在维持人胚胎生殖细胞自我更新中的作用机制奠定基础.方法:以重组质粒pcDNA3.1/lif为模板,PCR扩增LIF基因,将扩增片断双酶切后连接到质粒pEGFP-Nl中,形成重组表达载体pEGFP-Nl/lif,并用脂质体法转染人胚肺成纤维细胞,荧光显微镜下观察,RT-PCR及Western杂交检测融合蛋白的表达.结果:成功构建融合表达载体pEGFP-N1/lif,在人胚肺成纤维细胞实现表达,检测到融合蛋白EGFP-LIF.结论重组pEGFP-N1/lif载体构建成功,可用于标记LIF 蛋白,为进一步研究LIF在维持人胚胎生殖细胞自我更新中的作用机制奠定基础.【总页数】4页(P134-137)【关键词】白血病抑制因子(LIF)基因;增强型绿色荧光蛋白;人胚肺成纤维细胞【作者】林雪梅;李芳菲;姜蓉;王莎莉;王亚平【作者单位】重庆医科大学组织学与胚胎学教研室重庆市生物化学与分子药理学重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R321.1【相关文献】1.增强型绿色荧光蛋白基因与轮状病毒VP6基因融合表达载体的构建及表达 [J], 潘小霞;张顺;袁静;文喻玲;陈元鼎2.增强型绿色荧光蛋白基因与人血管内皮生长因子受体KDR基因胞外1-3区域融合表达载体的构建 [J], 左玲;苏冠方;栾永昕3.利用In-Fusion技术构建存活素-增强型绿色荧光蛋白融合基因重组慢病毒表达载体 [J], 林朝贵;范林;陈良龙4.人B7-2和增强型绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建 [J], 路静;杨洪艳;赵军;黄幼田;赵国强;董子明5.增强型绿色荧光蛋白基因与hTIMP 1基因融合表达载体的构建及鉴定 [J], 徐昭;周丽娟;李广平因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

CXCL12-KDEL融合基因绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定岳恺;张文超;吴延升;曹晓莉;王旭东【期刊名称】《中国肿瘤临床》【年(卷),期】2010(037)010【摘要】目的:构建CXCL12-KDEL融合基因绿色荧光蛋白表达载体并鉴定其在人舌癌细胞株Tb3.1(以下简称Tb3.1)中的表达.方法:设计特定引物,以人基因组DNA 为模板,PCR扩增目的基因CXCL12-KDEL,经纯化的目的基因连接19T载体,插入pIRES2-EGFP表达载体中,使用Bgl Ⅱ/SalⅠ进行双酶切,酶切初步鉴定后,测序鉴定.测序正确的重组质粒经脂质体(LipofectamineTM 2000)介导体外转染Tb3.1,转染48h及72h在倒置荧光显微镜下观察.利用Western-blot检测重组质粒CXCL12-KDEL表达情况.结果:经酶切及测序鉴定证实目的基因(CXCL12-KDEL)已成功扩增并插入重组质粒;重组质粒转染Tb3.1细胞,倒置荧光显微镜下可见绿色荧光,Western-blot检测转染可见E-tag蛋白表达.结论:成功构建了CXCL12-KDEL 融合基因绿色荧光蛋白表达载体,为进一步完成CXCL12-CXCR4生物学轴的阻断实验奠定了基础.【总页数】4页(P550-553)【作者】岳恺;张文超;吴延升;曹晓莉;王旭东【作者单位】天津市肿瘤防治重点实验室,天津医科大学附属肿瘤医院头颈科,天津市300060;天津市肿瘤防治重点实验室,天津医科大学附属肿瘤医院头颈科,天津市300060;天津市肿瘤防治重点实验室,天津医科大学附属肿瘤医院头颈科,天津市300060;天津市肿瘤防治重点实验室,天津医科大学附属肿瘤医院头颈科,天津市300060;天津市肿瘤防治重点实验室,天津医科大学附属肿瘤医院头颈科,天津市300060【正文语种】中文【相关文献】1.利用In-Fusion技术构建存活素-增强型绿色荧光蛋白融合基因重组慢病毒表达载体 [J], 林朝贵;范林;陈良龙2.人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白融合基因慢病毒表达载体的构建 [J], 梁旭竞;陈小佳;金玲;李丽玲;汤绍辉;陈友鹏;杨冬华3.nm23-H1-绿色荧光蛋白融合基因真核表达载体的构建和表达 [J], 车国卫;周清华;刘伦旭;覃杨;孙芝琳4.单纯疱疹病毒胸苷激酶与绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建 [J], 吴映雅;谭宇蕙;宁异真;杜标炎;李杰芬5.原钙黏蛋白7b与绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建及其在MCF10A细胞中的表达定位 [J], 陈昂;袁龙;张峥嵘;梁剑青;闫敏;李世崇;王启伟;孙强;刘真真因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

第 44卷第6期2023 年11月Vol.44 No.6November 2023中山大学学报（医学科学版）JOURNAL OF SUN YAT‐SEN UNIVERSITY（MEDICAL SCIENCES）卵巢癌腹腔转移工具细胞的构建及其应用万里舟1，杜汝沛2，陈康梅3（1. 中山大学孙逸仙纪念医院基础与转化医学研究中心，广东广州 510120； 2. 华南理工大学生物医学科学与工程学院，广东广州 511442； 3. 中山大学孙逸仙纪念医院检验科，广东广州 510120）摘要：【目的】　构建稳定共表达荧光素酶（Luc）和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的人源卵巢癌细胞SKOV3（SK-Luc-EGFP）并探究其在卵巢癌腹腔转移的体内外研究中的应用。

【方法】　利用重叠PCR扩增得到的Luc-T2A-EGFP基因片段，构建重组质粒pCDH-Luc-T2A-EGFP-Puro；采用三质粒慢病毒包装系统转染HEK 293T细胞，收集病毒液感染SKOV3细胞；通过嘌呤霉素筛选，流式细胞术检测，筛选高效表达EGFP的细胞（SK-Luc-EGFP），并通过体外生物发光实验验证Luc的表达。

对SK-Luc-EGFP细胞进行如下应用的探究：利用流式细胞术和激光共聚焦区分SK-Luc-EGFP细胞与腹水微环境中的非肿瘤细胞，利用荧光显微镜观察SK-Luc-EGFP与间皮细胞的黏附，利用小动物活体成像仪观察SK-Luc-EGFP细胞的大网膜黏附以及体内成瘤的过程。

【结果】　成功构建慢病毒载体pCDH-Luc-T2A-EGFP-Puro；感染并筛选得到SK-Luc-EGFP单克隆细胞株。

通过荧光显微镜和流式细胞术均能检测到EGFP的表达，细胞纯度达100%；通过流式细胞术和激光共聚焦成像可直观辨别SK-Luc-EGFP细胞与腹水微环境细胞。

体外生物发光试验成功验证Luc的表达，且细胞数和生物发光信号的线性相关系数为0.997 9。

增强型绿色荧光蛋白与MAGE-n共表达载体的构建及表达黄亚渝;童卫;马加海;董海龙;叶菁;陈广生;张秀敏;隋延仿【期刊名称】《现代肿瘤医学》【年(卷),期】2006(14)7【摘要】目的:构建增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)与人黑色素瘤抗原-n(melanoma antigen n,MAGE-n)真核共表达载体,并在小鼠黑色素瘤B16细胞中进行表达.方法:采用酶切法从pLXSN-MAGE-n 中得到MAGE-n基因片段,克隆至真核表达载体pIRES2-EGFP中,构建真核共表达质粒pIRES2-EGFP-MAGE-n.用脂质体法转染小鼠黑色素瘤B16细胞,G418筛选阳性克隆,荧光显微镜检测阳性克隆中EGFP的表达,RT-PCR、Western blot和免疫组化分别检测阳性克隆中MAGE-n mRNA和蛋白的表达水平.结果:从pLXSN-MAGE-n重组质粒中酶切获得一条约950bp的片段,成功构建了真核共表达载体pIRES2-EGFP-MAGE-n,转染B16细胞后筛选得到阳性克隆,可见到EGFP的表达,产生明亮的绿色荧光,RT-PCR检测到MAGE-n mRNA的表达,Western blot和免疫组化检测到MAGE-n蛋白的表达.结论:成功构建了共表达质粒pIRES2-EGFP-MAGE-n,获得了稳定共表达EGFP和MAGE-n的小鼠黑色素瘤B16细胞系,为进一步研究MAGE-n在肿瘤免疫治疗中的作用奠定了基础.【总页数】4页(P783-786)【作者】黄亚渝;童卫;马加海;董海龙;叶菁;陈广生;张秀敏;隋延仿【作者单位】第四军医大学西京医院血液科,陕西,西安,710032;第四军医大学西京医院医教部教务科,陕西,西安,710032;第四军医大学基础部病理学教研室,陕西,西安,710033;第四军医大学基础部病理学教研室,陕西,西安,710033;第四军医大学基础部病理学教研室,陕西,西安,710033;第四军医大学基础部病理学教研室,陕西,西安,710033;第四军医大学基础部病理学教研室,陕西,西安,710033;第四军医大学基础部病理学教研室,陕西,西安,710033【正文语种】中文【中图分类】R730.3【相关文献】1.增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及其表达 [J], 刘华伟;张宏;孙超;王庆贺;宋艳瑞2.增强型绿色荧光蛋白基因与轮状病毒VP6基因融合表达载体的构建及表达 [J], 潘小霞;张顺;袁静;文喻玲;陈元鼎3.猪传染性胃肠炎病毒S与M基因融合表达载体及IRES连接双基因共表达载体的构建 [J], 贺小英;彭树英;杨瑞锋;张涌4.α2B-肾上腺素能受体与增强型绿色荧光蛋白标记的活化T细胞核因子2共表达稳转细胞株的构建 [J], 王震;李玉蕾;周培岚;苏瑞斌;傅风华5.增强型绿色荧光蛋白与肝细胞生长因子共表达载体的构建及表达 [J], 李兴升;王志刚;苏琳;任建丽;杨春江;郑元义;冉海涛;李攀因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

Eμ-VH 启动子调控 c-Myc 表达慢病毒载体的构建及其体外功能陈琳;陈燕;肖东【摘要】目的：构建人 B 淋巴细胞特异性启动子Eμ-VH 调控癌基因 c-Myc 表达的慢病毒载体（pEMIR），并探讨其体外功能。

方法以 pLV-c-Myc-IRES-增强绿色荧光蛋白（EGFP）为模板，经 PCR 扩增、酶切后得到 pEVCHR；以pEVCHR 为模板，PCR 扩增、酶切后得到慢病毒载体 pEMIR，并行测序和酶切鉴定。

将pEMIR 分别瞬时转染入人源胚胎肾细胞293T、人弥漫大 B 细胞淋巴瘤细胞株（OCL-Ly3、OCL-Ly10），倒置荧光显微镜检测各细胞 EGFP 和单体红色荧光蛋白（mRFP）的表达，用 qRT-PCR 法检测细胞内 c-Myc mRNA 表达，用Western blotting 法检测293T 细胞c-Myc 蛋白表达。

结果Eμ-VH-c-Myc-H2BmRFP 基因片段电泳结果与预测值4129 bp 相符，Vector DNA 电泳可见一条带与预测值8561 bp 相符；pEMIR 酶切并电泳的结果与理论预测值相符；对pEMIR 质粒进行测序，结果与预期相符，证明 pEMIR 构建成功。

三种细胞经pEMIR 转染后，倒置荧光显微镜下可见绿色和红色荧光，同时转基因c-Myc表达正常。

结论成功构建Eμ-VH 启动子调控 c-Myc 表达的慢病毒载体，体外实验证明该载体能够在人正常细胞和肿瘤细胞中均可发挥功能。

%Objective To construct a lentiviral vector harboring c-Myc gene under the control of human B lymphocyte-specific Eμ-VH promoter (pEMIR),and to investigate its function.Methods Firstly,taking pLV-c-Myc-IRES-EGFP as a template,after PCR amplification and enzyme digestion,we got pEVCHR.Secondly,taking plasmid pEVCHR as a tem-plate,after PCR amplification and enzyme digestion,we got a lentiviral vector pEMIR.pEMIRwas transiently transfected into human embryonic kidney cells 293T and human diffuse large B-cell lymphoma cell line (OCL-LY3 or OCL-LY10). The expression of enhanced green fluorescent protein (EGFP)and mono-red fluorescence protein (mRFP)was detected under inverted fluorescence microscope,and the expression of c-Myc mRNA and protein was detected by qRT-PCR and Western blotting.Results The electrophoresis results ofEμ--VH-c-Myc-H2BmRFP gene fragment were in agreement with the predicted value of 4129 bp,and the electrophoresis of the vector DNA showed a band that was consistent with the pre-dicted value of 8561 bp.Enzyme digestion and DNA sequencing demonstrated that pEMIR was successfully constructed. Cells transiently transfected with pEMIR displayed the green and red fluorescence under inverted fluorescence microscope, and the expression of c-Myc was normal.Conclusion The lentiviral vector harboring c-Myc gene under the control of Eμ-VH promoter is successfully constructed,and the experiments in vitro demonstrate that it can be expressed in human normal cells and tumor cells.【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2016(056)021【总页数】3页(P1-3)【关键词】Eμ-VH启动子;c-Myc癌基因;慢病毒载体;弥漫大B细胞淋巴瘤【作者】陈琳;陈燕;肖东【作者单位】南方医科大学，广州 510515;南方医科大学，广州 510515;南方医科大学，广州 510515【正文语种】中文【中图分类】R394目前，用于肿瘤研究的动物模型绝大多数是基于遗传工程的小鼠［1］，极度缺乏人类肿瘤大动物模型。

NK4基因重组慢病毒载体的构建及在肝癌细胞中的表达李霏，李松林，尹元琴（中国医科大学附属第一医院肿瘤研究所，沈阳１１０００１）摘要目的构建共表达人NK4基因和增强型绿色荧光蛋白（EGFP ）基因的重组慢病毒载体，转染人高侵袭转移肝癌细胞LM3（HCCLM3），观察其转染效率及表达情况。

方法采用DNA 重组技术，将NK4基因克隆至带EGFP 的慢病毒表达载体pLenti6.3-内部核糖体进入位点序列（IRES ）-EGFP 中，并用脂质体介导法将慢病毒包装系统和带NK4基因的质粒pLenti6.3-NK4-IRES -EGFP 共转染293T 细胞，包装慢病毒并测定滴度。

以不同感染复数（MOI ）的重组慢病毒感染293T 细胞，筛选最适MOI ，以最适MOI 重组慢病毒感染HCCLM3细胞，观察转染效率。

Western blot 法测定细胞中NK4蛋白表达水平。

结果成功构建共表达NK4基因和EGFP 基因的慢病毒载体pLenti6.3-NK4-IRES -EGFP ，并对其包装、纯化及浓缩后测定病毒滴度为1.08×108TU/mL 。

重组慢病毒感染HCCLM3细胞筛选其最适MOI 为7。

转染后HCCLM3细胞中可见明显的NK4蛋白表达，而未转染细胞中无NK4蛋白的表达。

结论成功构建了NK4基因的重组慢病毒载体，有效地转染HCCLM3细胞后可高表达NK4蛋白。

关键词NK4；慢病毒载体；人高侵袭转移肝癌细胞LM3；基因转染中图分类号R73文献标志码A文章编号0258-4646（2011）12-1081-04doiCNKI:21-1227/R.20111226.1615.028网络出版地址/kcms/detail/21.1227.R.20111226.1615.028.htmlConstruction of NK4Recombinant Lentiviral Vector and Its Expression in HCCLM3Cells 肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma ，HCC ）是世界上常见的恶性肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤发病率的第5位［1］。