综述：无缝克隆与基因融合(中文版)

HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒使用说明（基于Gibson Assembly 原理，原理附后）一、产品简介HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒是一种新型、快速并且高效的Gibson Assembly DNA 定向克隆技术，可以在任意载体的任意位置一次插入多个目的基因片段。

HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒操作极其简单，仅需在载体的克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR 引物的5’端引入与载体克隆位点两端完全一致的15~25 bp 同源序列（图1，图3）。

将上述线性化的克隆载体和带有同源序列的PCR 片段按合适比例混合，并加入HB-infusion TM Master mix，通过反应体系中DNA 外切酶、DNA 聚合酶以及连接酶的在50℃反应20 min 即可快速完成定向克隆，阳性率几近100%。

图1. HB-infusion TM 快速克隆试剂盒原理示意图。

1. 线性化目的载体（左上）；2. PCR 获取目的片段。

设计的引物５’需要和线性化载体末端有15~25 bp 的重叠（图中蓝色和黄色片段，细节可参考图3）；3. 按照一定比例把二者混合在HB-infusion TM 的2预混液内，50 C 反应20 min 后直接转化E.coli 即可。

二、HB-infusionTM 试剂盒的优点1. 相比于传统的同源重组的无缝克隆方法进行，HB-infusion TM 试剂盒更高效，操作更简单，只需要一次反应即可完成定向克隆；2. 对酶切位点无要求，可以把目的片段插入到任意载体的任意位点；3. 连接片段之间不会引入任何其他序列；4. 可以同时克隆多个片段。

三、产品包装产品组成使用次数体积2 x HB-infusion TM Master mix 20 tests 200 lPositive linearized pUC vector （250 ng） 5 tests 25 lPositive control insert (500 ng) 5 tests 25 l储存条件-20 ℃四、使用说明汉恒生物建议2-3 个片段连接时，DNA 片段的使用总量为0.02~0.5 pmols，4~6 片段连接时加入的DNA 总量为0.2~1.0 pmols。

重组DNA新方法：无缝克隆1、传统的重组DNA技术基本过程：目的DNA克隆、质粒提取→双酶切→电泳分离及凝胶回收酶切片段→连接。

传统的方法弊端•耗时、费力，操作步骤多，一般3天左右•外源基因插入受酶切位点限制•效率低•不能对多个基因片段进行连接2、无缝克隆（seamless cloning/in fusion cloning)•PCR引物由载体末端目的基因末端构成，各15-20bp。

•通过酶去除PCR产物和载体同源片段的一股链，暴露出相互配对的单链序列，同源配对形成环状重组体。

反应条件无缝克隆反应体系1、DNA 外切酶2、高保真DNA 聚合酶3、耐热的DNA 连接酶50℃ 保温15min反应酶系无缝克隆过程•T5外切酶消化DNA片段(5’-3’)形成单链突出部分•退火，可使互补序列配对连接•PCR扩增填补缺口及DNA连接•形成连接的重组DNA无缝克隆重要环节载体线性化：2种方式高保真pfu酶PCR扩增酶切引物设计•正向引物：线性载体正向15-25nt序列+基因正向引物（20-25nt)•反向引物：线性载体反向15-25nt序列+基因反向引物（20-25nt)引物设计3、多片段同步克隆案例将IL-2分泌信号序列与CD101胞外域序列和鼠IgG3的可结晶片段进行融合，构建无缝融合蛋白IL-2 signal-CD101-Fc。

3、多片段同步克隆多片段连接应用实例•引物设计并扩增IL-2 信号肽，CD101和鼠IgG3无缝克隆的优点•简便、快速、高效的克隆技术•不附加任何多余序列•不受限制性内切酶位点限制•时间短（仅需15min)•操作流程更加简便•可以同时克隆两个或多个DNA片段。

gibson 无缝克隆原理
Gibson无缝克隆技术是一种常用的基因工程技术，其原理基于DNA的自由组装性。

该技术的首要目的是为了方便构建基因组DNA片段的无缝连接，从而实现对生物基因的研究。

Gibson无缝克隆技术通过引入具有互补序列的引物，使DNA 片段在一定条件下发生自由组装，形成完整基因组DNA。

其中关键的引物为OA (overlap assembly)序列引物，用于引导参与反应的DNA片段在互补序列的结合作用下发生圆化和异源互补配对。

在反应中，DNA的两端通过异源互补同向配对，并以核酸酶的作用下实现剪切，形成新的连接，最终得到全长连续的DNA片段，从而实现基因克隆。

相比于传统的限制性内切酶克隆或PCR克隆等技术，Gibson 无缝克隆技术不仅具有操作简便、操作时间短的优点，而且避免了错误的重组或质粒多聚等不良反应，可满足越来越高的克隆质量要求。

无缝克隆与基因融合基因融合技术是基因功能研究的关键工具。

准确拼接的杂合分子，没有任何无关的序列，使我们可以对分子进行精确的研究。

本篇综述介绍了无缝融合基因和蛋白的应用，以及获得这些杂交分子的方法前言随着各种基因组测序项目的完成，人们越来越关注基因产物的功能分析。

基因融合技术在基因功能研究的许多方面具有重要的作用，包括基因和蛋白标记，报告基因的研究，结构域互换研究，突变研究和基因敲除或者插入实验。

传统的基因融合技术涉及到type II 限制酶消化和DNA连接反应（所谓的剪切/粘贴反应），曾被用来作为构建杂交基因的标准方法。

然而，这种方法常常会在接合处留下操作的序列，例如酶切位点。

这些多余的序列可以改变DNA元件的间隔，在接合处引入多余的氨基酸残基，可能对融合蛋白的结构和功能产生不需要的影响，因此影响对融合基因精确的研究。

这篇综述讨论了精确融合基因的应用之处，概括了实现无缝基因融合的方法。

无缝基因融合及其应用无缝克隆和基因融合就是将两个或者更多DNA片段精确结合在一起，在DNA片段的接合处没有任何不需要的序列。

这是获得杂交基因的理想情况。

以下强调几个例子，以表明无缝基因融合的重要性。

启动子和外显子研究基因启动子含有许多调控元件。

转录因子与它们结合并互相影响来调控转录。

启动子删除分析使我们鉴定到这些功能元件，获得关于基因调控机制的重要信息。

然而，因为不同调控元件之间的间隔常常是非常重要的，通常需要长度不变的linker来维持这些元件的间隔和螺旋面。

基因启动子的linker扫描分析需要无缝DNA融合或者序列替换技术。

分子演化方法例如外显子和DNA转移来获得具有需要生化和/或生理特征的蛋白也需要不同功能元件的无缝拼接。

在真核细胞中，通过内含子介导的RNA拼接可以构建嵌合体基因和/或蛋白。

在这些实验中RNA底物的合成和/或外显子标记核酶需要认真的设计，得到嵌合体前体基因。

只要杂合基因形成正确，无缝融合就可以通过拼接实现。

gibson 无缝克隆原理
Gibson无缝克隆原理是一种基于DNA合成技术的高效、快速、准确的DNA克隆方法。

其原理是通过设计一组特定序列的引物，将目标 DNA 片段在 vitro 中无缝连接起来。

该技术相对于传统的限制性酶切和连接方法，具有更高的准确性和效率，并且不需要使用外源酶切和连接酶。

Gibson 无缝克隆技术的核心是利用“重叠扩增”（overlap extension）原理实现 DNA 片段的无缝连接。

通过设计引物，使得目标 DNA 片段中的两端存在一定长度的重叠区域，然后在 vitro 中加入一个含有 DNA 聚合酶、DNA 聚合酶扩增因子、DNA 切除酶和DNA 连接酶的反应体系，利用 DNA 重组酶将两端的重叠区域连接起来形成完整的 DNA 片段。

这个过程不需要任何外源酶切和连接酶，因此可以完全避免由于酶切位点限制或酶切产生的不兼容性问题。

Gibson 无缝克隆技术在 DNA 克隆、基因组编辑和合成生物学等领域得到了广泛应用，其优点包括高效、快速、准确、无需外源酶切和连接等。

同时，该技术也存在一些局限性，如对 DNA 片段长度的限制和反应体系组分的优化等。

随着技术的不断发展和完善，Gibson 无缝克隆技术将在基因编辑和合成生物学等领域发挥越来越重要的作用。

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无缝克隆：科幻变成现实
无缝克隆，是指通过高科技手段复制出一个完全与原本一模一样
的人或动物。

人们经常把无缝克隆比作科幻电影中的情节，但事实上
它已经变成了现实。

那么，无缝克隆的原理是什么呢？
无缝克隆，其实就是基因克隆的一种方式。

科学家通过取得原始
体细胞，将其核转移到一枚空卵细胞中，再用电流刺激使其分裂，最
后培育出克隆胚胎。

将克隆胚胎植入到代孕母体的子宫中，经过一段
时间的发育，就能够诞生一个与原本完全一模一样的个体。

虽然无缝克隆的成功率越来越高，但是依然存在一些问题。

首先，无缝克隆会对原始体的健康产生一定的影响，因为取出的细胞大多数
都已经受过损伤。

其次，克隆出来的个体存在基因缺陷的风险，这是
因为基因的复制会出现一定的误差。

最后，无缝克隆存在伦理道德上
的争议，尤其是当它被用于复制人类时。

尽管存在这些问题，但无缝克隆的应用还是非常广泛的。

在动物
领域，它已经被成功应用于繁殖某些濒危物种，从而有效保护了这些
物种的基因资源。

同时，无缝克隆还可以为医学研究提供更为有效的
模型，以探究某些遗传疾病的发生原理。

如果说无缝克隆的应用前景已经展现了出来，那么问题来了，它
是否会走向人类领域呢？答案或许不久后就能揭晓，但我们无论如何
都应该明确一点：科技的发展虽然带来了诸多便利，但我们也应该恪
守舆论监督、伦理标准等各项底线，一步一步走向更加美好的未来。

无缝克隆的基本原理1. 介绍无缝克隆（seamless cloning）是一种图像处理技术，用于将源图像的一部分无缝地叠加到目标图像中，使其看起来像是原本就存在的一部分。

这种技术常用于图像修复、风格迁移、图像合成等应用中，能够产生非常逼真的效果。

无缝克隆的基本原理是通过计算图像的梯度信息来实现的。

梯度表示图像的颜色强度变化率，是图像中最容易引起人眼注意的信息之一。

通过控制源图像和目标图像的梯度一致性，在源图像和目标图像的边界处产生平滑的过渡，从而使得两者的拼接看起来无缝连接。

2. 梯度计算在进行无缝克隆之前，首先需要计算源图像和目标图像的梯度信息。

通常使用梯度算子（如Sobel算子）来对图像进行卷积运算，以获取梯度信息。

梯度算子会计算每个像素点周围像素的颜色强度差异，从而得到一个梯度向量。

梯度向量的大小和方向可以通过计算各个方向上的梯度值来表示。

3. 选取源和目标区域在进行无缝克隆之前，需要在目标图像中选取一个目标区域，并在源图像中选取一个对应的源区域。

目标区域是我们希望将源区域无缝叠加到的位置，源区域是我们希望复制到目标图像中的区域。

4. Alpha混合Alpha混合是无缝克隆的核心步骤，用于将源区域与目标区域进行融合。

Alpha通道代表对应像素的透明度，取值范围为0到1，其中0表示完全透明，1表示完全不透明。

通过调整Alpha通道的值，可以实现像素的透明与不透明之间的过渡。

在进行Alpha混合时，需要根据源区域和目标区域的梯度信息来调整Alpha通道的值。

具体方法是将目标区域中每个像素的Alpha通道取值与源区域中对应像素的Alpha通道取值进行加权平均。

权重的计算根据源像素与目标像素之间的梯度差异来决定，梯度差异越小，权重越大，反之权重越小。

5. 感兴趣区域（ROI）感兴趣区域是指图像中特定部分的区域，通常是在进行图像处理时所关注的区域。

在无缝克隆中，感兴趣区域是指目标区域和源区域的边界。

无缝克隆技术的原理文献
无缝克隆技术（Seamless Cloning）是一种先进的基因克隆技术，其原理基于同源重组。

该技术利用同源序列将外源DNA片段精确地插入到载体DNA的特定位置，实现无缝拼接。

在无缝克隆过程中，首先需要构建一个含有目标DNA片段的载体，该载体通常是一个具有同源臂的质粒或噬菌体。

同源臂是位于载体DNA两端与目标DNA片段具有相同或相似碱基序列的DNA片段，其长度通常在几十到几百碱基对之间。

然后，将目标DNA片段与载体DNA在体外进行同源重组，生成重组DNA分子。

同源重组的效率取决于同源臂的长度、互补性以及是否存在促进重组的酶。

如果同源臂的长度足够长且互补性好，同源重组的效率就会很高。

最后，将重组DNA分子导入到宿主细胞中，并在宿主细胞内进行筛选和扩增，最终获得含有目标DNA片段的无缝克隆。

无缝克隆技术的优点在于其高效率和精确性，可以避免传统基因克隆方法中可能出现的错配和突变等问题。

此外，该技术还可以用于定点突变、基因敲除和基因敲入等基因编辑操作，因此在基因工程、基因治疗和合成生物学等领域具有广泛的应用前景。

请注意，无缝克隆技术需要精确的设计和操作，以确保同源臂的正确匹配和重组的成功。

此外，由于该技术涉及到基因操作，因此需要遵守相关的伦理和法规规定。

简介（INTRODUCTION）原理：Gibson assembly是一种one step, one pot的快速基因组装方法。

它只需要将基因片段和需要的三种酶混合在同一个管内在50°C下培养15-60 min就可以得到组装好的DNA。

装配原理基于DNA片段间的重叠区域，过程依赖于三种酶：DNA 外切酶（T5 exonuclease）,高保真DNA聚合酶。

（Phusion polymerase）和耐热DNA连接酶（Taq DNA ligase）的共同作用。

首先，T5 核酸外切酶消化DNA片段的链方向是从5’到3’. 每个DNA片段分别形成一个单链的突出部分，由于着这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补，所以DNA片段退火，互补的序列重新配对连接。

然后，在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA 单链为模板，沿3' 方向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上，填补缺口。

最后，连接酶将两条DNA 单链黏合起来，密封裂缝。

这样具有重叠区域的DNA片段就组装成一整条DNA分子了。

下面是组装的示意图。

材料（MATERIALS）试剂（REAGENTS）NAD，H2O ，1 M MgCl2，1 M DTT，10 mM dNTP mix，1 M Tris-HCl pH 7.5，50% PEG-8000，2.7 mg/ mL Tag ligase，0.85 μg/ mL T5_ExO，Phusion(1×)、LB培养基、抗生素（据载体而定）、LB平板（相应抗性）实验前准备（SETUP）于冰水浴中配制如下反应体系。

如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。

4x isothermal assembly bufferNAD 20 mgH2O 300 μL1 M MgCl2300 μL1 M DTT 300 μL10 mM dNTP mix 600 μL1 M Tris-HCl pH 7.5 3 mL50% PEG-8000 3 mL加水到7.5 mL，每管分500 μL存于-20°C 或-80°C冰箱,够3000个反应2× assembly mix: best combination:100 reaction 1 mL2.7 mg/ mL Tag ligase 10 μL0.85 μg/ mL T5_ExO 100 μLPhusion(1× ) 25 μL4× G.A. buffer 500 μL加水365 μL，存于-20°C冰箱，有效期1年。

G i b s o n a s s e m b l y简介（INTRODUCTION）原理：Gibson assembly是一种one step, one pot的快速基因组装方法。

它只需要将基因片段和需要的三种酶混合在同一个管内在50°C下培养15-60 min就可以得到组装好的DNA。

装配原理基于DNA片段间的重叠区域，过程依赖于三种酶：DNA 外切酶（T5 exonuclease）, 高保真DNA聚合酶。

（Phusion polymerase）和耐热DNA连接酶（Taq DNA ligase）的共同作用。

首先，T5 核酸外切酶消化DNA片段的链方向是从5’到3’. 每个DNA片段分别形成一个单链的突出部分，由于着这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补，所以DNA片段退火，互补的序列重新配对连接。

然后，在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA单链为模板，沿3' 方向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上，填补缺口。

最后，连接酶将两条DNA 单链黏合起来，密封裂缝。

这样具有重叠区域的DNA片段就组装成一整条DNA分子了。

下面是组装的示意图。

材料（MATERIALS）试剂（REAGENTS）NAD，H2O ，1 M MgCl2，1 M DTT，10 mM dNTP mix，1 M Tris-HCl pH ，50% PEG-8000，mg/ mL Tag ligase，μg/ mL T5_ExO，Phusion(1×)、LB培养基、抗生素（据载体而定）、LB平板（相应抗性）实验前准备（SETUP）于冰水浴中配制如下反应体系。

如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。

4x isothermal assembly bufferNAD 20 mgH2O 300 μL1 M MgCl2300 μL1 M DTT 300 μL10 mM dNTP mix 600 μL1 M Tris-HCl pH 3 mL50% PEG-8000 3 mL加水到mL，每管分500 μL存于-20°C或-80°C冰箱,够3000个反应2× assembly mix: best combination:100 reaction 1 mLmg/ mL Tag ligase 10 μLμg/ mL T5_ExO 100 μLPhusion(1× ) 25 μL4× . buffer 500 μL加水365 μL，存于-20°C冰箱，有效期1年。