EBF3与EGFP融合蛋白表达载体的构建及其在HepG2中的表达

人颗粒溶素与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达作者：伊正君，朱道银，李俊明，何永林，杨健，李娜【关键词】巨噬细胞Construction of a fusion gene expression vector containing human granulysin and green fluorescent protein gene and its expression in murine macrophage RAW264.7【Abstract】 AIM: To clone the human granulysin from activated cytotoxic Tlymphocytes (CTL), construct an eukaryotic expression vector containing the fusion gene of granulysin (GLS) and green fluorescent protein reporter and observe its expression in murine macrophage RAW264.7 strain. METHODS: The coding sequence of the granulysin was amplified from the total RNA of human CTL activated by allogenic antigen after reverse transcription by NestedPCR, inserted into pEGFPC1 plasmid and then transfected RAW264.7 cells. The expression of the fusion protein and GLS was detected by fluorescence microscope and RTPCR. The immunoreactive of the product was confirmed by immunocytochemistry method. RESULTS: The whole coding sequenceof GLS was successfully amplified as expected. The accurate open reading frame (ORF) of the fusion protein recon was confirmed by PCR, endonuclease digestion and sequencing. The fusion protein that was immunoreactive was successfully expressed in the targeted cells. CONCLUSION: Human granulysin can be expressed in murine macrophage RAW264.7 strain in a fusion protein pattern and retain its immunoreactivity.【Keywords】 granulysin； green fluorescent protein；macrophage； nestedPCR；immunoreactivity【摘要】目的: 克隆人天然颗粒溶素(granulysin，GLS)的编码序列并构建与绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合的真核表达载体，观察人GLS在鼠巨噬细胞株RAW264.7中的表达. 方法: 提取培养并经同种异型抗原激活的人细胞毒性T淋巴细胞(CTL)细胞总RNA，经逆转录后以套式PCR方法扩增出GLS的编码序列，插入pEGFPC1质粒，鉴定正确后转染RAW264.7细胞，采用荧光显微镜及RTPCR法检测融合蛋白及GLS的表达，采用免疫细胞化学法确证表达产物的免疫反应性. 结果: 成功扩增出了人GLS完整编码序列的cDNA，经PCR及酶切、测序鉴定证明得到了读码框正确的融合蛋白重组子并在靶细胞中得到了成功表达，表达产物具有良好的免疫反应性.结论:人天然GLS能够在鼠巨噬细胞株RAW264.7中以融合蛋白的形式表达，其表达产物具有良好的免疫反应性.【关键词】颗粒溶素；绿色荧光蛋白；巨噬细胞；套式PCR；免疫反应性0引言颗粒溶素（granulysin，GLS）对细菌、真菌、原虫、肿瘤细胞等具有很强的广谱杀伤活性，因此对其免疫杀伤作用机制的研究对于开发天然、低毒、高效的新一代杀菌制剂以及研究人体的天然免疫过程具有重要意义. 为此我们直接从激活后的人外周血单个核细胞（PBMC）总RNA中扩增出GLS的cDNA编码序列并构建了与绿色荧光蛋白报告基因融合的真核表达载体，转染到鼠巨噬细胞株RAW264.7中进行了表达.1材料和方法1.1材料E.coli Top10, Clontech公司质粒载体pEGFPC1为本室保存;小鼠巨噬细胞株RAW264.7购自第三军医大学药理学教研室. 人外周血单个核细胞(PBMC)分离液及植物血凝素（PHA）购自第三军医大学试剂服务中心；质粒小量抽提试剂盒、PCR产物及凝胶回收试剂盒均购自上海华舜公司；限制性核酸内切酶BsPE I，BamH I购自NEB公司；小量组织/细胞总RNA抽提试剂盒、正常熔点琼脂糖（NMA）,高保真ProbestTaq酶、T4 DNA连接酶、逆转录试剂盒（Ver.3.0）、DNAMarker DL2000等均购自大连宝生物公司； GenePorter 2真核转染试剂为美国GTS公司产品；山羊抗人GLS抗体购自基因公司；即用型免疫细胞化学试剂盒购自武汉博士德；RPMI 1640培养液购自Gibco公司；小牛血清为杭州四季青公司产品.1.2方法根据GeneBank中人GLS的cDNA序列，共设计合成了4条引物：PG1: 5′GCGCTAGCGTATCTGTGGTAAACCCAGTG3′; PG2: 5′GCGGTACCCTTGCTTGACACTTTATTCTCG3′; PGE1: 5′GCTCCGGAAAGCTTCATATGAACCCAGGTCTGGTCTTCTC3′; PGE2: 5′TAGGATCCGTCGACGAGCTCTCAGAGGGGACCTGTAGAAG3′; 全部由大连宝生物公司合成. 由于表达产物定位于巨噬细胞胞质内表达，因此在PGE1引物设计中去除了GLS的分泌肽编码序列. 首先用PHA活化外周血单个核细胞，然后用同种异型抗原诱导、刺激其中的CTL细胞和NK细胞活化，从而启动GLS基因的转录. 方法是，无菌采集2份健康人静脉血各6 mL，肝素抗凝. 1500 r/min离心10 min，分别吸出上层血浆及白细胞层，然后用PBS缓冲液1∶1稀释白细胞，再按PBMC分离液说明，常规分离外周血单个核细胞. 取其中一份PBMC样本洗涤2次后以含100 mL/L自体血浆的完全RPMI 1640培养液重悬，调节细胞浓度为2×106/L，加入PHA使其终浓度为200 mg/L，置37℃，50 mL/L CO2培养箱中，培养24 h后加入另一份样本（此样本PBMC经灭活处理后以含100 mL/L灭活小牛血清的完全RPMI 1640培养液重悬）共同培养48 h后收获细胞.1.2.1GLS cDNA的扩增、克隆与测序抽提细胞总RNA，逆转录后调适相应的缓冲液，用高保真ProbestTaq酶取代试剂盒自带的HSTaq, 用引物PG1，PG2进行PCR扩增25个循环，获得包含目标序列在内的GLScDNA全长片段. 然后取产物2 μL为模板，以引物PGE1与PGE2进行套式扩增，反应条件为：94℃ 4 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环； 72℃延伸8 min. 10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测. 纯化后以BsPE I，BamH I双酶切、回收，与同样处理的pEGFPC1载体大片段在16℃连接1 h，转化大肠杆菌TOP10，涂布于含30 mg/L卡那霉素LB平板上培养，次日挑取卡那霉素抗性单菌落，进行PCR鉴定，阳性克隆置3 mL含30 mg/L卡那霉素LB培养基中振摇增菌，小量抽提质粒，用BsPE I与BamH I进行双酶切鉴定，送上海博亚公司测序.1.2.2细胞转染及表达产物的检测RAW264.7细胞在含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养基中，以24孔板置37℃，50 mL/L CO2培养，常规方法制作RAW264.7细胞爬片，至80%~90%汇片后按转染试剂盒说明进行转染，以pEGFPC1空质粒转染的RAW264.7细胞作为对照.转染72 h后分别收集实验孔及对照孔的细胞:①取出爬片进行荧光检测，观察融合蛋白的表达及分布；②以RTPCR法对GLS基因进行转录水平上的检测：抽提细胞总RNA逆转录，以PGE1, PGE2为引物，按上述条件进行扩增；③GLS表达产物的免疫学活性检测：取出爬片进行免疫细胞化学检测，具体方法是：PBS洗，40 g/L多聚甲醛固定，PBS洗，30 mL/L H2O2灭活内源性过氧化物酶10 min； PBS洗，滴加血清封闭液，室温20 min；滴加1∶300稀释的山羊抗人GLS抗体，4℃过夜；PBS洗，滴加生物素化的兔抗山羊抗体，室温20 min；PBS洗，滴加链酶亲和素生物素酶复合物（SABC）液，室温20 min；PBS洗，DAB避光显色20 min；苏木素复染，盐酸乙醇分化，脱水，透明，封片，观察. 2结果2.1GLS cDNA的套式PCR扩增两次PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳后，分别在433，754 bp处见到一特异性目的片段，与理论预测的GLS全长cDNA序列大小相符(Fig 1).2.2重组质粒的PCR及酶切鉴定插入正确片段的重组菌落经PCR扩增后，电泳可见到与目的片段大小一致的PCR产物条带. 分别抽提质粒双酶切后琼脂糖凝胶电泳表明,酶切后产生一线性空载体条带及一条与理论预测值一致的目的片段(Fig 2).2.3GLS转录产物的RTPCR检测转染72 h后抽提细胞总RNA 以原引物作RTPCR重新扩增出目的片段为433 bp，与理论预测值完全相符(Fig 3).2.4GLS与EGFP融合蛋白的荧光检测转染72 h后融合蛋白表达产物主要定位于细胞质(Fig 4).2.5GLS表达产物的免疫细胞化学以山羊抗人GLS抗体为一抗，生物素化的兔抗山羊抗体为二抗，DAB显色可见GLS呈强阳性表达(Fig 5).3讨论一般认为清除结核杆菌等胞内寄生菌的感染主要依赖人体的细胞免疫反应，可以运用结核杆菌的单一［1］或融合形式［2］的保护性抗原构建基因疫苗激发人体的Th1型细胞免疫反应来防治结核病. 在这一过程中，细胞毒性淋巴细胞起着关键作用. 激活的CTL细胞和NK细胞产生的GLS是一种细胞毒性免疫效应分子. Ogawa等［3］认为血清GLS的水平是评价机体细胞免疫功能状态的新指标. Kida等［4］利用拉氏无胆支原体（Acholeplasma laidlawii）刺激人单核细胞来源的THP1细胞株，在其中检测到了GLS mRNA的表达，并认为特定刺激在巨噬细胞中诱导产生GLS可能是机体一种有效的抗微生物入侵的保护机制. 利用真核表达载体（如pcDNA3.1）已经在多种真核细胞株如YT，HuT78，COS7（非洲绿猴肾细胞）中表达出了具有生物学活性的GLS［5］. 绿色荧光蛋白是目前公认较为优良的一种标记基因，与目的基因融合后不会影响表达产物的生物学活性，新近Hanson等［6］采用绿色荧光蛋白作为报告基因与GLS作C端融合，也在YT细胞中得到了成功表达，但GLS在鼠巨噬细胞中的表达迄今为止未见报道. 我们利用套式RTPCR的方法从激活的人外周血PBMC中直接扩增出了GLS 的cDNA编码序列并构建了与绿色荧光蛋白的融合表达载体，在体外从细胞水平检测到了其转录与表达，这说明人GLS是能够定位在小鼠巨噬细胞胞质中进行表达的，从而为后续在活体动物模型中的应用及研究其免疫杀伤机制奠定了基础.【参考文献】［1］骆旭东, 朱道银, 陈全, 等. 结核分枝杆菌Ag85B和MPT64基因疫苗免疫原性的比较［J］.第四军医大学学报,2003; 24（17）:1630-1631.Luo XD, Zhu DY,Chen Q, et parison of immunogenicity of DNA vaccine encoding Mycobacterium tuberculosis Ag85B and MPT64［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2003; 24（17）:1630-1631.［2］江山, 朱道银,蒋英,等.结核分枝杆菌Ag85BAg85A双抗原融合真核表达质粒的构建及表达［J］. 第四军医大学学报,2003;24（21）:1973-1975.Jiang S, Zhu DY, Jiang Y, et al.Construction of fused eukaryotic expression vector of Mycobacterium tuberculosis Ag85B and Ag85A antigens and its expression［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2003;24（21）:1973-1975.［3］ Ogawa K, Takamori Y, Suzuki K, et al. Granulysin in human serum as a marker of cellmediated immunity［J］. Eur J Immunol, 2003; 33(7):1925-1933.［4］ Kida Y, Shimizu T, Kuwano K. Opposing roles of activator protein1 and CCAAT/enhancer binding protein beta in the regulation of inducible granulysin gene expression in a human monocytic cell line,THP1［J］. Immunology, 2002；107(4):507-516.［5］Hanson DA, Kaspar AA, Poulain FR, et al. Biosynthesis of granulysin, a novel cytolytic molecule［J］. MolImmunol， 1999； 36(7):413-422.［6］ Hanson DA, Ziegler SF. Fusion of green fluorescent protein to the Cterminus of granulysin alters its intracellular localization in comparison to the native molecule［J］. J Negat Results Biomed, 2004;3(1):2.（注：可编辑下载，若有不当之处，请指正，谢谢!）。

蛋白质egfp融合蛋白蛋白质EGFP融合蛋白（EGFP-fusion protein）是由一种绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP）与其他蛋白质序列融合而成的蛋白质复合体。

EGFP是一种由Aequorea victoria水母产生的蛋白质，具有独特的荧光特性，能够在外源激发光源的作用下自发发出绿色荧光。

EGFP-fusion protein在生命科学研究中被广泛应用，可以通过显微镜观察该融合蛋白的在细胞和组织中的分布和定位，从而研究该蛋白质的生物学功能和调控机制。

本文将介绍EGFP-fusion protein的构建步骤、应用领域以及存在的挑战和未来发展方向。

首先，构建EGFP-fusion protein需要克隆目标蛋白质的编码区域，通常使用基因克隆技术将EGFP序列与目标蛋白质的编码序列进行连接。

常用的方法是PCR扩增目标蛋白质的编码序列，并在其N或C端引入适当的限制酶切位点，然后将PCR产物与EGFP载体进行双酶切和连接。

连接产物可经过测序验证，进一步进行细胞转染或转基因模型构建等应用。

在应用方面，EGFP-fusion protein可以用于研究蛋白质在细胞内的定位和分布，例如可以用EGFP-actin融合蛋白来研究细胞骨架的重组和功能。

此外，EGFP-fusion protein还可以用于蛋白质相互作用的研究，通过融合EGFP和其他蛋白质的序列，可以观察到这些蛋白质在细胞内的共定位情况，从而推测它们之间可能发生的相互作用。

然而，构建并应用EGFP-fusion protein也面临一些挑战。

首先，蛋白质的融合可能对其原有的结构和功能产生影响，因此需要对融合蛋白进行验证，确保其具备正常的生物学活性。

其次，EGFP的荧光特性可能会受到融合蛋白的结构和环境的影响，从而导致荧光信号强度和彩色性能的改变。

最后，EGFP的表达可能会受到细胞毒性和光毒性的影响，因此需要合理选择表达系统和实验条件，以确保实验的准确性和稳定性。

融合蛋白表达载体MK-EGFP的构建及其在不同肿瘤细胞中
的定位
单筠;俞研迎;龚建光;毛克秋
【期刊名称】《浙江预防医学》
【年(卷),期】2009(021)007
【摘要】@@ MK(Midkine)是一种肝素结合性生长因子,最初发现与细胞生长、迁移和存活有关,随后的研究发现它在多种人源恶性肿瘤中高表达[1-2].
【总页数】2页(P93-94)
【作者】单筠;俞研迎;龚建光;毛克秋
【作者单位】浙江大学医学院附属第一医院,浙江,杭州,310003;浙江大学医学院附属第一医院,浙江,杭州,310003;浙江大学医学院附属第一医院,浙江,杭州,310003;浙江省血液中心
【正文语种】中文
【中图分类】R392.11;R73-3
【相关文献】
1.MK-EGFP融合蛋白在人肝癌细胞Hep-G2中的核定位 [J], 赵宁
2.重组EGFP-aquaporin-4融合蛋白真核表达载体的构建及其在FRT细胞中的表达和定位 [J], 李凤娥;郝峰;藏雨轩;马睿泽;孔繁利;刘磊;李艳
3.白蛋白融合蛋白表达载体的构建及其在细胞中的表达和定位 [J], 刘承武;陈登宇;胡水旺;刘靖华;姜勇
4.鹦鹉热嗜衣原体CPSIT_0018融合蛋白原核表达载体的构建、表达及其在Hela 细胞中的定位 [J], 贺庆芝;曾怀才;陆春雪;胡艳群;陈芝喜;王川;吴移谋
5.鹦鹉热嗜衣原体CPSIT_0018融合蛋白原核表达载体的构建、表达及其在Hela 细胞中的定位 [J], 贺庆芝;曾怀才;陆春雪;胡艳群;陈芝喜;王川;吴移谋;
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NIRF （Np95ICBP90-like RING Finger ）基因是日本福岛医科大学Kochi 教授于2002年发现的，该基因位于9P24.1，编码由802个氨基酸残基组成的蛋白质［1~3］。

NIRF 基因有一个PHD （Plant homeo do －main ）结构域，一个YDG ／SRA 结构域，Rb 结合位点以及一个RINGfinger 区。

已有研究表明，含RING finger 结构域的蛋白往往具有泛素化功能，在细胞内充当E3的角色［1~3］。

根据这一理论，我们推测NIRF 应该具有E3功能。

已有研究证明，NIRF 不仅能与P53结合，而且能对P53进行泛素化降解［4］。

据报道，在人类48%以上的肿瘤组织中，存在NIRF 基因突变［5］。

本研究构建了人NIRF 基因真核表达质粒，并在HepG2.2.15细胞中表达了NIRF 蛋白，为进一步研究其在肿瘤组织中的功能奠定了基础。

1.材料与方法1.1细胞、质粒及菌株HeLa 细胞和pIRES2-EGFP 载体均为本室保存；HepG2.2.15细胞由重庆医科大学传染病实验室陈颖老师惠赠；感受态E.coli DH5α购自北京天为时代科技有限公司。

1.2主要试剂DMEM 培养基和胎牛血清（FCS ）均为HyClone 公司产品；OligodT 购自TaKaRa 公司；T4Ligase 、琼脂糖、核酸内切酶Sac I 、Sma I 、pfu 聚合酶、dNTP 、10×Buffer 、质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒均购自Promega 公司；DNA marker BM15000购自北京博迈德公司；Trizol 试剂盒、Superscript Ⅱ反转录酶和Lipofectamine TM 2000均购自Invitrogen 公司；转染稀释液（Opti -MEM Ⅰ）为GIBCO 公司产品；兔抗人NIRF 多克隆抗体购自Abcam 公司；其他试剂均为国产或进口分析纯。

早期B细胞因子3对HepG2细胞周期的影响王跃国;王惠民;鞠少卿;汪晓莺;毛丽萍【期刊名称】《中国免疫学杂志》【年(卷),期】2009(025)006【摘要】目的:克隆人早期B细胞因子3 (EBF3)基因,构建真核表达载体pEGFP/EBF3,研究人EBF3对肝癌细胞株HepG2细胞周期的影响.方法:提取人胎盘组织总RNA,采用RT-PCR技术克隆人EBF3基因,并将其克隆到真核表达载体pEGFP-N1,重组质粒双酶切鉴定,并进行序列测定.将重组质粒转染HepG2细胞,Western blot确证EBF3-EGFP融合蛋白的表达及亚细胞定位,流式细胞术分析转染细胞周期.结果:成功获得全长人EBF3基因,经双酶切和序列测定鉴定,真核表达质粒pEGFP/EBF3构建正确,将pEGFP /EBF3导入HepG2细胞24小时后,在倒置荧光显微镜下可观察到EBF3-EGFP融合蛋白主要表达于核内.Western blot证实转染pEGFP/EBF3后24小时和48小时细胞质和细胞核中均检出相对分子质量(Mr)为87 000的EBF3-EGFP融合蛋白.转染pEGFP/EBF3后48小时和72小时,S期细胞比例均明显高于pEGFP-N1转染细胞组,表明EBF3基因的导入可诱导细胞从G1期向G2期发展,从而促进细胞增殖.结论:成功构建了真核表达质粒pEGFP/EBF3,pEGFP /EBF3转染组S期细胞比例高于pEGFP-N1转染组,提示EBF3对人肝癌细胞株HepG2细胞有促进增殖作用.【总页数】5页(P491-495)【作者】王跃国;王惠民;鞠少卿;汪晓莺;毛丽萍【作者单位】南通大学附属医院检验医学中心,南通,226001;南通大学附属医院检验医学中心,南通,226001;南通大学附属医院检验医学中心,南通,226001;南通大学医学院免疫教研室,南通,226001;南通大学附属南通第三医院,南通,226006【正文语种】中文【中图分类】R730.23【相关文献】1.CIAPIN1对HepG2细胞增殖和细胞周期的影响 [J], 欧志涛;詹远京;郭家伟;罗铎2.罗格列酮对肝癌HepG2细胞周期和凋亡的影响 [J], 康燕;魏玲;王永霞;王立云3.miR-21对HepG2细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响 [J], 张小三;张一鸣;杨树军;戚春辉;刘凯;赵燕4.芹菜素联合阿霉素对肝癌HepG2细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响 [J], 邸金霖;单万亭;赵娇;鞠爱霞;李秋红5.细胞因子组合对受照射脐带血AC133^+细胞周期和早期凋亡的影响 [J], 刘玉龙;戴宏;姜忠;周丽英;郭晓葵;周剑影;胡勤芳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白的构建与表达代维;刘静;黄鹤;文雪;袁晓梅;雷萍;朱慧芬;沈关心【期刊名称】《中国免疫学杂志》【年(卷),期】2009(025)010【摘要】目的:抗转铁蛋白受体单链抗体(TfR-scFv)-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建与表达.方法:设计两对引物引入连接肽(Gly4Ser)3以及酶切位点HindⅢ和BamH Ⅰ,采用重叠延伸PCR扩增与构建具有前导肽的L-VH-Linker-VL单链抗体基因,亚克隆至pEGFP-N1,转染COS-7细胞,倒置相差荧光显微镜下观察荧光蛋白表达,流式细胞术(FCM)检测细胞分泌上清与乳腺癌细胞MCF-7及黑色素瘤细胞A375结合活性.结果:测序表明获得了正确的L-VH-Linker-VL单链抗体基因序列;亚克隆至pEGFP-N1后,表达载体转染COS-7细胞,经荧光显微镜观察转染细胞,及通过流式细胞术(FCM)检测细胞分泌上清,证实抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白在转染细胞中分泌性表达,并能够与天然高表达TfR的细胞特异性结合.结论:抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白真核表达载体构建成功,其表达产物具有与TfR阳性细胞结合的活性.【总页数】4页(P936-939)【作者】代维;刘静;黄鹤;文雪;袁晓梅;雷萍;朱慧芬;沈关心【作者单位】华中科技大学同济医学院附属同济医院,武汉,430030;华中科技大学同济医学院免疫学系,武汉,430030;华中科技大学同济医学院免疫学系,武汉,430030;华中科技大学同济医学院免疫学系,武汉,430030;华中科技大学同济医学院免疫学系,武汉,430030;华中科技大学同济医学院免疫学系,武汉,430030;华中科技大学同济医学院免疫学系,武汉,430030;华中科技大学同济医学院免疫学系,武汉,430030【正文语种】中文【中图分类】Q816【相关文献】1.抗恶性黑素瘤单链抗体-鱼精蛋白融合蛋白表达载体的构建及评价 [J], 王昊;杨一飞;王炜;管冰;寻萌;张海;王字玲;赵勇2.抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白的构建、表达与纯化 [J], 杨光勇;刘茜明;刘莉莉;王文佳;何光志3.抗CD133单链抗体/白喉毒素DAB389融合蛋白的基因构建、表达、纯化及鉴定 [J], 程金章;杨景朴;仲炜;王海涛;赵胤;陈俊俊;王宗贵;牙韩盛4.双靶点抗乳腺癌融合蛋白Del1-9-G129 R-endostatin真核表达载体的设计构建[J], 顾丽;王成华;苏凯丽;王学鑫;苏燕5.抗G7单链抗体-AP融合蛋白的构建、表达与鉴定 [J], 邵艳宏;李天宁;黄伦辉;王文皓;魏琳纳;袁玉华;刘运德因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

人β-防御素-3与人表皮生长因子融合蛋白的克隆及原核表达房兵;孙淼;李友建;武晓茜;耿家珍;邵先安【摘要】目的克隆融合蛋白d-EGF成熟链基因,构建原核表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)表达体系中进行有效表达、分离纯化并鉴定其特异性.方法以蛋白基因序列为基础,RT-PCR扩增人防御素-β和表皮生长因子基因,分别构建β-防御素-3(β-defensin-3)、EGF重组质粒,应用重组PCR方法,将EGF的DNA序列拼接到β-defensin-3 DNA序列的3′端,将基因克隆入原核表达载体pET-SUMO,构建重组质粒pET-SUMO-d-EGF.采用PCR、测序等方法鉴定后转化E.coli BL21 (DE3),经IPTG 诱导表达,Ni-trap柱纯化,SDS-PAGE 检测表达及纯化结果,最后以Western blot对其进行特异性鉴定.结果成功构建β-defensin-3、EGF重组质粒,经重组PCR成功扩增出294 bp的目的片段,重组体PCR结果与预期结果一致,测序正确.转入重组质粒的E.coli BL21(DE3)经IPTG诱导经SDS-PAGE分析得到28 kDa左右的目的蛋白条带.Western blot鉴定出融合蛋白含有抗EGF、β-防御素-3两种抗原特异性的蛋白.结论成功构建原核表达载体pET-SUMO-d-EGF,并获得纯化的融合蛋白,为进一步的活性分析奠定了实验基础.%Objective: To recombine the d-EGF and β-defensin-3 gene in prokaryotic expression vector, express fusion protein in Prokaryotic system, and purify and identify its specific. Methods: On the basis of gene sequence, β-defensin-3 gene and epidermal growth factor( EGF) gene were amplified by RT-PCR. Recombinant plasmid of β-defensin-3 and d-EGF plasmid were constructed and the DNA sequences of d-EGF and β-defensin-3 gene was cloned into the pET-SUMO prokaryotic expression vector. The pET-SUMOd-EGF vector was identified by PCR and sequenced,and transformedinto E. Coli BL21 (DE3) ,which was induced by IPTG,purified using Nl-trap column and identified with western-blot. Results: β-defensin-3 and d-EGF plasmid were constructed. The fragment of 294 bp was successfully amplified by the recombinant PCR in accordance with the expected results and sequencing was correct. Twenty-eight kDa protein was obtained through tranforming into E. Coli BL21 DE3) and IPTG Inducing. The fusion protein containing d-EGF and (5-defensin-3 two proteins were identified with western-blot. Conclusions: Prokaryotic expression vector pET-SUMO-EGF was successfully constructed and fusion protein purified was obtained. It provides a basis for analysing its activity.【期刊名称】《蚌埠医学院学报》【年(卷),期】2012(037)005【总页数】5页(P500-504)【关键词】基因表达;β-防御素;融合蛋白d-EGF;巢氏PCR;免疫应迹分析【作者】房兵;孙淼;李友建;武晓茜;耿家珍;邵先安【作者单位】蚌埠医学院,安徽,蚌埠,233030;解放军第123医院,检验病理科,安徽,蚌埠,233015;蚌埠医学院,安徽,蚌埠,233030;蚌埠医学院,安徽,蚌埠,233030;解放军第123医院,检验病理科,安徽,蚌埠,233015;解放军第123医院,检验病理科,安徽,蚌埠,233015;蚌埠医学院,安徽,蚌埠,233030;解放军第123医院,检验病理科,安徽,蚌埠,233015【正文语种】中文【中图分类】R343.1表皮生长因子(EGF) 属于促生长因子家族成员之一。

穿膜肽-EGFP融合蛋白的表达、纯化与鉴定周洁;郭晓云;冷静;万彦彬【摘要】目的构建EGFP-CPPs融合基因载体,表达、纯化并鉴定EGFP-CPPs融合蛋白.方法通过碱基合成的方法合成含有CPPs基因序列的EGFP上游引物,PCR 扩增后收集CPPs-EGFP融合基因片段并电泳鉴定,将融合基因表达载体转染大肠杆菌并扩增表达,收集表达蛋白后过层析柱纯化,蛋白电泳检测表达蛋白分子质量,蛋白飞行质谱分析检测蛋白序列,体外细胞实验验证其穿膜功能.结果电泳检测可见与CPPs-EGFP分子质量对应的电泳条带,构建质粒测序含有目的基因序列.蛋白电泳检测到纯度较高的融合蛋白,其蛋白序列与目的序列一致.体外细胞实验证实了融合蛋白的穿膜功能.结论成功制备了具有穿膜功能的CPPsz-EGFP融合蛋白,为其促进抗体-蛋白微球偶联物进入肿瘤细胞发挥治疗作用的研究奠定了基础.【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2010(030)009【总页数】5页(P902-906)【关键词】穿膜肽;增强型绿色荧光蛋白;膀胱肿瘤【作者】周洁;郭晓云;冷静;万彦彬【作者单位】广西医科大学,第一附属医院泌尿外科,广西,南宁,530021;广西医科大学,第一附属医院消化内科,广西,南宁,530021;广西医科大学,第一附属医院免疫学教研室,广西,南宁,530021;广西医科大学,第一附属医院免疫学教研室,广西,南宁,530021【正文语种】中文【中图分类】R392Abstract:ObjectiveTo constructEGFP-CPPsfusion geneticcarrier,express,purify and identify EGFP-CPPs fusion protein.M ethodsUpstream primer containingCPPsgene sequence of green fluorescent was synthesized by basic radical synthesise methods.CPPs-EGFPfusion gene fragmentwas amplificatied by PCR methods and then indentified by electrophoresis.B acillus coliwere transfected with the fusion gene express vector and the fusion gene was amplificated and expressed.Fusion protein was collected and purified by column chromatography.Protein molecularmasswas detected by protein electrophoresis.Protein sequence was detected by TOF analysis.Cell-penetrating function was tested by cell experimentinvitro.ResultsElectrophoresis site corresponding toEGFP-CPPswas displayed in electrophoresis;The gene sequence of constructed plas mid contained the target gene sequence.Purified fusion protein was displayed in protein electrophoresis.Protein sequence was in accord with interested protein sequence.CPPs-EGFP fusion protein displayed Cell-penetrating functionin vitro.ConclusionCPPs-EGFP fusion protein with cell-penetrating function was successfully prepared in the experiment.It is a solid platefor m to support the study of bringing antibody-albumin nanosphere conjugate into tumor cellwith potertial therapeutical effect.Key words:CPPs;EGFP;bladder tumor穿膜肽 (cell-penetrating peptides,CPPs)是人类Ⅰ型免疫缺陷病毒的转录反式激活因子 (truns-activator of transcription,TAT)蛋白的功能结构域,可以通过偶联携带多种大分子物质进入细胞内[1],对基因及蛋白等大分子物质进入细胞内发挥治疗作用有重要意义[2]。

盘状结构域受体2与EGFP融合载体的构建及细胞中的活性分析(一)作者：于江天，苏金，任婷婷，刘新平【关键词】盘状结构域受体2；融合载体；EGFP；磷酰化【Abstract】AIM:Tofindawayofdetectingtheectopicexpressionofdiscoidindomainreceptor2(DDR2)inthecelland oftracingdynamicallytheexpressiondistributionofDDR2protein.METHODS:ThefusionconstructofDD R2withEGFPwasobtainedbyPCRamplicationandrestrictionenzymedigestion,andtransfectedinto293 Tcells.Theexpressionofthegreenfluorescenceproteinwasexaminedbyinvertedmicroscopeandtheex pressionandactivationofthisfusionproteinwasconfirmedbyWesternblot.RESULTS:DDR2/EGFPfusio nplasmidwassuccessfullyconstructed.Furtheranalysisalsodemonstratedthatthefusionproteinhassi milarexpressionandactivationpatternwithwildtypeones.CONCLUSION:Thesuccessinconstructingth efusionplasmidDDR2/EGFPandindetectingitsphosphorylationcanlayafoundationofstudyingthefunc tionofDDR2.【Keywords】discoidindomainreceptor2,fusionvector,EGFP,phosphorylation【摘要】目的：寻找使盘状结构域受体2（DDR2）在细胞内的表达情况易于检测并能动态追踪其蛋白表达分布的途径.方法：采用PCR技术扩增获得DDR2编码区无终止码序列，通过限制性酶切将DDR2片段亚克隆入pEGFPN3载体中，转染293T细胞后通过倒置显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，并用免疫印迹技术检测融合载体的表达及胶原刺激后活化状况.结果：成功构建了DDR2/EGFP融合表达载体，进一步的分析也证明此融合表达载体能在细胞中正确表达并可以被配体所激活.结论：DDR2/EGFP的成功构建及可进一步检测磷酸化，为深入研究DDR2的功能奠定了基础.【关键词】盘状结构域受体2；融合载体；EGFP；磷酰化盘状结构域受体2(DiscoidinDomainReceptor2,DDR2)属于一种受体型蛋白酪氨酸激酶，可被天然纤维型胶原活化〔1-2〕，从而介导基质金属蛋白酶(MMP1,2和13)的表达〔2-4〕.本实验室的前期研究〔5-7〕发现，DDR2在类风湿性关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞中呈高表达状态，并具有较高的磷酸化水平.为了深入研究DDR2介导的信号转导过程，我们旨在克隆其cDNA 序列并将其以易于检测的形式进行表达.1材料和方法1.1材料大肠杆菌DH5α菌种和293T细胞为本室保存；引物由赛百盛公司合成；克隆载体pMD18T,Taq酶,dNTPs,dATP,各种限制性内切酶及T4连接酶（TaKaRa公司）；DMEM培养基和新生小牛血清（Gibico公司）；pEGFPN3表达载体和抗EGFP抗体（Clontech公司）；抗酪氨酸磷酸化抗体4G10（Upstate公司）；DNA提取及回收试剂盒（天为公司）；PCR模板为本室构建的pMD18TDDR2;Lipofectamine2000（Invitrogen公司）;Westernblot所用发光底物（Pierce 公司）;OlympusIX71荧光倒置像差显微镜.1.2方法1.2.1引物设计将DDR2全长无终止码序列命名为WSFDDR2（WithoutStopcodeFulllengthDDR2），根据GenBank中人DDR2分子序列（编号NM_006182）设计引物如下：上游引物UW5＇GCAAGCTTCCAGTTCCAACACCATCTTCTGAG3＇，其中引入HindⅢ酶切位点；下游引物DW5＇GCGGTACCCTCGTCGCCTTGTTGAAGGTGCAG3＇，其中引入KpnⅠ酶切位点.1.2.2PCR扩增及产物修饰在100μL反应体系中加入10×反应缓冲液10μL,10mmol/LdNTP2μL，模板使用本室保留的pMD18TDDR2质粒稀释液6μL,10μmol/L上、下游引物各4μL,pfx高保真DNA聚合酶2U，补水至100μL.扩增条件为94℃5min,94℃1min,55℃1min,68℃2min，后3个步骤重复循环30次.扩增产物回收后以30μLTrisHCl（pH8.0）溶解，并进行加“A”反应：50μL 反应体系中加入5μL10×反应缓冲液，4μLdATP,25mmol/LMgCl23μL，扩增产物30μL,rTaq酶0.5μL，补水至50μL，反应条件为72℃40min.1.2.3PCR产物克隆及序列测定将上述加“A”后的PCR产物回收，回收片段克隆到pMD18T载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆进行酶切鉴定和测序.1.2.4重组表达载体pEGFPN3WSFDDR2的构建用HindⅢ/KpnⅠ将测序成功的WSFDDR2片段从pMD18T载体中切下，并连接入pEGFPN3载体中，构建出重组表达载体pEGFPN3WSFDDR2，并进行酶切鉴定（图1）.1.2.5基因瞬时转染将293T细胞培养于含100mL/L新生小牛血清的DMEM培养基中，按照说明书将pEGFPN3空载体和重组表达质粒pEGFPN3WSFDDR2用Lipofectmine2000转染入70%汇合的293T细胞.1.2.6胶原刺激在293T细胞瞬时转染DDR2/EGFP融合表达载体16h后，以无血清DMEM培养过夜，然后将30mg/L的胶原加入到无血清DMEM培养基中继续与细胞孵育2h.1.2.7裂解细胞及Westernblot分析收取转染或经胶原刺激后的细胞，裂解获得总蛋白，裂解液的成份包括：50mmol/LHEPES（pH7.5）,150mmol/LNaCl,5mmol/LEDTA,10mL/LNP40,2.5g/L 脱氧胆酸钠，10mg/L抑蛋白酶肽，10mg/L亮抑制肽，1mmol/L苯甲基磺酰氟,1mmol/LNa3VO4和50mmol/LNaF.取20μg处理后的蛋白样品进行SDSPAGE分离，然后电转移至硝酸纤维素膜，5g/L脱脂奶粉室温封闭1h，一抗孵育过夜，PBST洗膜，然后与辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗室温孵育1h,PBST洗膜后加入发光底物孵育5min，于暗室中用X光片曝光、显影、定影.。

MK-EGFP融合蛋白的构建和表达
赵宁
【期刊名称】《浙江临床医学》
【年(卷),期】2010(012)004
【摘要】目的克隆中期因子(mid kine,MK)的编码序列,构建MK-EGFP融合表达质粒,诱导表达并亲合纯化.方法用RT-PCR技术从人胚胎组织中获得MK编码基因,构建原核表达质粒pET-MK-EGFP;转化大肠杆菌,诱导表达重组蛋白;纯化回收后鉴定生物活性.结果重组质粒经酶切测序与预期相符,融合蛋白表达后的指示荧光于激光共聚焦显微镜下清晰可见,MK在其中保持了原有的完整构象和生物活性.结论
MK-EGFP重组质粒构建正确,融合蛋白大量表达,并具有完整的生物学活性.
【总页数】3页(P342-344)
【作者】赵宁
【作者单位】310003,浙江大学医学院附属儿童医院血液肿瘤实验室
【正文语种】中文
【相关文献】
1.Oleosin与GUS融合蛋白基因的植物表达载体的构建及融合蛋白性质的预测 [J], 祝钦泷;眭顺照;李名扬;郭余龙;郑丽
2.融合蛋白表达载体MK-EGFP的构建及其在不同肿瘤细胞中的定位 [J], 单筠;俞研迎;龚建光;毛克秋
3.两种具长效性重组人血清白蛋白/干扰素α融合蛋白表达工程菌的构建及融合蛋白的理化特性研究 [J], 富岩;韩国;杨小楠;富俞淞;邢静;胡俊霞;陈颖;云文琦;于在林
4.IL—13融合蛋白表达载体与非融合蛋白表达载体的构建与比较 [J], 王文
5.LFn融合蛋白表达载体的构建及转导融合蛋白进入细胞的研究 [J], 孔毅荣;付玲;郭强;于婷;于长明;陈薇
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甘菊DFL：：EGFP高效融合蛋白表达载体的构建王翊;付建新;戴思兰【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2010(000)002【摘要】增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)是一种优化的突变型GFP,DFL是从甘菊中分离出的LFY基因的同源序列.为了研究DFL 基因的功能和表达模式,研究利用小片段克隆法将linker序列插入到EGFP基因5'端启始密码子前面,在pBI121载体的CaMV35S启动子的3'端后面插入一段多克隆位点,威功地构建了pBI-DFL-EGFP表达载体.通过设计特异引物,利用PCR技术扩增得了到拟南芥LFY基因的启动子序列,用粘性末端PCR技术将pBI-DFL-EGFP 表达载体中CaMV35S启动子替换成LFY基因启动子,构建成了pLFY-DFL-EGFP 表达载体.用舍有pBI-DFL-EGFP和pLFY-DFL-EGFP质粒的农杆菌侵染洋葱表皮细胞,在荧光显微镜下分别用蓝光激发,均观测到了荧光.这一结果表明,融合蛋白DFL::EGFP表达载体构建成功,同时还证明了通过PCR技术克隆到的LFY启动子序列具有启动子功能.【总页数】7页(P102-108)【作者】王翊;付建新;戴思兰【作者单位】北京林业大学园林学院,北京,100083;北京林业大学园林学院,北京,100083;北京林业大学园林学院,北京,100083【正文语种】中文【相关文献】1.融合蛋白表达载体MK-EGFP的构建及其在不同肿瘤细胞中的定位 [J], 单筠;俞研迎;龚建光;毛克秋2.重组EGFP-aquaporin-4融合蛋白真核表达载体的构建及其在FRT细胞中的表达和定位 [J], 李凤娥;郝峰;藏雨轩;马睿泽;孔繁利;刘磊;李艳3.分泌性HIV-1Nef-EGFP融合蛋白表达载体的构建与鉴定 [J], 郝婷婷;马新廷;朱小飞;卢春4.ARRB1融合蛋白表达载体ARRB1-EGFP的构建及其在神经胶质瘤细胞中的表达[J], 文普帅;高静5.ARRB1融合蛋白表达载体ARRB1-EGFP的构建及其在神经胶质瘤细胞中的表达[J], 文普帅;高静;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达张大伟;胡蕴玉;李立文;白文涛;杨香菊;李文献;白建萍【期刊名称】《科学技术与工程》【年(卷),期】2007(007)006【摘要】为构建人LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达及定位,通过基因重组的方法构建LMP3/pEGFP-N3重组真核表达载体,并通过酶切和基因测序鉴定.脂质体法转染HEK293细胞,用倒置荧光显微镜检测、分析其在HEK293细胞表达及定位.经酶切和基因测序鉴定LMP3/pEGFP-N3重组真核表达载体构建成功.转染HEK293细胞后,荧光显微镜检测显示融合蛋白仅在细胞浆中表达.说明基因重组技术可成功构建LMP3/pEGFP-N3重组体真核表达载体,重组表达的融合蛋白仅存在于细胞浆内.【总页数】4页(P972-975)【作者】张大伟;胡蕴玉;李立文;白文涛;杨香菊;李文献;白建萍【作者单位】第四军医大学西京医院全军骨科研究所,西安,710032;第四军医大学西京医院全军骨科研究所,西安,710032;西北大学生命科学院生物科学系,西安,710069;第四军医大学微生物学教研室,西安,7100321;第四军医大学口腔医院正畸科,西安,710032;第四军医大学西京医院全军骨科研究所,西安,710032;第四军医大学西京医院全军骨科研究所,西安,710032【正文语种】中文【中图分类】Q5【相关文献】1.遗传学：LMP3-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293 细胞中的表达 [J], 张大伟2.SK2和 JPH2双基因重组真核表达载体的构建及在 HEK293细胞中的表达 [J], 罗天霞;樊红琨;芮丹丹;孙佳翕;马小芳;章茜3.牛乳状瘤病毒13型pEGFP-E5-N1真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达 [J], 庞峰;史巧芸;朱华培;徐开莲;赵天靖;李亚颖;彭冬梅;李国华;周海龙4.水牛髓样分化因子88融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达 [J], 匡文华;王凤阳;张晓茹;成鹰;杜丽;雷明;焦寒伟;张冬琳;郝永昌;祁超5.pEGFP-C1-MCH真核表达载体的构建及其在HEK293细胞系中的表达 [J], 徐婧;侯赋园;王德彬;李竣;胡鑫;杨光忠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

TAT-EGFP融合蛋白的表达、纯化及穿膜活性研究的开题
报告
介绍：
TAT-EGFP融合蛋白是一种化学合成的蛋白质，由TAT导入肽和EGFP融合而成。

该蛋白可以穿透细胞膜并进入细胞内部，使未被内生信号肽导入的蛋白质也能够进入
细胞，被广泛应用于细胞内嵌入亚细胞结构或组织培养实验中。

本实验选用大肠杆菌作为表达宿主，对TAT-EGFP融合蛋白进行表达、纯化、穿膜活性的研究。

目的：
1. 高效表达TAT-EGFP融合蛋白
2. 进行蛋白纯化，获取高纯度TAT-EGFP融合蛋白
3. 研究TAT-EGFP融合蛋白在细胞内的穿膜能力
方法：
1. 底物的构建
将TAT和EGFP基因进行连接，使用基因重组技术构建TAT-EGFP融合蛋白底物。

2. 大肠杆菌的转化
将构建好的底物质粒转入大肠杆菌DH5α菌株中。

3. 蛋白表达
通过IPTG诱导，利用大肠杆菌对底物进行表达，收集菌株进行后续操作。

4. 蛋白纯化
采用Ni+质粒亲和层析法，结合SDS-PAGE和Western blot分析，纯化TAT-EGFP融合蛋白。

5. 细胞实验
通过荧光显微镜及流式细胞仪等技术，研究TAT-EGFP融合蛋白的穿膜能力。

预期结果：
成功表达、纯化TAT-EGFP融合蛋白，并证明其具有穿膜能力，为进一步研究该蛋白质在生物学及医学领域的应用奠定基础。