融合蛋白表达载体的构建

拟南芥转录因子TDF1的原核表达及多克隆抗体制备周茜;曹志林;俞俞;杨仲南【摘要】在拟南芥花药发育过程中,MYB家族转录因子TDF1在调控绒毡层发育及后期功能上起到关键的作用.利用PCR方法扩增TDF1基因并克隆到原核表达载体pET-32a.将表达载体TDF1-pET32a转入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG成功诱导表达了分子量约为56KD的TDF1融合蛋白.该融合蛋白主要以包涵体形式存在,分离出包涵体后进行可溶性处理作为抗原免疫家兔.制备出的多克隆抗血清经ELISA 测定效价为1∶2560,Western blot检测表明该抗血清与TDF1融合蛋白识别良好.TDF1抗体的制备有助于进一步从生化水平上研究TDF1在花药发育中的功能.【期刊名称】《上海师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(039)002【总页数】6页(P175-180)【关键词】原核表达;拟南芥;转录因子;TDF1;融合蛋白;多克隆抗体【作者】周茜;曹志林;俞俞;杨仲南【作者单位】上海师范大学,生命与环境科学学院,上海,200234;河南工程学院,资源与环境学院,郑州,451191;上海师范大学,生命与环境科学学院,上海,200234;上海师范大学,生命与环境科学学院,上海,200234【正文语种】中文【中图分类】Q511转录因子是指与靶基因启动子中的顺式作用元件发生特异性相互作用，并对转录过程起激活或抑制作用的DNA结合蛋白.MYB家族转录因子以保守的DNA结合域为共同特征，是植物最大的转录因子家族之一，R2R3-MYB转录因子是植物中数目最多的一类MYB蛋白，其N-端都含有包含2个重复的螺旋-转角-螺旋的R2R3 DNA结合结构域［1，2］.花药是植物的雄性生殖器官，是花粉发育的场所.绒毡层在花药发育过程中起着至关重要的作用，它释放酶复合物降解胼胝质，提供花粉发育所必需的营养物质，并参与调控花粉外壁的形成［3］.TDF1基因编码了一个拟南芥细胞核定位的R2R3-MYB家族转录因子.在花药发育早期，该转录因子特异性地在绒毡层，花粉母细胞和小孢子中高效表达.该基因突变，绒毡层发育异常，其功能出现紊乱，导致花粉不能形成，突变体呈雄性不育表型［4］.但是在生化水平上，TDF1在花药发育中的具体功能还不清楚.抗体的制备是在生化水平上研究蛋白质功能的一个重要途径.根据制备的原理和方法，抗体可分为多克隆抗体，单克隆抗体和基因工程抗体，其中多克隆抗体的制备方法比较成熟，过程简单，因此被广泛应用.由于一种抗原有多个不同的抗原决定簇，B淋巴细胞克隆可以识别每一个抗原决定簇，并产生出针对它们的抗体，因此这种异种免疫血清中含有的抗体是多克隆抗体［5］.利用原核表达的蛋白免疫动物来制备多克隆抗体是一种十分有效的方法.在本研究中，克隆获得TDF1基因，并构建了原核表达载体TDF1-pET32a，将其转入大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG 诱导后在原核细胞中成功表达了这个蛋白.该融合蛋白主要以不溶的包涵体形式表达，以洗涤纯化溶解后的包涵体作为抗原免疫家兔，制备出了效价较高，特异性较强的多克隆抗体，这些工作为进一步用生化手段研究该转录因子的DNA结合位点和下游基因奠定了基础.1.1 试剂和材料1.1.1 质粒与菌株pMD18-T载体购自大连宝生物工程（TaKaRa）有限公司；原核表达载体pET-32a（+）购自北京鼎国生物技术有限公司；大肠杆菌感受态菌株DH5α及BL21（DE3）由本实验室提供.1.1.2 生物学试剂T4 DNA连接酶、限制性内切酶Sac I、Xho I和Prjmestar DNA聚合酶购自大连宝生物工程（TaKaRa）有限公司；福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂、dNTPs、PCR产物回收试剂盒、Trjs、SDS、TEMED及IPTG等常用分子生物学试剂购自北京鼎国生物技术有限公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG、ECL化学发光检测试剂盒、PVDF膜购自艾比玛特生物医药（上海）有限公司；引物由Invjtrogen公司合成.1.2 方法1.2.1 TDF1基因的克隆参照GenBank中序列设计用于扩增TDF1基因的引物.上游引物序列为TDF1F∶5′-AAGAGCTCATGGGAAGACCTCCTTGTTG-3′，含有Sac I位点；下游引物序列为TDF1R∶5′-AACTCGAGATAATCGAAATCATTCAAGAGTTGA-3′，含有Xho I位点.以实验室现有的含TDF1基因的质粒［4］作为PCR模板.PCR反应体系为∶10×buffer 5×10-6L，dNTP Mjxture 5×10-6L（0.0025 mol/L），引物各1.5×10-6L（0.01 mol/L），模板1×10-6L，Prjmestar DNA聚合酶1×10-6L，去离子水补充体积至5×10-5L，反应条件为2步法∶94℃变性30 s，62℃退火及延伸1 mjn，35个循环；72℃10mjn.经琼脂糖凝胶电泳后，回收扩增产物，连接到pMD18-T载体（步骤参照TaKaRa公司说明书），转化至E.coli DH5α中，涂布于含氨苄青霉素（100 mg/L）的LB固体培养基上，37℃培养过夜.筛选出克隆后，挑取单菌落，提取质粒，用Sac I、Xho I限制性内切酶进行双酶切鉴定，将鉴定正确的克隆进行测序（上海桑尼公司）.1.2.2 原核表达载体TDF1-pET32a的构建上述重组质粒TDF1-T用Sac I，Xho I于37℃消化5 h，经琼脂糖凝胶电泳，回收的TDF1片段与同样用Sac I，Xho I酶切的pET-32a载体进行连接，转化入感受态E.coli DH5α中，涂布于含氨苄青霉素（100 mg/L）的LB固体培养基上.挑取单菌落培养后抽提质粒，进行PCR和双酶切鉴定，保存重组质粒.1.2.3 融合蛋白的诱导表达及可溶性分析鉴定正确的TDF1-pET32a质粒与空载体pET32a（阴性对照）分别转化表达菌株E.coli BL21（DE3）感受态，涂在含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜.挑取TDF1-pET32a和pET32a各一个单菌落分别于1 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜.各取5×10-5L菌液转至5 mL含氨苄青霉素的LB液体培养基中，置37℃振荡培养2～4 h，至0D600为0.5～1.0，各取1 mL菌液放入离心管中，高速离心1 mjn，收集细菌沉淀（未经IPTG诱导）.剩余的菌液加入IPTG，至终浓度为0.001 mol/L进行蛋白诱导，在1 h，2 h，3.5 h，5 h 分别收集1 mL菌液，并测定其0D值，高速离心1 mjn，收集细菌沉淀.每管细菌沉淀按0D值大小加入适量的1×SDS蛋白加样缓冲液，置于100℃煮沸3 mjn，离心后取上清于12%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳［6］.融合蛋白可溶性分析∶1 mL诱导菌液离心后，加入5×10-5L PBS重悬菌体，然后用液氮反复冻融十次，离心后分别收集上清跟沉淀，沉淀再以5×10-5L PBS重悬，进行SDS-PAGE电泳，分析融合蛋白是以包涵体还是可溶蛋白形式存在.1.2.4 包涵体蛋白的可溶性处理及抗原制备包涵体蛋白的可溶性处理参照Kjrubakaran等［7］的方法，将包涵体用3倍体积的洗涤缓冲液（0.01 mol/L Trjs-HCl，pH 7.5，0.3 mol/L NaCl，0.001 mol/L EDTA，1%Trjton X-100和1 mol/L urea）清洗三次，每次4℃10000转离心10 mjn，然后包涵体沉淀溶解于10倍体积的溶解缓冲液（0.05 mol/L Trjs-HCl，pH 7.8；0.005 mol/L MgCl2；0.0025 mol/L 2-mercaptoethanol；0.1%（w/v）Tween 20；8 mol/L urea），在室温下孵育1 h.抗原制备∶纯化溶解后的包涵体上样进行SDS-PAGE电泳，PAGE胶用考马斯亮兰染色液染20 mjn后，再用脱色液脱色干净.用刀片切下56KD处的目的条带，放在干净的离心管中，加适量的PBS溶液，用磨棒碾碎备用.1.2.5 多克隆抗体制备及效价鉴定抗体制备∶取1 mL碾碎的包含抗原的PAGE胶与1 mL弗氏完全佐剂混匀后对成年健康家兔进行背部多点皮下注射，10 d后用相同的碾碎的样品与1 mL弗氏不完全佐剂混匀，注射家兔.相同的实验再重复两次（后两次不加弗氏不完全佐剂），每次间隔10 d.最后一次注射一周后，对被免疫的兔子进行心脏取血，血液放37℃温育1 h，然后放4℃过夜，析出的血清加叠氮钠，分装后-20℃保存.用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测抗体效价，免疫后的兔抗血清用PBS逐一按2倍稀释分别加入已包被抗原的反应孔中，以PBS做为阴性对照，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体（1∶5000），用底物TMB显色，2 mol/L H2S04终止反应.用酶标仪在A450测定吸光值.1.2.6 Western blot检测Western blot检测∶将样品蛋白进行SDS-PAGE电泳后，经电转仪转移到PVDF 膜上.将膜用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭1.5 h，清洗后加入按1∶200稀释于TBST中的兔多克隆抗体，在摇床放置1 h，以TBST清洗一抗1 h，每15 mjn 换一次清洗液.再加稀释于TBST中的HRP标记的羊抗兔IgG（1∶10000），在摇床放置1 h，TBST清洗二抗1 h，每15mjn换一次清洗液.洗膜后加ECL工作液，在可见光下室温孵育膜数分钟，将印迹膜用保鲜膜包被粘贴固定于X光片曝光暗盒.然后转入暗室将X光胶片压在膜上曝光数秒，显影定影于X光胶片上.2.1 TDF1融合蛋白表达载体的构建以前期工作中构建的含有TDF1基因的质粒［4］为模板，利用上述引物，在高保真PrjmeStar聚合酶的作用下经PCR扩增得到大小为951 bp的TDF1基因（图1-A）.随后，将获得的TDF1基因克隆到pMD18-T载体，得到过渡载体TDF1-T.经限制性内切酶Sac I/Xho I消化后，电泳结果表明TDF1已成功克隆入pMD18-T（图1-B）.利用T载体上的M13通用引物进行测序分析，结果表明目的片段序列与Genbank数据库序列吻合.为了获得大量的TDF1蛋白，采用了原核表达的载体pET-32a（+）进行蛋白表达实验.用限制性内切酶Sac I和Xho I将过渡载体中TDF1片段切下后，将其克隆入pET-32a（+），转化E.coli DH5α感受态后的重组质粒用限制性酶切鉴定可以看到一条大约951 bp的条带（图1-C），测序结果表明目的基因TDF1位于正确的读码框中，获得了原核表达质粒TDF1-pET32a.将构建好的TDF1-pET32a及作为阴性对照的pET32a空载体转化入表达菌株E.coli BL21（DE3）感受态中，PCR鉴定显示TDF1-pET32a含有目的基因片段（图1-D）.2.2 TDF1融合蛋白的原核表达预期的TDF1蛋白分子量为35.8KD［4］，pET32a质粒所带标签蛋白（Trx-Tag，Hjs-Tag及S-Tag）分子量为20.4KD（图2 B2），所以表达的TDF1与标签蛋白融合后分子量约为56.2KD.按照材料与方法中所述步骤进行蛋白诱导表达实验，SDS-PAGE电泳结果显示，诱导1 h，2 h，3.5 h及5 h后，在56.2KD处可见TDF1重组蛋白的条带（图2 A2～A5）.此外，TDF1的蛋白表达量随诱导时间延长而逐渐增加（图2 A2～A5），表明TDF1重组蛋白能够在原核中稳定表达.2.3 融合蛋白可溶性分析SDS-PAGE电泳结果显示，诱导菌经液氮反复冻融后，上清液里几乎没有目的融合蛋白，而融合蛋白大部分都存在沉淀中，故诱导表达的TDF1重组蛋白主要是以不溶的包涵体形式表达（图3-3，3-4）.对包涵体进行洗涤纯化和溶解后，可以看到大部分的杂蛋白已被去除（图3-5），切胶富集融合蛋白包涵体后用于抗体制备.2.4 抗体的制备与检测溶解后的融合蛋白包涵体进行SDSPAGE电泳，切下的含有目的蛋白的PAGE胶碾碎后分4次注射家兔后，对家兔进行心脏取血，血液经37℃温育后，低温放置过夜析出多克隆抗血清.多抗经ELISA实验测定效价，因底物是TMB，故用酶标仪在A450测定吸光值.计算样本0D值与对照0D值的比值P，P大于等于2.1为阳性，小于2.1大于1.6为可疑，小于1.6为阴性.实验数据见表1，当抗血清稀释至2560倍的时候，P值为2.6，为阳性，稀释到5120倍的时候，P值为1.6，结果不可信，而稀释到更高倍数时，P值小于1.6了，表现为阴性.故实验结果表明抗血清效价为1∶2560.为了进一步分析获得的抗体对TDF1蛋白的识别，用Western blot技术检测抗体.杂交后经HRP标记的羊抗兔显色试剂盒显色，用X光胶片显影，在胶片上可在目的蛋白56.2KD处看到清晰的条带，这表明多克隆抗体与目的蛋白识别良好（图4）.本研究利用分子生物学技术克隆了TDF1基因，并逐步构建到原核表达载体pET32a中.诱导表达结果显示，构建的原核表达载体TDF1-pET32a经IPTG诱导后，TDF1融合蛋白以包涵体的形式得到了高效稳定的表达.产生的包涵体是高密度，不溶性的蛋白表达产物，它的形成使目的蛋白的分离纯化变得更为容易.先前的研究表明，包涵体经过洗涤后可以去除可溶的，粘附的细菌蛋白.多数情况下，调整洗涤的条件可使包涵体中外源蛋白的纯度达到90%以上，从中提取的蛋白可以直接用作抗原［6］.故而在本实验中将包涵体先用含1 mol/L尿素的缓冲液清洗多次，尽可能除去菌液中含有的可溶性的杂蛋白，清洗后的包涵体再用含8 mol/L浓度尿素的缓冲液在室温下溶解，这样处理后的包涵体内外源蛋白被溶解，离心后存在于上清里.经SDSPAGE电泳后可以看到大部分杂蛋白已经被去除，用刀片切下56KD左右的目的蛋白可以做为抗原免疫家兔.对获得的多克隆抗血清经Western blot技术检测，结果显示制备的抗体与目的蛋白识别良好.R2R3-MYB转录因子广泛参与植物次生代谢调控、激素和环境因子的应答，并对细胞分化、器官的形成、植物叶片的形态建成及抗病具有重要的调节作用［8］.然而对于MYB转录因子TDF1作用位点及下游基因的研究并不清楚.虽然可以采用CASTjng的策略寻找转录因子的DNA结合位点［9，10］，染色质免疫共沉淀（Chromatjn Immunoprecjpjtatjon，ChIp）的方法可以用来在体内鉴定转录因子直接调控的下游基因.但是这些方法都需要特异性很高的蛋白抗体［11］.本研究制备的抗体与目的融合蛋白TDF1特异性较强，可用于TDF1作用位点及其直接调控的下游基因功能的研究，有助于生化水平上深入研究TDF1在花药发育中的分子机理.【相关文献】［1］ R0MER0 I，FUERTESA，BENIT0 M J，et al.More than 80 R2R3-MYB regulatory genes jn the genome of Arabjdopsjs thaljana［J］.Plant J，1998，14（3）：273-284. ［2］ BIEDENKEPPH，B0RGMEYER U，SIPPEL A E，et al.Vjralmyb oncogene encodes a sequence-specjfjc DNA-bjndjng actjvjty［J］.Nature，1988，335（6193）：835-837. ［3］ PACINIE，FRANCHIG G，HESSE M.The tapetum：jts form，functjon，and possjble phylogeny jn Embryophyta［J］.Plant Syst Evol，1985，149：155-185.［4］ ZHU J，CHEN H，LIH，et al.Defectjve jn Tapetal Development and Functjon 1 js essentjal for anther development and tapetal functjon formjcrosporematuratjon jn Arabjdopsjs［J］.Plant J，2008，55（2）：266-277.［5］巴德年.当代免疫学技术与应用［M］.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998.［6］萨姆布鲁克J，拉塞尔DW.分子克隆实验指南（第3版）［M］.黄培堂，译.北京：科学出版社，2002.［7］ KIRUBAKARAN S I，SAKTHIVEL N.Clonjng and overexpressjon of antjfungal barley chjtjnase gene jn Escherjchja colj［J］.Protejn Expr Purjf，2007，52（1）：159-166.［8］ MARTIN C，PAZ-ARES J.MYB transcrjptjon factors jn plants［J］.Trends jn Genetjcs，1997，13（2）：67-73.［9］ WRIGHTW E，BINDER M，FUNKW.Cycljc ampljfjcatjon and selectjon of targets （CASTjng）for themyogenjn consensus bjndjng sjte［J］.Mol Cell Bjol，1991，11（8）：4104-4110.［10］FUNKW D，WRIGHTW E.Cycljc ampljfjcatjon and selectjon of targets formultjcomponent complexes：myogenjn jnteracts wjth factors recognjzjng bjndjng sjtes for basjc heljx-loop-heljx，nuclear factor 1，myocyte-specjfjc enhancer-bjndjngfactor 2，and C0MP1 factor［J］.Proc Natl Acad Scj，1992，89（20）：9484-9488.［11］DASPM，RAMACHANDRAN K，VANWERT J，et al.Chromatjn jmmunoprecjpjtatjon assay［J］.Bjotechnjques，2004，37（6）：961-969.。

蛋白融合表达全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：蛋白融合表达（Protein Fusion Expression）是生物技术领域中一种常用的蛋白表达技术，通过将不同蛋白基因序列进行融合，使其能够在目标宿主细胞中表达出含有多个功能区域的融合蛋白。

蛋白融合表达技术是从基因水平上控制蛋白质的结构和功能，为蛋白质的生物学功能研究、药物研发和生物制药等领域提供了有效的手段。

一、蛋白融合表达的原理蛋白融合表达技术是利用基因工程技术将两个或多个蛋白基因的编码序列连接在一起，形成一个新的融合蛋白基因，然后通过转染或转化等手段将其导入目标宿主细胞中，使其表达出融合蛋白。

蛋白融合表达的基本原理是将两个或多个不同功能的蛋白通过融合技术合并在一起，达到协同作用或增强某一功能的效果。

蛋白融合表达可通过多种途径实现，常见的方法包括直接连接两个蛋白的编码序列、利用核酶切割和PCR等技术进行DNA重组，以及通过载体和质粒等载体介导融合蛋白的表达。

不同的蛋白融合表达技术具有各自的特点和适用范围，选择合适的融合表达策略可提高蛋白表达效率和提取纯度。

1. 生物学功能研究：蛋白融合表达技术可用于研究蛋白质的结构和功能，通过融合不同功能区域的蛋白进行功能分析和蛋白相互作用研究，揭示蛋白质的生物学特性和作用机制。

2. 药物研发：蛋白融合表达技术在药物研发中具有广泛的应用，可用于合成重组蛋白、多肽和抗体等生物制剂，提高药物的活性和稳定性，开发新型药物和治疗方法。

3. 生物制药：蛋白融合表达技术是生物制药领域中最常用的生产方法之一，可用于大规模生产融合蛋白、重组蛋白和生物药物，提高生产效率和产品质量，满足临床需求。

4. 技术创新：蛋白融合表达技术在生物技术领域具有重要的技术意义，可以用于开发新型蛋白表达系统、优化蛋白表达和纯化工艺、改良蛋白结构和功能等方面，推动生物技术的发展和进步。

1. 提高蛋白表达效率：蛋白融合表达技术可以利用多个功能区域相互作用增强蛋白的稳定性和可溶性，提高蛋白的表达水平和纯度。

gst蛋白纯化原理GST蛋白纯化是一种常用的蛋白质纯化技术，其原理是利用谷胱甘肽-S-转移酶（Glutathione-S-transferase，GST）标签与谷胱甘肽的特异性结合来进行纯化。

GST标签可与谷胱甘肽通过二硫键共价亲和，然后通过GSH交换洗脱的原理进行蛋白纯化。

具体步骤如下：1.构建GST标签融合表达载体：将GST基因的编码序列与目标蛋白的编码序列融合，构建GST-目标蛋白融合表达载体。

这样，在细胞中表达该融合蛋白时，GST标签会紧密结合在目标蛋白的C端或N 端。

2.转染和蛋白表达：将构建好的GST-目标蛋白融合表达载体转染到合适的宿主细胞（如大肠杆菌），使其产生大量的融合蛋白。

3.细胞裂解和融合蛋白的亲和层析：收获融合蛋白的细胞，通过细胞裂解等方法破坏细胞膜，释放融合蛋白。

然后，将溶解的细胞提取物加载到含有谷胱甘肽固定在琼脂糖（或其他载体）上的亲和层析柱中。

GST标签可以特异性地与琼脂糖上的谷胱甘肽结合。

4.洗脱：通过洗脱缓冲液来去除非特异性结合的蛋白质，保留GST-目标蛋白复合物。

洗脱通常使用还原剂（如谷胱甘肽）、低pH 或其他方式进行。

5.目标蛋白的解离：将GST标签从目标蛋白上解离，得到纯化的目标蛋白。

这可以通过特定的酶切位点（如蛋白酶TEV切割位点）和相应的酶进行酶切，使GST和目标蛋白分别释放。

6.纯化分析：对纯化的目标蛋白进行分析，如SDS-PAGE凝胶电泳、Western blot等方法，确认目标蛋白的纯度和完整性。

在进行GST蛋白纯化时，对于融合表达载体的设计和构建、宿主细胞的选择、裂解条件和亲和层析条件的优化等方面都需要合理考虑，以获得高质量的纯化目标蛋白。

待测蛋白与gfp蛋白的融合表达待测蛋白与GFP蛋白的融合表达是一项常用的实验技术，可以用来研究蛋白的亚细胞定位、功能性研究以及蛋白的相互作用等。

在本文中，我将以一步一步的方式解释待测蛋白与GFP蛋白的融合表达的过程和原理。

第一步：选择适合的表达载体在进行待测蛋白与GFP蛋白的融合表达之前，首先需要选择合适的表达载体。

常见的表达载体包括质粒和病毒载体。

质粒通常用于体内表达，病毒载体则可以用于体内或体外表达。

选择表达载体时，需要考虑载体的大小、复制起源、选择标记等因素。

在此过程中，一个常用的表达载体是pEGFP-C1，它兼具了高效的GFP蛋白表达和稳定性。

第二步：将待测蛋白与GFP基因连接在将待测蛋白与GFP蛋白融合表达之前，需要将待测蛋白基因与GFP基因连接。

连接的方法有多种，常见的方法包括PCR扩增和限制性内切酶消化连接。

PCR扩增可以利用引物特异性扩增待测蛋白基因和GFP基因的DNA片段，然后通过连接酶将两个PCR产物连接在一起。

限制性内切酶消化连接则需要选择适合的限制性内切酶将待测蛋白基因和GFP基因进行消化，然后通过DNA连接酶将两个消化片段连接在一起。

第三步：转染细胞或注射在融合表达载体构建完成后，下一步是将表达载体导入到细胞中。

有两种常见的方法可以实现这一步骤：细胞转染和动物体内注射。

细胞转染可以通过化学法、电穿孔法或基因枪等技术将表达载体导入到细胞中。

动物体内注射则可以将表达载体注射到实验动物体内，使表达载体进入目标组织或器官。

第四步：蛋白表达检测一旦表达载体成功转染或注射到细胞或动物体内，下一步是检测蛋白的表达情况。

常见的方法包括免疫荧光染色、免疫组织化学、Western blot 等。

免疫荧光染色可以使用抗GFP抗体或待测蛋白特异性抗体与GFP融合蛋白结合，并通过荧光显微镜观察融合蛋白的亚细胞定位。

免疫组织化学可以利用特异性抗体与融合蛋白结合，并使用组织化学染色技术观察蛋白的分布情况。

重组结核杆菌融合蛋白的使用方法一、引言重组蛋白技术是现代生物技术领域的重要研究方向之一。

其中，重组结核杆菌融合蛋白作为一种新型的免疫原，具有广泛的应用前景。

本文旨在介绍重组结核杆菌融合蛋白的制备方法以及其在临床和实验室中的应用。

二、制备重组结核杆菌融合蛋白1. 基因克隆首先，需要将目标基因克隆到表达载体中。

常用的表达载体有pET等。

将目标基因PCR扩增后与表达载体进行连接，并经过酶切和连接等步骤构建成完整的表达载体。

2. 转染细胞将构建好的表达载体转染到宿主细胞（如大肠杆菌）中，使其能够产生目标蛋白。

3. 蛋白纯化通过离心、超滤等步骤，将含有目标蛋白的细胞裂解液进行初步分离。

接下来，可采用亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法对目标蛋白进行纯化。

4. 鉴定通过SDS-PAGE、Western blot等方法对目标蛋白进行鉴定，确保其纯度和活性。

三、重组结核杆菌融合蛋白的应用1. 临床应用重组结核杆菌融合蛋白可作为一种新型的免疫原，用于结核病的诊断和预防。

例如，在结核病的血清学检测中，可采用重组结核杆菌抗原作为诊断试剂。

此外，重组结核杆菌抗原还可用于疫苗开发。

2. 实验室应用在实验室中，重组结核杆菌抗原可作为一种重要的实验工具。

例如，在免疫学研究中，可采用重组结核杆菌抗原来激活T细胞，并进一步探究T细胞的功能。

此外，在药物筛选方面，还可以利用重组结核杆菌抗原来筛选可能的药物靶点。

四、使用注意事项1. 在制备过程中，应注意操作规范，避免交叉污染。

2. 在使用前应对制备的重组结核杆菌融合蛋白进行鉴定，确保其纯度和活性。

3. 在应用过程中，应注意实验条件的控制，避免影响结果的准确性。

五、总结重组结核杆菌融合蛋白是一种新型的免疫原，在临床和实验室中具有广泛的应用前景。

通过基因克隆、转染细胞、蛋白纯化等步骤，可以制备出高纯度的重组结核杆菌抗原。

在使用过程中，应注意操作规范和实验条件控制，以保证结果的准确性。

证明三个蛋白互作的方法在生物学研究中，蛋白质之间的相互作用是细胞内许多生物过程的核心。

了解三个蛋白之间的互作关系对于揭示复杂的信号传导网络和代谢途径至关重要。

本文将详细介绍几种用于证明三个蛋白互作的方法。

一、酵母双杂交法酵母双杂交法是一种用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

通过将三个待研究的蛋白质分别与酵母转录因子的DNA结合域和激活域融合，构建酵母双杂交载体。

将这些载体共转化到酵母细胞中，若三个蛋白质之间存在互作，则可以观察到报告基因的激活。

二、共免疫沉淀法（Co-IP）共免疫沉淀法是一种用于检测蛋白质相互作用的常用方法。

首先，将细胞裂解并提取蛋白质，然后利用特异性抗体捕获其中一个蛋白质，与其互作的蛋白质也会被一同沉淀下来。

通过检测沉淀物中的其他两个蛋白质，可以证明三个蛋白质之间的互作关系。

三、双分子荧光互补法（BiFC）双分子荧光互补法是基于荧光共振能量转移（FRET）原理的一种方法。

将三个蛋白质分别与荧光蛋白的N端和C端融合，构建表达载体。

当三个蛋白质互作时，荧光蛋白的N端和C端相互靠近，恢复荧光信号。

通过观察荧光信号的变化，可以证明三个蛋白质之间的互作。

四、分裂荧光素酶互补法（SFC）分裂荧光素酶互补法与双分子荧光互补法类似，但使用的是荧光素酶。

将三个蛋白质分别与荧光素酶的N端和C端融合，构建表达载体。

当三个蛋白质互作时，荧光素酶的N端和C端相互靠近，恢复荧光素酶活性。

通过检测荧光素酶活性，可以判断三个蛋白质之间的互作。

五、阿尔法互作陷阱法（AlphaScreen）阿尔法互作陷阱法是一种基于荧光共振能量转移原理的高通量筛选方法。

通过将三个蛋白质分别与供体和受体荧光蛋白融合，构建表达载体。

当三个蛋白质互作时，供体和受体荧光蛋白相互靠近，发生能量转移，产生可检测的荧光信号。

六、蛋白质芯片法蛋白质芯片法是一种基于微阵列技术的蛋白质相互作用研究方法。

将三个蛋白质分别固定在芯片上的不同位置，然后与标记的蛋白质混合。

重组蛋白和融合蛋白引言：生物科技的快速发展为医药领域带来了许多突破性的进展，其中重组蛋白和融合蛋白的研究与应用成为了热点领域。

重组蛋白是通过基因工程技术将外源基因导入宿主细胞中，使其表达出特定的蛋白质。

而融合蛋白则是将两个或多个不同的蛋白质序列连接在一起，形成新的蛋白质分子。

本文将分别介绍重组蛋白和融合蛋白的概念、研究方法和应用领域。

一、重组蛋白1. 概念重组蛋白是利用基因工程技术将外源基因导入宿主细胞中，使其表达出特定的蛋白质。

通过重组蛋白的制备，可以大量获取特定的蛋白质，用于研究和应用。

2. 研究方法（1）基因克隆：首先从生物体中提取目标基因的DNA序列，然后通过引物扩增、PCR等方法获得目标基因的DNA片段。

（2）载体构建：将目标基因的DNA片段插入到适当的载体中，使其与表达宿主细胞相容，并能够进行高效的转染和表达。

（3）细胞转染：将重组的载体导入宿主细胞中，使其表达出目标蛋白质。

（4）蛋白质纯化：通过离心、层析、电泳等方法将目标蛋白质从细胞中提取出来，并进行纯化。

3. 应用领域重组蛋白在医药领域有着广泛的应用。

例如，利用重组人胰岛素可以治疗糖尿病；利用重组免疫球蛋白可以用于治疗免疫缺陷病等。

二、融合蛋白1. 概念融合蛋白是将两个或多个不同的蛋白质序列连接在一起，形成新的蛋白质分子。

融合蛋白可以继承各自蛋白质的特性，并具有新的功能。

2. 研究方法（1）基因工程：通过基因工程技术将两个或多个蛋白质的基因进行重组，形成融合蛋白的基因序列。

（2）融合蛋白表达：将融合蛋白的基因导入宿主细胞中，使其表达出融合蛋白。

（3）融合蛋白纯化：通过离心、层析、电泳等方法将融合蛋白从细胞中提取出来，并进行纯化。

3. 应用领域融合蛋白在生物医学研究和工业生产中有着广泛的应用。

例如，利用融合蛋白可以生产出具有特定功能的药物；利用融合蛋白可以提高酶的稳定性和活性，用于工业生产中的酶催化反应。

结论：重组蛋白和融合蛋白的研究与应用在生物医学领域具有重要的意义。

一、实验目的本研究旨在分析融合蛋白的表达、纯化及其生物学活性，为后续研究融合蛋白的应用提供基础数据。

二、实验材料1. 融合蛋白表达载体：pET-28a（含目的基因融合蛋白）2. 菌株：BL21（DE3）大肠杆菌3. 试剂：IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）、DNase I、蛋白酶K、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、Western Blot试剂盒、小鼠抗目的蛋白单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗等4. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、Western Blot系统、紫外分光光度计等三、实验方法1. 融合蛋白表达将pET-28a表达载体转化至BL21（DE3）大肠杆菌中，挑选阳性克隆，在含IPTG 的LB培养基中培养至对数生长期，诱导表达融合蛋白。

2. 融合蛋白纯化收集诱导后的菌体，进行超声破碎，离心收集上清。

使用Ni柱亲和纯化上清中的融合蛋白，收集洗脱液，进行SDS-PAGE分析。

3. 融合蛋白鉴定将纯化的融合蛋白进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，观察目的蛋白条带。

使用Western Blot方法，将融合蛋白与小鼠抗目的蛋白单克隆抗体进行反应，检测目的蛋白的表达。

4. 融合蛋白生物学活性检测通过酶联免疫吸附实验（ELISA）检测融合蛋白的生物学活性。

四、实验结果1. 融合蛋白表达在IPTG诱导下，目的蛋白在BL21（DE3）大肠杆菌中成功表达，分子量约为50kDa，与预期相符。

2. 融合蛋白纯化使用Ni柱亲和纯化目的蛋白，纯度达到90%以上。

3. 融合蛋白鉴定SDS-PAGE电泳结果显示，目的蛋白条带清晰，与预期分子量相符。

Western Blot检测结果进一步验证了目的蛋白的表达。

4. 融合蛋白生物学活性检测ELISA实验结果显示，融合蛋白具有生物学活性。

五、实验讨论1. 融合蛋白表达本研究成功在BL21（DE3）大肠杆菌中表达了目的蛋白，表达水平较高，为后续研究提供了丰富的蛋白材料。

SUMO-TAT-Sox2融合蛋白的表达及纯化[摘要] 目的将小鼠Sox2基因、穿膜肽TAT以及小分子泛素样修饰蛋白SUMO融合并转入大肠杆菌中进行表达，最终获得大量具有高效穿膜活性的Sox2蛋白。

方法利用PCR技术扩增得SUMO-TAT融合基因，并插入到pET-3c载体。

再通过扩增获得小鼠Sox2基因，将其与pET3c-SUMO-TAT基础载体连接，构建得重组表达载体pET3c-SUMO-TAT-Sox2，然后转化到Rosseta(DE3)表达菌中，经IPTG诱导表达，使用Ni-NTA亲和层析进行分离纯化。

结果成功构建了pET3c-SUMO-TAT-Sox2原核表达载体，经终浓度为1 mmol /L的IPTG诱导4 h后表达约为57kDa的融合蛋白，以包涵体形式存在，Western Blotting检测显示良好特异性，经300 mmol/L咪唑洗脱可获得纯度较高的SUMO-TAT-Sox2融合蛋白。

结论得到大量带有穿膜肽TAT的融合蛋白Sox2，为今后利用重编程因子融合蛋白诱导体细胞重编程为iPS细胞奠定基础。

[关键词] Sox2基因；小分子泛素样修饰蛋白；TAT；原核表达；蛋白纯化转录因子Sox2属于HMG蛋白家族成员之一，具有维持胚胎干细胞自我更新能力，并能抑制中胚层细胞产生多种组织类型的细胞系的分化[1]。

Sox2可作为成体干细胞的分子标记物[2]。

范祖森等揭示了Sox2是通过招募介导组蛋白去甲基化和去乙酰化的NuRD复合物参与自噬调节，在细胞重编程过程中发挥重要作用[13]。

Sox2是通过转录激活SFRP2这一Wnt信号通路的拮抗因子，同时转录抑制WLS这一Wnt运输蛋白从而达到抑制经典Wnt信号通路的作用来实现从人胚胎干细胞向神经分化[4]。

由此可见，Sox2在在维持干细胞多能性以及细胞重编程中发挥重要作用。

小分子泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifier, SUMO)是一种与泛素在结构上十分相似的小分子多肽，作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣，不仅可以与靶蛋白N端结合来帮助其正确转运和折叠，且SUMO有利于增加蛋白的可溶性，能够大大提高蛋白质在大肠杆菌的表达量[35]。

第22卷第1期北华大学学报(自然科学版)Vol.22No.12021年1月JOURNAL OF BEIHUA UNIVERSITY(Natural Science)Jan.2021文章编号:1009-4822(2021)01-0042-05DOI :10.11713/j.issn.1009-4822.2021.01.008类弹性蛋白多肽-红色荧光蛋白融合蛋白的表达纯化及细胞相容性刘㊀宁,崔梅英,王明月,杨泽斌,王㊀浩,毛㊀禹,方楷漪,夏㊀薇,关新刚(北华大学医学技术学院,吉林吉林㊀132013)摘要:目的㊀构建携带红色荧光蛋白(mCherry)标签的类弹性蛋白(ELP)原核表达载体,并表达纯化ELP-mCherry 融合蛋白,探讨ELP-mCherry 融合蛋白与细胞的相容性.方法㊀对利用限制性内切酶Xba I 和Xho I 对mCherry 质粒和pET28a-ELP 载体同时进行双酶切,将酶切产物回收㊁连接并转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,构建重组质粒pET28a-ELP-mCherry;将重组质粒转化到BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中,诱导表达ELP-mCherry 融合蛋白;利用可逆转变循环(ITC)法对ELP-mCherry 融合蛋白进行纯化;通过MTT 法探讨ELP-mCherry 融合蛋白与人胚肾上皮细胞HEK293T 和小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3的细胞相容性.结果㊀DNA 测序结果显示成功构建了ELP-mCherry 原核表达载体;利用BL21(DE3)大肠杆菌表达系统成功表达ELP-mCherry 融合蛋白,通过ITC 法纯化得到了高纯度融合蛋白.MTT 结果表明:在所有ELP-mCherry 蛋白测试浓度下,HEK293T 和NIH3T3细胞存活率接近或超过100%.结论㊀成功构建ELP-mCherry 原核表达载体,成功表达并纯化得到高纯度的ELP-mCherry 融合蛋白,ELP-mCherry 融合蛋白在HEK293T 和NIH3T3细胞中具有良好的细胞相容性.关键词:类弹性蛋白多肽;红色荧光蛋白;原核表达;蛋白纯化;细胞相容性中图分类号:Q943.2文献标志码:A收稿日期:2020-03-08基金项目:吉林省科技发展计划项目(20180101213JC);吉林省人才开发资金项目(201858);吉林省教育厅科学技术研究项目(JJKH20200033KJ);吉林省卫生计生青年科技骨干培养计划项目(2017Q040);吉林市科技创新发展计划项目(201831729);北华大学青年科研创新团队项目.作者简介:刘㊀宁(1996 ),女,硕士研究生,主要从事检验诊断新技术研究,E-mail:842832918@;通信作者:夏㊀薇(1964 ),女,博士,教授,硕士生导师,主要从事检验诊断新技术研究,E-mail:xiawei4016@.Prokaryotic Expression ,Purification and Cell Compatibility ofELP-mCherry Fusion ProteinLIU Ning,CUI Meiying,WANG Mingyue,YANG Zebin,WANG Hao,MAO Yu,FANG Kaiyi,XIA Wei,GUAN Xingang(School of Medical Technology ,Beihua University ,Jilin 132013,China )Abstract :Objective To construct elastin-like protein (ELP)prokaryotic expression vector with red fluorescent protein (mCherry)tag,to purify the ELP-mCherry fusion protein and investigate the biocompatibility of ELP-mCherry protein on cells.Method mCherry plasmids and pET28a-ELP plasmids were double digested by restriction endonucleases Xba I and Xho I,which were used to construct pET28a-ELP-mCherry plasmid.The recombinant plasmids were transformed into BL21(DE3)E.coli competent cells to express ELP-mCherry fusion protein.ELP-mCherry fusion was purified by reversible transformation cycle method (ITC).The biocompatibility of ELP-mCherry protein was evaluated on human renal epithelial cells and mouse embryonic fibroblasts by MTT method.Results DNA sequencing result indicated the successful construction of ELP-mCherry plasmid,and ELP-mCherry fusion protein was acquired and purified by using BL21(DE3)E.coli system via ITC method.MTT results showed that HEK293T and NIH3T3treated with ELP-mCherry fusion protein under all tested concentration has a cell viability of100%or more.Conclusion We successfully constructed ELP-mCherry prokaryotic expression vector,and got the high purity ELP-mCherry fusion protein,ELP-mCherry protein had good cell compatibility on HEK293T and NIH3T3.Key words:elastin-like polypeptide;mCherry;prokaryotic expression;protein purification;cell compatibility㊀㊀类弹性蛋白样多肽(elastin-like polypeptide, ELP)是一种由基因工程设计合成的非免疫原性且无热原性的具有良好生物相容性的蛋白质聚合物[1-2],ELP主要是由五肽重复序列单元构成,即Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG),其中Xaa是除脯氨酸以外的任一种氨基酸[3-5].ELP具有可逆相变循环(Inverse transitioncycling,ITC)的特性,即温度低于其相变温度,ELP多肽以高度可溶的形式存在于水溶液中;若温度高于其相变温度,ELP开始聚集,形成不溶物聚集体,且该过程可逆[6].由于ELP具有的这种特殊性质,在大肠杆菌中高产量表达的ELP蛋白可以利用可逆相变的特性进行快速纯化[7].红色荧光蛋白(mCherry)是SHANER 等[8]将发色基团mRFP进行位点突变得到的一种单体红色荧光蛋白[9],mCherry的荧光强度高且稳定性好[10].KALIMUTHU等[11]将含有mCherry基因的慢病毒颗粒转染人间充质干细胞,表达红色荧光mCherry基因,用生物发光成像法追踪间充质干细胞在荷瘤小鼠中的迁移.在本研究中,基于ELP蛋白的独特优势及mCherry的荧光成像特性,我们构建了ELP-mCherry原核表达载体,表达纯化了ELP-mCherry 融合蛋白,探讨了其与人肾上皮细胞HEK293T和小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3细胞的相容性,为设计开发新型的荧光示踪组织工程材料奠定了基础. 1㊀材料与方法1.1㊀细胞、主要仪器和试剂pET28a-ELP和pEGFP-N1-mCherry质粒(Origene 公司,美国);限制性内切酶Xba I与Xho I(生工生物工程(上海)有限公司);大肠杆菌BL21菌株为本实验室保存菌株;HEK293T细胞㊁NIH3T3细胞复苏自本实验室冻存细胞;胰蛋白胨㊁酵母提取物㊁卡那霉素㊁异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(生工生物工程(上海)有限公司);多功能酶标仪Tecan Spark(上海帝肯公司);PCR仪㊁核酸电泳以及SDS-PAGE电泳所使用的电泳仪与电泳槽(Bio-Rad公司,美国).1.2㊀ELP-mCherry原核表达载体的构建及鉴定根据GenBank中mCherry基因的核苷酸序列设计包含mCherry基因编码框的引物(生工生物工程(上海)有限公司),并在引物两端分别添加Xba I和Xho I酶切位点.以pEGFP-N1-mCherry为模板通过PCR扩增获得mCherry片段,凝胶回收mCherry片段.mCherry片段和pET28a-ELP质粒分别用1μL限制性内切酶Xba I和Xho I酶切,回收目的片段,利用T4DNA连接酶在4ħ连接过夜,将连接产物转化到DH5α感受态细胞,接种于含有卡那霉素的LB平板上过夜培养.从平板培养基中挑取单个菌落,170r/min摇床过夜,提取质粒后用Xba I限制性内切酶进行单酶切验证,再用Xba I和Xho I进行双酶切及1%琼脂糖凝胶电泳检测(Bio-rad),并将构建的重组质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析.1.3㊀ELP-mCherry融合蛋白的原核表达将构建的pET28a-ELP-mCherry质粒转化到大肠杆菌感受态细胞(BL21)中,过夜培养后挑取单克隆菌落,接种于20mL含有卡那霉素的LB培养基中,37ħ㊁170r/min摇菌过夜;第2天按1ʒ50接种于1L含有卡那霉素的LB培养基中,当OD600达到0.6时,加入IPTG(终浓度1mmol/L),37ħ条件下培养6h诱导蛋白表达;离心收集菌体,PBS重悬菌体沉淀后加入苯甲基磺酰氟(PMSF,终浓度1mol/L),应用超声破碎菌体,离心收集上清和沉淀,通过SDS-PAGE电泳分析蛋白的表达情况. 1.4㊀ELP-mCherry融合蛋白的纯化利用ITC法快速纯化ELP-mCherry融合蛋白,将裂解液上清用NaOH调节pH至9.0,4ħ振荡过夜;第2天将裂解液上清在4ħ下,5000r/min离心90min,去除不溶性蛋白沉淀;将分离的上清恢复至室温后,置于37ħ摇床,250r/min震荡3h,在3h 内分3次加入NaCl至终浓度为1mol/L,37ħ离心收集沉淀,PBS重悬沉淀.以上过程重复两个循环,通过SDS-PAGE电泳分析蛋白的纯化情况.1.5㊀ELP-mCherry融合蛋白的细胞相容性用MTT法检测ELP-mCherry融合蛋白对HEK293T细胞和NIH3T3细胞增殖能力的影响.将对数生长期的HEK293T细胞和NIH3T3细胞以5000个/孔接种于96孔板中,置入37ħ㊁5%CO2培养箱中培养24h;第2天每孔中加入终浓度25㊁34第1期刘㊀宁,等:类弹性蛋白多肽-红色荧光蛋白融合蛋白的表达纯化及细胞相容性50㊁100㊁200㊁300μg /mL 的ELP-mCherry 融合蛋白,每个ELP-mCherry 融合蛋白浓度做5个平行孔.培养48h 后每孔加入20μL 的MTT,37ħ孵育4h 后,每孔再加入150μL 二甲基亚砜(DMSO),沉淀充分溶解后在酶标仪(TECAN M200)上测定OD 490时每孔的吸光度值.2㊀结㊀㊀果2.1㊀ELP-mCherry 原核表达载体的构建将从mCherry 质粒中获得的PCR 产物与pET28a-ELP 质粒分别用限制性内切酶Xba I 和Xho I 双酶切后,酶切产物经0.8%琼脂糖凝胶分离,将目的片段凝胶回收后连接,连接产物转化到Kana 平板,获得阳性克隆.提取质粒通过酶切进行验证,双酶切产生的片段与预期大小一致,提示pET28a-ELP-mCherry 重组质粒初步构建成功.见图1.DNA 测序结果显示mCherry 基因被成功插入表达载体中,没有发生碱基突变和移位,表明pET28a-ELP-mCherry 重组质粒构建成功.见图2.M.DL 5000DNA marker;1.Xba I 单酶切结果;2.Xba I 和Xho I 双酶切结果.图1pET28a-ELP-mCherry 重组质粒的酶切鉴定Fig.1Identification of pET28a-ELP-mCherry㊀㊀recombinant plasmid by enzymedigestion图2pET28a-ELP-mCherry 重组质粒的测序结果Fig.2Sequencing result of pET28a-ELP-mCherry recombinant plasmid2.2㊀ELP-mCherry 融合蛋白的原核表达将pET28a-ELP-mCherry 表达载体转入大肠杆菌感受态细胞(BL21)中,诱导ELP-mCherry 重组蛋白表达,SDS-PAGE 电泳结果显示:在细胞裂解液的上清在分子量30kDa 左右出现明显的蛋白条带,与ELP-mCherry 融合蛋白的预计分子量相符,说明ELP-mCherry 融合蛋白存在于细胞裂解液上清中,然后再利用ITC 法进行快速纯化.见图3.M.蛋白分子量标准;1.菌体细胞裂解液上清;2.菌体细胞裂解液沉淀.图3ELP-mCherry 重组蛋白的原核表达Fig.3Prokaryotic expression of ELP-mCherryrecombinant protein2.3㊀ELP-mCherry 融合蛋白的纯化利用ITC 法纯化ELP-mCherry 融合蛋白,裂解液上清通过两轮ITC 循环的结果显示:电泳条带纯化后的ELP-mCherry 融合蛋白在30kDa 位置显示单一条带,未出现明显的蛋白杂带,且蛋白分子量与ELP-mCherry 融合蛋白相符.因此,可以确定纯化蛋白为ELP-mCherry 蛋白.见图4.M.蛋白分子量标准;1.纯化后的ELP-mCherry 融合蛋白.图4ELP-mCherry 融合蛋白纯化Fig.4Purification of ELP-mCherry fusion protein2.4㊀ELP-mCherry 融合蛋白细胞相容性分析将不同浓度ELP-mCherry 融合蛋白(25㊁50㊁100㊁200㊁300μg /mL)分别处理HEK293T 细胞及NIH3T3细胞48h 后,通过MTT 法检测细胞的存活率.处理48h 后,HEK293T 细胞的存活率在各个浓44北华大学学报(自然科学版)第22卷度下都超过100%,NIH3T3细胞在测试所有浓度下也接近100%,这些结果说明ELP-mCherry 融合蛋白在两种细胞中都具有良好的细胞相容性.见图5.图5ELP-mCherry 融合蛋白的细胞相容性Fig.5Cell compatibility of ELP-mCherry fusion protein3㊀结㊀㊀论利用传统亲和层析法(麦芽糖结合蛋白MBP㊁谷胱甘肽S-转移酶GST㊁多聚组氨酸标签His㊁多聚精氨酸Arg)可以快速获得高纯度的目的蛋白,然而纯化介质成本较高,因此,迫切需要开发一种成本低廉的高纯度蛋白量产方法[12-13].1999年,MEYER 等[14]首次将ELP 与其他蛋白融合表达时发现了其可逆温度相变转换的特性,从此开创了一种新的蛋白纯化方法,称为 ELP 化 ,即将目的蛋白基因与ELP 基因的N 末端或C 末端融合而获得融合蛋白的方法.由于类弹性蛋白多肽类衍生蛋白具有可逆温度相变(低温溶解,高温聚集)特性,应用ITC 法对ELPs 蛋白进行纯化只需要加盐㊁升温(蛋白聚集)㊁离心(收集蛋白沉淀)㊁蛋白复溶几个步骤即可完成,多数情况下只需要2~3轮ITC 纯化即可获得高纯度的目的蛋白,无需昂贵的亲和层析介质,极大地降低了蛋白的生产成本,有利于进行大规模的蛋白质生产.近年来 ELP 化 法在重组蛋白纯化㊁改善目的蛋白半衰期㊁提升蛋白产量㊁作为蛋白的递送载体等方面获得了广泛应用[15-18].例如,MOKTAN 等[19]将细胞穿膜肽和促凋亡肽分别融合在ELP 基因的N 末端和C 末端,通过大肠杆菌表达系统制备了一种新型的蛋白抗肿瘤药物SynB1-ELP-KLAK,结果显示融合蛋白具有显著抑制肿瘤细胞增殖的能力.PHAN 等[20]将两种禽流感H 5N 1抗原与ELP 融合后在转基因烟草中进行融合蛋白表达,并利用ITC 方法成功获得了融合蛋白,结果显示ELP 化方法在烟草表达系统中能够显著提高目的蛋白产量.FLOSS 等[21]将anti-HIV-1单克隆抗体2F5与ELP 融合后在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)也获得了成功表达,结果显示单克隆抗体与ELP 融合并未影响2F5与抗原的结合活性,显示ELP 化法在哺乳动物表达系统中的有效性.本研究结果显示:通过构建ELP-mCherry 融合蛋白的表达载体,并将其转入大肠杆菌中进行融合蛋白表达,应用ITC 法对融合蛋白进行纯化,得到纯度较高的ELP-mCherry 融合蛋白.鉴于ELP 蛋白在细胞中极佳的细胞相容性,我们随后检测了ELP-mCherry 融合蛋白在HEK293T 细胞和NIH3T3细胞中的细胞相容性,结果显示融合蛋白在两种细胞的存活率超过或接近100%,提示引入mCherry 并未降低ELP 的细胞相容性,为接下来的组织工程应用奠定了良好的材料基础.mCherry 红色荧光蛋白的最大激发波长为587nm [22-24],具有结构稳定㊁表达量高㊁测定简便等优点,因此,被广泛用来对组织细胞定位进行示踪.将ELP 与mCherry 制备成ELP-mCherry 融合蛋白,既可以利用ELP 的可逆温度相变转换特性纯化的融合蛋白,又可以利用mCherry 高度稳定的红色荧光追踪其分布[25],因此,可作为理想的集示踪与支架功能于一身的生物材料用于皮肤损伤愈合㊁组织修复等工程应用.综上所述,本研究成功构建pET28a-ELP-mCherry 表达载体,表达并纯化ELP-mCherry 融合蛋白,ELP-mCherry 融合蛋白对HEK293T 细胞和NIH3T3细胞具有良好的细胞相容性,此研究为开发新型的组织工程示踪材料奠定了基础.参考文献:[1]MECO E,LAMPE K J.Impact of elastin-like proteintemperature transition on PEG-ELP hybrid hydrogel pro-perties[J].Biomacromolecules,2019,20(5):1914-1925.[2]MULLERPATAN A,CHANDRA D,KANE E,et al.Purification of proteins using peptide-ELP based affinityprecipitation[J].Biotechnol,2020,309:9-67.[3]GONZALEZ V J,GIROTTI A,MUNOZ R,et al.Self-54第1期刘㊀宁,等:类弹性蛋白多肽-红色荧光蛋白融合蛋白的表达纯化及细胞相容性assembling ELR-based nanoparticles as smart drug-delivery systems modulating cellular growth via Akt[J].Bioma-cromolecules,2019,20(5):1996-2007.[4]TA D T,VANELLA R,NASH M A.Bioorthogonal elastin-like polypeptide scaffolds for immunoassay enhancement[J]. Acs Appl Mater Interfaces,2018,10(36):30147-30154.[5]SREEKUMAR P G,LI Z,WANG W,et al.Intra-vitreal alphaB crystallin fused to elastin-like polypeptide pro-vides neuroprotection in a mouse model of age-related macular degeneration[J].J Control Release,2018,283: 94-104.[6]SARANGTHEM V,CHO E A,YI A,et al.Application of bld-1-embedded elastin-like polypeptides in tumor targe-ting[J].Sci Rep,2018,8(1):3892.[7]HUANG Kaizong,GAO Mengyue,FAN Lin,et al.IR820 covalently linked with self-assembled polypeptide for photothermal therapy applications in cancer[J].Biomater Sci,2018,6(11):2925-2931.[8]SHANER N C,CAMPBELL R E,STEINBACH P A,et al.Improved monomeric red,orange and yellow fluore-scent proteins derived from Discosoma sp.red fluorescent protein[J].Nat Biotechnol,2004,22(12):1567-1572.[9]王文旭,郁飞.红色荧光蛋白融合表达载体的构建和蛋白质细胞内定位研究[J].江苏农业科学,2019,47 (8):52-55.[10]陈英,王培娟,张文,等.mCherry红色荧光标记乳酸菌的融合表达系统构建及应用[J].生物工程学报,2019,35(3):492-504.[11]KALIMUTHU S,ZHU L,OH J M,et al.Migration ofmesenchymal stem cells to tumor xenograft models andin vitro drug delivery by doxorubicin[J].Int J Med Sci,2018,15(10):1051-1061.[12]ZHU D,WANG H,TRINH P,et al.Elastin-like protein-hyaluronic acid(ELP-HA)hydrogels with decoupledmechanical and biochemical cues for cartilage regene-ration[J].Biomaterials,2017,127:132-140. [13]LUO T,DAVID D A,DUNSHEE L C,et al.Thermo-responsive elastin-b-collagen-like peptide bioconjugatenanovesicles for targeted drug delivery to collagen-con-taining matrices[J].Biomacromolecules,2017,18(8):2539-2551.[14]MEYER D E,CHILKOTI A.Purification of recombinantproteins by fusion with thermally-responsive polypept-ides[J].Nature Biotechnology,1999,17(11):1112-1115.[15]MONFORT D A,KORIA P.Recombinant elastin-basednanoparticles for targeted gene therapy[J].Gene Ther,2017,24(10):610-620.[16]KOUHI A,YAO Z,ZHENG L,et al.Generation of a mon-oclonal antibody to detect elastin-like polypeptides[J].Biomacromolecules,2019,20(8):2942-2952. [17]ATEFYEKTA S,PIHL M,LINDSAY C,et al.Antibio-film elastin-like polypeptide coatings:functionality,stability,and selectivity[J].Acta Biomater,2019,83:245-256.[18]关新刚,苏维恒,于欣,等.Tat-GFP融合蛋白的表达纯化及其穿膜活性[J].吉林大学学报(医学版),2014,40(4):725-728.[19]MOKTAN S,RAUCHER D.Anticancer activity of proa-poptotic peptides is highly improved by thermal targetingusing elastin-like polypeptides[J].International Journalof Peptide Research and Therapeutics,2012,18(3):227-237.[20]PHAN H T,CONRAD U.Membrane-based inversetransition cycling:an improved means for purifying plant-derived recombinant protein-elastin-like polypeptide fus-ions[J].International Journal of Molecular Sciences,2011,12(5):2808-2821.[21]FLOSS D M,SACK M,STADLMANN,et al.Biochemicaland functional characterization of anti-HIV antibody-ELP fusion proteins from transgenic plants[J].PlantBiotechnology Journal,2008,6(4):379-391. [22]陈孙霞,王晓庆,徐晓恩,等.共培养体系中高红色荧光蛋白(RFP)标记结肠癌细胞的检测技术[J].复旦学报(医学版),2014,41(5):602-609. [23]金权鑫,许嘉珍,魏枫,等.MuSK-mCherry融合荧光蛋白的构建及对重症肌无力患者MuSK抗体的检测[J].中国免疫学杂志,2014,30(10):1369-1373. [24]赵俊丽,王东阳,南天惠,等.红色荧光蛋白遗传标记腺病毒衣壳蛋白pⅨ的实验研究[J].陕西师范大学学报(自然科学版),2011,39(6):60-63. [25]樊晋宇,崔宗强,张先恩.红色荧光蛋白的光谱多样性及体外分子进化[J].生物化学与生物物理进展,2008,35(10):1112-1120.ʌ责任编辑:陈丽华ɔ64北华大学学报(自然科学版)第22卷。

融合蛋白表达载体的构建融合蛋白表达载体的构建1、综述融合蛋白表达载体（fusion protein expression vector）是指将有特定功能的蛋白与启动子和响应元件结合到一起，然后构建在多肽片段表达载体上进行表达的载体。

融合蛋白表达载体可以帮助抗体和酶表达，它们也可能为蛋白定位，更好地控制蛋白表达提供帮助，更容易地把蛋白植入细胞内的膜，改善蛋白的结构并实现更高的表达水平。

2、融合蛋白的构建步骤一：准备载体融合蛋白表达载体的设计首先需要准备一个载体，载体可以是基因组DNA，基因的cDNA或者是其他可以表达目标基因的DNA片段，如遗传可变的质粒。

步骤二：确定编码区需要从基因组DNA、cDNA或者是其他载体（如质粒）中确定出编码目标基因的编码区，这一步一般是靠PCR扩增。

步骤三：筛选表达元件要实现融合蛋白效果，需要筛选出可以有效促进目标基因表达的表达元件，常用的表达元件有宿主细胞系特异性的启动子、促炎症基因表达的细胞因子受体对应的响应元件、核糖体蛋白结合位点以及转录抑制因子。

步骤四：构建融合蛋白表达载体在确定编码区和表达元件之后，就可以进一步设计和构建融合蛋白表达载体，使其具有指定的基因表达功能。

步骤五：植入细胞中和进行表达构建完毕的融合蛋白表达载体需要进入胞内，实现真正的核酸表达，可以通过转染（transfection）或者质粒转染（transfection）将融合蛋白表达载体植入细胞中，从而实现目标基因的表达。

步骤六：确定表达结果植入细胞后，可以通过Western Blot和ELISA等生物实验技术，从而确定融合蛋白的表达效果，从而确定融合蛋白表达载体是否有效。

3、结论融合蛋白表达载体可以提高蛋白表达的质量和效率，特别是在复杂的分子机制中，融合蛋白表达载体的使用可以帮助获得更高的可靠性和精确性。

分子生物学实验：
DNA的提取、DNA片段回收与纯化
荧光定量PCR反应
质粒的快速鉴定
质粒DNA的小量制备和大量制备
DNA的限制性酶切实验
琼脂糖凝胶中DNA片段的分离和回收
质粒DNA的连接和转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与重组质粒转化
融合蛋白表达载体构建
融合蛋白质的表达、纯化、复性和定量
western blot、考马斯亮蓝染色及银染检测等
真核细胞RNA的制备
mRNA的分离与纯化
DNA& RNA提取，PCR及PCR引物设计（普通PCR、温度梯度PCR反应、逆转录PCR反应），高效率感受态制作与重组质粒转化，融合蛋白表达载体的构建、诱导表达、纯化、复性及定量，western blot、考马斯亮蓝染色及银染检测实验等
细胞实验：细胞培养、细胞转染、细胞破碎、免疫印迹和免疫印迹亲和纯化
免疫组化室：石蜡包埋、组织切片、免疫组化、镜检。

表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。

一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。

原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。

而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。

（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段（4） P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加 poly（A）信号可以起到稳定 mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。

如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点：【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。

如<10kb 选质粒。

（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。

【3】载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。

综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般 10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。

（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（试一试）。

（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。

融合蛋白n端和c端表达
融合蛋白N端和C端表达是一种常见的蛋白质工程技术，用于产生具有特定功能或性质的蛋白质。

蛋白N端和C端表达融合可以通过多种方法实现，包括基因重组技术和蛋白质工程技术。

首先，融合蛋白N端和C端表达需要选择合适的宿主系统，常用的包括大肠杆菌、酵母菌和哺乳动物细胞等。

对于大肠杆菌表达系统，可以利用重组DNA技术将目标蛋白N端和C端与适当的表达载体连接，形成融合蛋白基因。

然后将该基因导入宿主菌中，利用菌体内的转录和翻译机制来表达融合蛋白。

其次，融合蛋白N端和C端表达还需要考虑蛋白质的折叠和功能。

在设计融合蛋白时，需要确保N端和C端的连接方式不会影响到蛋白质的结构和功能。

此外，还需要考虑到融合蛋白的纯化和鉴定方法，以确保获得高纯度和活性的融合蛋白。

另外，融合蛋白N端和C端表达的技术也可以应用于蛋白质工程和药物研发领域。

通过融合不同蛋白质的N端和C端，可以产生具有新功能或改良功能的蛋白质，为药物开发和生物技术研究提供了新的可能性。

总的来说，融合蛋白N端和C端表达是一项重要的蛋白质工程技术，通过合理设计和选择合适的表达系统，可以实现对蛋白质结构和功能的精准调控，为生物医药领域的研究和应用提供了有力支持。