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实时荧光定量PCR的研究进展及其应用一、本文概述实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，简称qPCR）是一种在分子生物学领域广泛应用的分子生物学技术，它能够在PCR 扩增过程中实时监测反应产物的积累，从而精确地定量目标DNA或RNA的初始浓度。
自20世纪90年代诞生以来，qPCR技术以其高灵敏度、高特异性、快速性和定量准确等优点，在基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定、基因突变分析、药物研发等多个领域发挥了重要作用。
随着技术的不断发展和完善，实时荧光定量PCR已成为现代生物学研究中不可或缺的工具。
本文旨在全面综述实时荧光定量PCR技术的最新研究进展，包括其原理、方法、技术优化、应用领域的拓展以及面临的挑战等。
文章首先简要介绍qPCR技术的基本原理和常用方法，然后重点论述近年来在技术优化、多重PCR、数字化PCR等方向上的进展。
接着，本文详细探讨实时荧光定量PCR在基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定、基因突变分析、药物研发等领域的应用案例和前景。
文章还将讨论实时荧光定量PCR面临的挑战，如引物设计、数据分析等问题，并提出相应的解决方案。
通过本文的综述，读者可以对实时荧光定量PCR技术的最新进展和应用有一个全面的了解，为相关研究提供参考和借鉴。
二、实时荧光定量PCR的基本原理与技术特点实时荧光定量PCR（Real-time Fluorescent Quantitative PCR，简称qPCR）是一种在PCR扩增过程中，通过对荧光信号的实时检测，对特定DNA片段进行定量分析的技术。
其基本原理是利用荧光染料或荧光标记的特异性探针，在PCR反应过程中实时检测PCR产物量的变化，从而得到DNA模板的初始浓度。
实时性：通过荧光信号的实时检测，可以实时了解PCR产物的生成情况，无需PCR结束后进行电泳等后续操作，大大缩短了实验时间。
定量性：通过标准曲线的建立，可以准确地计算出DNA模板的初始浓度，实现了PCR的定量分析。
实时荧光定量PCR技术在细菌检测中的应用实时荧光定量PCR技术（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种精确、快速的检测方法，广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。
本文将讨论实时荧光定量PCR技术在细菌检测中的应用，并介绍其原理和优势。
一、实时荧光定量PCR技术原理实时荧光定量PCR技术基于传统的PCR原理，通过不断复制并扩增DNA片段，然后采用荧光信号检测系统实时监测PCR过程中的DNA合成数量。
在PCR过程中，引物与靶DNA片段结合并引发DNA合成，同时荧光探针与靶DNA片段结合释放出荧光信号。
荧光信号量与靶DNA的初始数量成正比，通过实时监测荧光信号的强度，可以实时定量测量靶DNA的含量。
二、实时荧光定量PCR技术在细菌检测中的应用1. 快速检测细菌的存在：实时荧光定量PCR技术可以在较短的时间内检测出细菌的存在与数量。
传统的培养方法需要一定的时间来培养细菌，而实时PCR技术几乎可以立即提供结果，帮助及时采取相应的措施。
2. 检测细菌的耐药性：实时荧光定量PCR技术可以检测出细菌对抗生素的耐药性。
通过检测细菌的特定基因或突变，可以判断其对不同抗生素的敏感性，为合理使用抗生素提供指导。
3. 检测细菌的毒力：实时荧光定量PCR技术可以检测细菌的毒力相关基因，帮助研究人员判断细菌的致病能力。
4. 监测细菌感染动态：由于实时PCR技术具有快速、准确等优势，可以用于监测细菌感染的动态变化。
在临床诊断中，可以通过实时PCR技术监测患者体内细菌的数量变化，从而评估治疗效果。
三、实时荧光定量PCR技术的优势1. 高灵敏度：实时荧光定量PCR技术可以检测到非常低浓度的细菌。
在样品中只存在几个细菌时，也能够准确检测出来。
2. 高特异性：实时荧光定量PCR技术通过特异性引物和探针的设计，可确保只扩增目标细菌的DNA片段，并排除其他DNA的干扰。
3. 高准确性：实时PCR技术通过实时监测PCR过程中的荧光信号，可以快速、准确地确定细菌的存在与数量。
实时荧光定量PCR技术的研究进展及应用摘要:实时荧光定量PCR技术通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量的目的,该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前已在动植物基因工程,微生物和医学领域中得到广泛应用。
本文对实时荧光定量PCR技术的原理，检测方法的原理、优缺点进行了评述,重点及创新点是对实时荧光定量PCR 技术在医学领域，食品行业，植物方面的应用进行了比较全面的综述,并对实时荧光定量PCR技术的普及应用及领域的前景做了进一步的展望。
关键词：实时荧光定量PCR；应用；展望Research progress and application of real-time PCRtechnologyAbstract: Real-time PCR technology to detect PCR product by fluorescence quantitative signal strength to achieve the purpose , the technology not only to achieve the PCR from qualitative to quantitative leap , and compared with conventional PCR, it is more specific , effective solution to PCR contamination problem , degree of automation , has been widely used in genetic engineering of plants and animals , microbes and medicine fields . In this paper, the principle of real-time PCR technology, principles , testing methods, advantages and disadvantages are reviewed , the focus and innovation is a real-time PCR technology in the field of medicine , food industry, plant aspects of the application of a more comprehensive overview , prospects and real-time PCR technology in the field of universal application and made a further outlook .Keywords: Real-time quantitative PCR; application ; Outlook聚合酶链反应(PCR)技术自1985年问世以来，以其灵敏性高、特异性强和速度快在分子生物学等科研领域得到了广泛应用。
第16卷第4期 2007年8月 中国组织化学与细胞化学杂志CH I NESE J O URNAL O F H I ST OCHE M I STR Y AND CY T OCHE M I STR Y Vol 1161No .4Aug .2007实时荧光定量PCR 技术的原理及其应用研究进展赵焕英 包金风3(首都医科大学北京神经科学研究所,北京市神经再生修复重点实验室,教育部神经变性病重点实验室,北京 100069)〔关键词〕 实时荧光定量PCR; 荧光标记探针; DNA 结合染料〔中图分类号〕 Q52311 〔文献标识码〕 A〔收稿日期〕2006210231 〔修回日期〕2007201226〔作者简介〕赵焕英,女(1975),汉族,在读硕士研究生。
3通讯作者(To whom corres pondence should be addressed ) 自从1983年Mullis 发明聚合酶链式反应(poly merase chain reacti on ,PCR )以来,PCR 技术很快成为科研、临床诊断的热点技术。
但是传统PCR 技术在应用中一是不能准确定量,二是容易交叉污染,产生假阳性。
直到近年来荧光共振能量转移(fluorescence res onance energy transfer ,FRET )技术用于PCR 定量后,上述问题才得到较好的解决[1]。
实时荧光定量PCR (real 2ti m e fluor o 2genetic quantitative PCR ,F Q 2PCR )是在PCR 定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。
它是一种在PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
该技术不仅实现了对DNA 模板的定量,而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点,目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域[2]。
实时荧光定量PCR技术的研究进展与应用实时荧光定量PCR技术的研究进展与应用引言实时荧光定量PCR技术（Real-time quantitative polymerase chain reaction）是一种基于PCR技术的分子生物学方法，可用于精确测量目标DNA或RNA的数量。
该技术在许多领域得到了广泛的应用，如医学诊断、基因表达分析、病原体检测以及环境监测等。
一、实时荧光定量PCR技术的原理实时荧光定量PCR技术基于PCR反应过程中，目标DNA（或RNA）序列的指数级扩增特性。
该方法需要引物与目标序列相互结合，合成适量的荧光探针用于监测PCR过程中目标序列的扩增程度。
其中，引物是起始特异性扩增的核酸片段，荧光探针含有荧光染料和荧光阻断剂。
当探针结合至目标序列时，就会被5'→3'外切酶降解，并释放荧光信号，实时监测PCR反应进程。
二、实时荧光定量PCR技术的优势1. 高灵敏度和高精确度：实时荧光定量PCR技术通过荧光信号的动态监测，可准确测量目标序列的扩增数量。
其灵敏度能够达到单个拷贝级别，且可靠性高，消除了传统PCR中间断性的'瓶颈'效应。
2. 快速和高通量：相比传统PCR技术，实时荧光定量PCR所需的时间更短，反应速度快。
通过多重PCR反应孔，可以同时测定多个样品，提高了检测效率。
3. 广泛的应用范围：实时荧光定量PCR技术不仅适用于基因表达、基因突变和SNP（单核苷酸多态性）的检测，还可用于病原体的检测和定量，如病毒感染、细菌感染等。
4. 可靠的检测结果验证：通过内参基因和集成阳性对照，可以消除检测结果偏差，确保检测结果的准确性和可靠性。
三、实时荧光定量PCR技术的应用1. 医学诊断：实时荧光定量PCR技术在临床医学诊断中具有很大的潜力，可用于早期肿瘤标志物、病原体和遗传疾病的检测与定量。
例如，可通过检测突变基因来判断特定癌症患者对某些药物的敏感性，从而为精准化治疗提供依据。
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR，Real-time qPCR）是一种通过荧光信号实时测量PCR产物累积量的技术，可以在PCR反应过程中实时监测PCR 产物的数量。
这种技术结合了常规PCR技术的放大特异性和荧光标记探针的特异性探测，使得PCR分析更加准确、精确。
实时荧光定量PCR技术广泛应用于基因表达分析、病原体检测、细胞检测、突变分析等领域。
下面将分别介绍该技术在不同领域的应用研究进展。
在基因表达分析中，实时荧光定量PCR可用于测量特定基因在不同组织或不同发育阶段中的表达量。
该技术的灵敏度高、动态范围广，并可同时分析多个基因。
通过实时监测PCR产物的累积，可以获得准确的基因表达水平。
实时荧光定量PCR还可以用于研究非编码RNA的表达，如长非编码RNA（lncRNA）和微小RNA（miRNA）。
在病原体检测中，实时荧光定量PCR可用于快速、准确地鉴定和定量各类病原体。
各类病毒、细菌、真菌等的快速检测和定量分析。
由于实时荧光定量PCR具有高灵敏度和高特异性，能够在短时间内完成大量样本的分析，广泛应用于临床诊断和食品安全领域。
在细胞检测中，实时荧光定量PCR被用于检测细胞中的特定基因表达水平，并研究基因在细胞中的调控机制。
通过测量细胞内转录因子基因的表达变化，可以了解基因调控网络的变化情况。
在突变分析中，实时荧光定量PCR可用于检测某一基因的突变频率，如药物抗性相关基因的突变频率。
通过实时监测突变型和野生型基因的相对数量，可以计算出突变频率，为个性化药物治疗提供参考。
实时荧光定量PCR技术具有高灵敏度、高特异性、高准确度和高通量性等优点，在生命科学研究和临床应用中发挥着重要作用。
随着技术的不断进步和应用领域的不断拓展，实时荧光定量PCR技术在分子生物学领域的应用前景将更加广阔。
实时荧光定量PCR技术的原理及应用在PCR扩增反应结束之后，可对扩增产物进行定性和定量的分析。
但是无论定性还是定量分析，分析的都是PCR终产物。
但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经PCR扩增之前的起始模板量。
例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。
在这种需求下荧光定量PCR技术应运而生。
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，实现了PCR从定性到定量的飞跃。
1.实时荧光定量PCR技术的基本原理在实时荧光定量PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
所谓实时荧光定量PCR技术，是指通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。
一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段, 荧光信号指数扩增阶段和平台期。
在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。
而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA 拷贝数。
只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。
在扩增曲线中：荧光阈值(threshold)是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光本底信号(baseline)标准差的10倍；Ct值的含义是指在PCR循环过程中,荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数,也就是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环次数；Rn+表示每点测量的荧光强度,代表反应管含有模板DNA ;Rn-表示荧光基线强度,代表反应管不含有模板DNA,其在理想情况下是一条平线,只具有背景荧光数值;ΔRn表示PCR过程中,探针降解的量,也即PCR产物的量；基线( baseline)是背景曲线的一段,范围为从反应开始不久荧光值开始变得稳定,到所有反应管的荧光都将要但是还未超出背景。
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展
一、实时荧光定量PCR技术原理及方法
实时荧光定量PCR技术是一种结合了PCR和荧光信号检测的新型分析技术。
其原理是通过引入一种荧光探针或染料，使PCR反应进行过程中产生的DNA片段或RNA片段能够发出荧光信号，从而实现对PCR产物的实时监测和定量分析。
在实时PCR过程中，荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，因此可以通过测定荧光信号的强度来定量PCR产物的数量。
实时荧光定量PCR技术的方法包括SYBR Green I法和探针法两种。
SYBR Green I法是利用SYBR Green I染料与DNA双链结合时发出荧光的特性，实现对PCR产物的定量分析。
探针法则是引入一种特定的探针分子，当探针与PCR产物结合时，荧光信号会产生变化，从而进行定量分析。
两种方法各有优缺点，研究者可根据具体实验需求选择合适的方法进行实时PCR分析。
实时荧光定量PCR技术在医学诊断中具有重要的应用价值。
它可以用于病原体检测，如病毒、细菌等的快速定量分析。
通过设计特异性的引物和探针，可以实现对病原体的快速检测和定量分析，为临床诊断提供重要的依据。
实时荧光定量PCR技术还可以用于基因突变的检测，如常见的遗传病突变、肿瘤基因突变等。
通过对基因突变的定量分析，可以为临床诊断和治疗提供重要的信息。
实时荧光定量PCR技术还可以用于药物代谢酶基因的表达分析，从而指导个体化药物治疗。
实时荧光定量PCR技术在医学诊断中有着广泛的应用前景，有望成为未来医学诊断的重要手段。
实时荧光定量PCR的应用和进展实时荧光定量PCR是一种先进的生物技术，广泛应用于各个研究领域。
本文将介绍实时荧光定量PCR的应用领域、技术原理、实验流程以及应用前景。
实时荧光定量PCR在许多领域都有广泛的应用，如基因表达研究、病毒检测、基因突变分析、基因克隆和定量分析等。
基因表达研究：实时荧光定量PCR可以用于检测特定基因在不同组织或处理条件下的表达情况，有助于了解基因的功能和调控机制。
病毒检测：实时荧光定量PCR是一种非常灵敏的病毒检测方法，可快速、准确地检测出病毒的复制和含量，对于疫情防控和治疗具有重要意义。
基因突变分析：实时荧光定量PCR结合特异性探针技术，可以用于检测基因突变，对于遗传学研究和疾病诊断具有重要价值。
基因克隆和定量分析：实时荧光定量PCR可以用于基因克隆和定量分析，帮助研究人员了解基因的序列和功能，为基因治疗和药物研发提供支持。
实时荧光定量PCR的技术原理是基于PCR扩增过程中的荧光信号进行检测和分析。
在PCR扩增过程中，特异性荧光探针与目标DNA序列结合，探针上的荧光基团在特定光源的照射下发出荧光，通过检测荧光信号的强度可以确定目标DNA的含量。
同时，通过对起始模板的定量，可以计算出目标DNA的起始拷贝数。
由于荧光信号的特异性，该技术具有高灵敏度、高准确性和高特异性。
实时荧光定量PCR的实验流程包括以下几个步骤：设计特异性引物和荧光探针：根据目标DNA序列设计特异性引物和荧光探针，以确保引物和探针能够与目标DNA准确结合。
样品处理：将待测样品进行处理，提取出其中的DNA。
配置PCR反应液：将PCR反应液进行配置，包括dNTPs、Taq酶、特异性引物、荧光探针和DNA模板等。
PCR扩增：在PCR仪中进行扩增，记录每个循环中的荧光信号强度。
数据分析和解释：通过对荧光信号强度的分析和解释，可以得到目标DNA的起始拷贝数和相对表达量。
在设计引物和探针时，要确保其与目标DNA序列的特异性结合，避免非特异性结合造成的误差。
第16卷第4期 2007年8月 中国组织化学与细胞化学杂志CH I NESE J O URNAL O F H I ST OCHE M I STR Y AND CY T OCHE M I STR Y Vol 1161No .4Aug .2007实时荧光定量PCR 技术的原理及其应用研究进展赵焕英 包金风3(首都医科大学北京神经科学研究所,北京市神经再生修复重点实验室,教育部神经变性病重点实验室,北京 100069)〔关键词〕 实时荧光定量PCR; 荧光标记探针; DNA 结合染料〔中图分类号〕 Q52311 〔文献标识码〕 A〔收稿日期〕2006210231 〔修回日期〕2007201226〔作者简介〕赵焕英,女(1975),汉族,在读硕士研究生。
3通讯作者(To whom corres pondence should be addressed ) 自从1983年Mullis 发明聚合酶链式反应(poly merase chain reacti on ,PCR )以来,PCR 技术很快成为科研、临床诊断的热点技术。
但是传统PCR 技术在应用中一是不能准确定量,二是容易交叉污染,产生假阳性。
直到近年来荧光共振能量转移(fluorescence res onance energy transfer ,FRET )技术用于PCR 定量后,上述问题才得到较好的解决[1]。
实时荧光定量PCR (real 2ti m e fluor o 2genetic quantitative PCR ,F Q 2PCR )是在PCR 定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。
它是一种在PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
该技术不仅实现了对DNA 模板的定量,而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点,目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域[2]。
11实时荧光定量PCR 技术的概述111荧光共振能量转移原理1992年H iguchi 等首次提出了采用动态PCR方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分析,荧光探针技术是基于标记基团的FRET 原理而实现的,当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠,且两个基团距离足够近时,能量可以从短波长(高能量)的荧光基团传递到长波长(低能量)的荧光基团,相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽,这个过程称为FRET 。
在探针5’端标记一个报告基团(R ),在3’端标记一个淬灭基团(quencher,Q ),两者距离很近时(7210n m ),报告基团发出的荧光能被淬灭基团所吸收,并依赖其较高的S/N 比值(信2噪比,signal 2t o 2noise rati o )和良好的辨别能力进行定量检测。
112实时荧光定量PCR 几个重要参数①荧光域值(threshold ):以PCR 反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,一般荧光域值定义为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
②Ct 值:也称循环阈值,C 代表Cycle,t 代表threshold 。
Ct 值是指样品管的荧光信号达到某一固定阈值的PCR 反应循环数。
在PCR 循环过程中,即荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。
在实际操作中,这个时刻也就是每个反应管内的荧光信号到达设定的域值的时刻,可见Ct 值取决于阈值。
③ΔRn:是指模板DNA 的起始拷贝数(图1所示)。
经数学证明,Ct 值与模板DNA 的起始拷贝数(ΔRn )成反比。
典型的PCR 分4给阶段(图2)。
图1 实时荧光定量PCR 几个重要参数Fig .1 The i m portant para meters of real ti m ePCR图2 典型的PCR 分4个阶段Fig .2 The 4phases of real ti m e PCR21实时荧光PCR的分类实时荧光PCR是在扩增产物聚集的过程中连续检测,即“实时”检测,根据在指数扩增期的产物量来推算初始模板的拷贝数[3]。
实时荧光定量PCR包括探针类和染料类两种,探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。
染料类如SY BR Green I则是利用与双链DNA小沟结合发光的理化特征指示扩增产物的增加。
前者由于增加了探针的识别步骤特异性更高;但后者则简便易行、成本较低。
211荧光标记探针按其基团标记和能量转移的方式,目前已经开发出几种相关的技术,大体可以分为水解探针和杂交探针两类。
如Taq ManT M探针(水解探针)、Taq man MG B(水解探针)(Dual2oligo FRET pairs (双杂交探针)、Molecular beacons(杂交探针)、Scor p i ons T M/Amp lifluor T M(杂交探针)、Univer2 sal p r obe library LNA(l ocked nucleic acids(水解探针)、Lux(light upon extenti on杂交探针)、Si m p le p r oble探针等[4]。
21111Taq Man探针法这种探针的长度为20-24bp,在其5’末端标记一个荧光报告基团,3’末端标记一个荧光淬灭基团,其序列与两引物包含序列内的一段DNA模板完全互补。
该法利用Taq酶的5’→3’外切酶活性,当探针保持完整时,淬灭基团吸收发射基团的发射荧光。
当有特异的而不是非特异的PCR发生时,Taq酶同时发挥其5’→3’外切酶活性,将与模板杂交上的探针切碎,报告基团与淬灭基团分离,淬灭作用被解除,荧光信号释放,可以检测到。
荧光信号的强度与PCR反应产物的量成正相关。
在PCR反应中设立标准品模板系列和阴性对照,根据FRET原理,探针完整时发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。
当PCR扩增时,Taq酶的5′→3′外切酶活性将探针酶切降解,使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个游离的荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步,并计算出Rn值、△Rn 值、Ct值和阈值。
同时利用标准品模板系列绘制出标准曲线,结合各样品的Ct值,就可以确定样品的起初模板量。
常用的荧光基团是F AM、TET、V I C、HEX(图3)。
图3 Taq Man探针Fig.3 Taq M an Pr obe21112Taq man MG BTaqman MG B探针是Taqman探针的基础上改进的,在探针的3’端增加了MG B(m inor gr oove binder)分子,这种物质能够结合在双链DNA小沟部位;MG B提高了探针的T M值,从而使它能够分辨1个碱基的差别:完全配对,有荧光信号;一个碱基不匹配,则没有信号;而且连在MG B分子后的是非荧光物质的淬灭基团,因此使这种探针具备更好的淬灭效果且无背景荧光、荧光标记灵活、提高荧光信号的信噪比、提高退火温度、探针短、提高S NP识别率等优点。
从而具备了更加广泛的应用前景(图4)。
图4 Taq Man MG B探针Fig.4 Taq Man MG B p r obe21113双杂交探针双杂交探针是Roche公司新近开发的一种PCR 定量技术,也是依赖于FRET原理进行的。
该技术的特点是将荧光基团和淬灭基团分别标记在发光探针的5′端和淬灭探针的3′端两个不同的探针,两探针可与模板同一条链相邻的序列杂交,杂交时两探针的荧光基团和淬灭基团便紧密相邻(1-5个碱基),从而发生FRET而使荧光淬灭,荧光淬灭的程度与起始模板的量成反比,以此可以进行PCR定量分析。
该方法的特点是淬灭效率高,但由于两个探针结合于模板上,因此影响扩增效率;此外,由于需要合成两个较长的探针,合成成本相对较高,常用的荧光基团是LC2Red640和LC2 Red705(图5)。
图5 双杂交探针Fig15 T wo2hybrid p r obe394 第4期 赵焕英等.实时荧光定量PCR技术的原理及其应用研究进展21114分子信标分子信标(molecular beacon )技术是一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针,环形部分的碱基可与目标核苷酸序列互补,一般为15-30个核苷酸长;茎部是由互相配对的碱基组成,不能与目标基因相配对结合,一般5-7个核苷酸长;在3′和5′端分别接上发光基团和淬灭基团,当溶液中有特异模板时分子信标与模板杂交,从而破坏了发卡结构即实现了FRET ,释放出荧光信号,荧光的强度与溶液中分子信标的量成正比,从而实现了对目的基因的定量检测。
当PCR 扩增过程中,靶序列DNA 链不断增加,探针与之杂交,探针的发夹形结构被打开,呈线性,荧光报告基团与淬灭基团彼此在空间上产生足够的分离,荧光基团脱离了淬灭基团的影响,从而产生可被检测到的荧光(图6)。
常用的荧光基团有F AM 和Texas Red 。
图6 分子信标Fig 16 Molecular beacon21115Amp lisens or 检测系统是由美国B i otrnics Tech 公司推出的荧光定量PCR 检测系统,其基本原理是先进行一次不对称扩增;第二轮扩增时,在双链信号引物的两条互补链上,分别标记荧光供体和受体,当信号引物处于双链结构时产生荧光。
在PCR 过程中,变性使引物荧光基团分离,复性时引物将优先与不对称扩增产物结合,使引物不再产生荧光。
Amp lisens or 检测系统采用半套式扩增和双链引物,特异性高,灵敏度与竞争性PCR 相似。
21116Universal p r obe library 2LNA (l ocked nu 2cleic Acids )新近Roche 公司研发并建立了人类和鼠的通用探针库,其探针是由“锁定核酸”组成。
他们通过分析人的转录组识中所有不同的可能的8至9碱基序列,按照他们在转录组中出现的频率分类,找出最普便的8至9碱基序列模式制备成通用探针;每一个探针可以与7000个转录子杂交。
这种探针的特异性由探针和引物共同实现。
LNA 是一种双RNA 聚合的类似物,其2π2位的氧原子与核糖4π2碳原子形成亚甲基的桥键,并分别在5π和3π标记上荧光报告基团和淬灭基团;LNA 单体掺入寡核苷序列可以增加形成体的T m 值,其稳定性比P NA 高(P NAS2000,97:563325638)1因LNA 与DNA 杂交较DNA 与DNA 、DNA 与RNA 甚至P NA 与DNA 杂交有更高的亲和性,故这种探针稳定性最好;而且探针实现了设计迅速简单、低成本的水解探针特点。
