实时荧光定量pcr原理及引物设计
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荧光定量pcr的原理方法
荧光定量PCR(Fluorescent Quantitative PCR,qPCR)是一种用荧光信号量化检测PCR产物的方法,用于定量分析目标DNA或RNA的含量。
荧光定量PCR的基本原理如下:
1.引物设计:设计特异性引物,使其能够特异性地扩增目标DNA或RNA序列。
2.模板DNA或RNA的提取:从样品中提取目标DNA或RNA。
3.cDNA合成:对于RNA样品,需要首先将RNA反转录成cDNA,作为PCR 的模板。
4.Real-time PCR扩增反应:将模板DNA或cDNA与引物和荧光探针一起加入PCR反应体系中,进行实时PCR扩增。
PCR反应体系中还包括核苷酸,聚合酶和缓冲液等。
5.荧光信号检测:随着PCR的进行,荧光探针被解旋成单链,释放出与之配对的荧光染料。
荧光染料产生荧光信号,信号强度与扩增产物的数量成正比。
6.荧光信号检测系统:荧光信号检测系统实时检测PCR反应体系中的荧光信号,并将其转换成数值。
7.标准曲线绘制:通过使用已知浓度的标准品进行一系列稀释,绘制出标准曲线。
标准曲线将荧光信号强度与目标DNA或RNA的初始浓度之间建立了一个标准关系。
8.样品定量:通过对样品的荧光信号强度进行测量,并使用标准曲线进行插值计算,确定样品中目标DNA或RNA的初始浓度。
荧光定量PCR具有高灵敏度、高特异性、宽动态范围、低检测限和快速分析等优点,广泛应用于分子生物学和疾病诊断等领域。
实时荧光定量PCR的原理操作及其应用实时qPCR的基本原理是利用DNA模板进行PCR扩增,并通过特定荧光探针或抑制剂标记扩增产物,荧光信号的强度与目标模板数量成正比。
PCR扩增过程中,荧光信号逐渐累积,通过荧光检测系统实时监测荧光的强度变化,可以获取PCR扩增曲线,并通过比较样品的荧光信号与标准曲线建立一个浓度与荧光信号的转换关系,从而确定样品中目标物质的数量。
实时qPCR的操作过程通常包括以下几个步骤:1.准备反应体系:根据所需扩增物质选择合适的引物和探针,并根据样品数量和扩增条件计算所需反应体系的配方。
反应体系中通常包括DNA模板、引物、探针、dNTPs、缓冲液和DNA聚合酶等。
2.设定PCR程序:根据不同引物的特性和样品的要求,设置PCR程序。
PCR程序通常包括一个初始变性步骤,多个循环变性/退火/延伸步骤和一个终止步骤。
循环变性/退火/延伸步骤的温度和时间通常根据引物的需求进行设定。
3.反应体系装填:将反应体系装入PCR管或耐热反应板中,确保样品和反应物均匀分布。
4.实时监测:将PCR反应体系置于实时荧光PCR仪中,根据设定的PCR程序进行扩增,并实时监测荧光信号的累积变化。
5.数据分析:根据荧光信号的变化情况,可以绘制PCR扩增曲线,并通过计算荧光信号的阈值周期数(Ct值)来确定样品中目标物质的相对数量。
比较不同样品的Ct值,可以进行定量分析。
实时qPCR具有广泛的应用。
1.基因表达分析:可以通过实时qPCR检测特定基因在不同组织或样品中的表达水平,从而研究基因在生理和病理过程中的作用。
2.病原体检测:实时qPCR可以用于快速、准确地检测和鉴定病原体,如细菌、病毒和寄生虫等,对于临床诊断和流行病学研究具有重要意义。
3.检测基因突变:实时qPCR可以用于检测个体中基因突变的存在与否,并进行基因型分析,从而研究与疾病相关的突变和遗传变异。
4.微生物学研究:可以通过实时qPCR检测微生物的数量和动态变化,了解其在环境中的分布和生物地理学特征,以及其在食品安全、环境保护等方面的应用。
概述荧光定量PCR技术的基本原理
荧光定量PCR技术是一种用于定量测量目标DNA序列数量的技术。
它基于普通PCR技术,但在PCR反应中引入了一种荧光探针,以实现对产物扩增过程的实时监测和定量测量。
实现荧光定量PCR的基本原理如下:
1. 选择适当的引物和荧光探针:引物用于特异性扩增目标DNA序列,而荧光探针用于标记并检测PCR产物的存在。
2. 引物和荧光探针的设计:引物的设计要确保特异性扩增目标DNA序列,而荧光探针通常由一个荧光染料和一个荧光淬灭器组成,荧光染料在引物与目标DNA序列结合时发荧光信号,而荧光淬灭器则抑制荧光信号。
3. PCR反应条件的设置:包括扩增温度、循环数等参数的设置,以确保高效的PCR扩增反应。
4. 实时监测PCR反应:在PCR反应过程中,荧光探针与目标DNA序列结合并发荧光信号,荧光信号的增加与PCR产物的扩增过程成正相关。
通过荧光信号的强度可以定量测量目标DNA序列的数量。
5. 分析数据:根据荧光信号的强度和扩增循环数,可以绘制荧光增幅曲线,并通过内部标准物质或标准曲线来计算目标DNA序列的浓度。
荧光定量PCR技术具有高灵敏度、高特异性和高准确性的优点,可以用于基因表达分析、突变检测、病原体检测等领域。
实时荧光定量PCR原理1.PCR基本原理PCR通过在不断循环的体系中复制和放大特定DNA片段,从而实现DNA的快速扩增。
PCR反应通常包括三个步骤:变性、退火和延伸。
在变性步骤中,DNA的双链结构被解开,形成两条单链DNA。
在退火步骤中,引物与目标DNA的互补序列结合,形成引物-目标DNA结合复合物。
在延伸步骤中,DNA聚合酶通过追加互补碱基,并使用引物作为起始点,在目标DNA的基础上合成新的DNA链。
实时荧光PCR是对传统PCR技术的改进,它通过添加荧光探针(也称为探针引物)来实时监测PCR反应的进程。
荧光探针通常由两部分组成:一个荧光标记物和一个定向增效子。
在PCR反应的延伸步骤中,荧光探针与目标DNA的互补序列结合,并被PCR酶切割,导致荧光信号被释放。
3.原理图解实时荧光PCR通常需要使用一个双喷嘴热循环仪(Thermal Cycler),其中一个喷嘴用于控制样品的温度,另一个喷嘴用于实时监测PCR反应的进程。
具体的PCR反应流程如下:-备制PCR试剂:将PCR反应所需的试剂混合均匀,包括DNA模板、引物、荧光探针和内参物。
-生成PCR产物:通过一系列的循环反应,将DNA模板放大成大量的PCR产物。
-荧光信号监测:PCR反应过程中,荧光探针与PCR产物的结合会释放荧光信号。
实时荧光PCR系统通过探测和记录PCR反应体系中的荧光信号,并在每个循环结束时测定信号强度。
4.数据解读和PCR效率计算实时荧光PCR的结果通常以荧光信号的周期阈值(Ct值)表示,Ct值是荧光信号强度超过背景噪音的循环数。
Ct值越低,表示PCR产物浓度越高,反之亦然。
根据Ct值,可以计算PCR的效率。
效率(E)的计算公式为:E =10^(-1/slope) - 1,其中slope为荧光曲线的斜率。
效率越接近1,表示PCR反应越有效。
5.RT-qPCR的应用RT-qPCR可应用于多个领域,包括基因表达分析、病原体检测和药物开发等。
实时荧光定量PCR技术的原理及其应用引言实时荧光定量PCR(Polymerase Chain Reaction)技术是一种细胞遗传学和分子生物学研究中常用的分子检测技术。
它能够迅速、准确地进行DNA或RNA的定量测量,并在许多领域中广泛应用,例如基因表达分析、病原微生物检测和病毒定量等。
本文将重点介绍实时荧光定量PCR技术的原理和一些典型应用。
实时荧光定量PCR技术原理实时荧光定量PCR技术是在传统PCR反应的基础上发展而来的一种PCR变体。
其原理可以简单概括为光信号的实时检测和荧光强度的定量分析。
实时荧光定量PCR技术的具体步骤如下:1.引物与探针设计在实时荧光定量PCR反应中,合适的引物和探针设计是至关重要的。
引物用于在反应中特异性地扩增目标DNA或RNA序列,而探针则用于荧光信号的检测。
引物和探针的设计需要确保其与目标序列的亲和力和特异性,以避免非特异性扩增和假阳性结果。
2.标定曲线制备为了进行定量分析,需要事先制备一条标定曲线。
标定曲线通常是通过浓度已知的目标序列的一系列稀释样品制备的。
这些稀释样品经过PCR扩增后,荧光信号的强度与初始浓度呈线性关系。
通过测量待测样品的荧光信号强度,并利用标定曲线进行外推,可以获得目标DNA或RNA的定量结果。
3.PCR反应体系组装PCR反应体系的组装需要考虑到引物和探针的最优浓度,以及反应缓冲液、酶和模板DNA或RNA的最佳配比。
此外,反应体系中还需要加入辅助成分,如酶抑制剂和荧光染料,以提高PCR反应的特异性和灵敏度。
4.实时荧光检测及数据分析在PCR反应进行过程中,荧光信号会随着目标DNA或RNA的扩增而增强。
实时荧光定量PCR仪会实时监测和记录荧光信号的变化情况,并生成扩增曲线。
通过分析荧光信号的增长速度和荧光信号的峰值,可以确定目标DNA或RNA的起始浓度。
实时荧光定量PCR技术应用1. 基因表达分析实时荧光定量PCR技术在基因表达分析中被广泛应用。
实时荧光定量pcr的原理
实时荧光定量PCR是一种基于聚合酶链反应(PCR)的技术,用于测量DNA或RNA分子的数量。
它通过将荧光探针引入PCR反应混合物中,利用荧光信号的增加来定量PCR过程中
的DNA合成。
实时荧光定量PCR原理的核心是荧光探针的使用。
荧光探针
通常包含一个荧光染料和一个与其配对的探针序列。
在PCR
过程中,荧光探针与PCR引物一起在目标序列的特定位置结合,并被DNA聚合酶酶切为两个片段。
当荧光探针与目标序列结合时,荧光染料受到荧光共振能量转移的影响,导致荧光信号暗淡。
随着DNA合成的进行,DNA
聚合酶将到达荧光探针的剪切位点,荧光染料被释放并发出荧光信号。
实时荧光定量PCR设备配有一个光学检测系统,能够在PCR
反应混合物中的每一个循环中检测荧光信号的强度。
该系统测量荧光信号的增加,并将其转化为相应的荧光单位。
通过与标准曲线比较,可以确定在每个PCR循环中合成的
DNA量。
标准曲线是在已知浓度下制备的DNA模板的荧光强度与其相对DNA浓度之间的关系。
通过测量荧光信号的强度,并用标准曲线进行校正,可以得到PCR反应混合物中目标
DNA的初始数量。
因此,实时荧光定量PCR可以定量测量PCR反应中的DNA
合成,并提供高灵敏度和准确性的结果。
它广泛应用于分子生物学、遗传学、病原体检测等领域,成为许多实验室中常用的技术。
实时荧光定量PCR的原理及实验无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断,还是研究药物对基因表达水平的影响,或者监控药物和疗法的治疗效果,定量pcr技术都可以发挥很大作用。
定量pcr技术的最新进展是实时荧光定量。
该技术借助于荧光信号来检测pcr产物,一方面提高了灵敏度,另一方面还可以做到pcr每循环一次就收集一个数据,建立实时扩增曲线,准确地确定ct值,从而根据ct值确定起始dna拷贝数,做到了真正意义上的dna定量。
这是dna定量技术的一次飞跃。
根据最终得到的数据不同,定量pcr可以分为相对定量和绝对定量两种。
典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化,得到的结果是百分比;绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。
根据所使用的技术不同,荧光定量pcr又可以分为taqman探针和sybr green i荧光染料两种方法。
比较而言,探针杂交技术在原理上更为严格,所得数据更为精确;荧光染料技术则成本更为低廉,实验设计更为简便。
在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。
定量实验与定性实验最大的不同,是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正,以消除偶然误差。
因此重复实验和设立内对照非常重要。
由于各种各样的客观原因,这一点在实践中往往被轻视或忽视,需要着重强调。
当然,与定性实验一样,定量pcr也要设立阴性和阳性对照,以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。
1为什么终点定量不准确?我们都知道理论上pcr是一个指数增长的过程,但是实际的pcr扩增曲线并不是标准的指数曲线,而是s形曲线。
这是因为随着pcr循环的增多,扩增规模迅速增大,taq酶、dntp、引物,甚至dna模板等各种pcr要素逐渐不敷需求,pcr的效率越来越低,产物增长的速度就逐渐减缓。
当所有的taq酶都被饱和以后,pcr就进入了平台期。
由于各种环境因素的复杂相互作用,不同的pcr反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化,难以精确控制。
实时荧光定量PCR的原理1.PCR反应:2.荧光探针:实时荧光定量PCR通常使用两种类型的荧光探针来检测扩增过程:探针型Ta qMan探针和缺失型探针。
其中,探针型Ta qMan探针包含一个引物序列和一个标记荧光物。
在反应的延伸过程中,引物结合到目标序列上,同时荧光物会被系统特定的DNA聚合酶切断,从而释放出荧光信号。
缺失型探针则使用两个引物来结合目标序列的两个不同区域,其中一个引物上标记了荧光物,另一个引物上是荧光物对应的抑制剂。
当两个引物结合到目标序列上时,抑制剂阻止荧光物的释放,从而抑制荧光信号。
这两种探针的核心原理是通过荧光信号的释放或抑制来定量PCR扩增过程中的产物。
3.荧光信号检测:实时荧光定量PCR使用荧光实时检测系统检测PCR反应过程中的荧光信号。
常见的检测系统包括荧光比色法、熔解曲线分析法和荧光信号累积法等。
荧光比色法是将PCR反应体系加入一种荧光染料,其荧光信号随着PCR过程中产物的累积而增加。
熔解曲线分析法则通过逐渐升高温度,分析PCR产物的特征性熔解温度,从而确定PCR反应的特异性。
荧光信号累积法利用PCR反应产物与荧光探针的结合释放出的荧光信号的数量与产物量成正比的原理,定量PCR产物的数量。
4.数据分析:实时荧光定量PCR的数据分析通常使用阈值循环数(Ct)方法。
Ct值定义为PCR反应的循环数,PCR产物的荧光信号超过设定阈值的循环数。
Ct值越小,说明待测DNA的起始量越多。
通过建立标准曲线,将待测样品的Ct值与标准曲线对应的起始DNA量进行比较,从而计算出待测样品的目标DNA的起始量。
总体来说,实时荧光定量PCR通过引入荧光探针并使用荧光信号检测系统,实现对PCR反应中的产物进行实时定量。
其原理简单可靠,广泛应用于基因表达、突变检测、病毒定量等领域,是分子生物学研究中不可或缺的工具之一。
实时荧光定量pcr检测原理实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。
这种方法通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析。
Real-timePCR是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。
由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。
实时荧光定量PCR的基本原理是利用DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性,在DNA合成过程中检测荧光信号的变化。
当DNA聚合酶与特定荧光染料标记的DNA引物结合时,荧光染料会被标记在引物的3’端。
在PCR反应过程中,每当DNA聚合酶添加一个核苷酸到引物3’端时,聚合酶的外切酶活性将荧光染料从引物上切割下来,释放出荧光。
通过实时检测荧光信号的变化,可以实时监测DNA的合成过程。
实时荧光定量PCR的定量原理是利用PCR扩增的指数时期,模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。
在PCR扩增的指数时期,随着循环次数的增加,DNA产物的量呈指数增长。
在这个阶段,每个循环的DNA产物量与上一个循环的DNA产物量成比例。
因此,通过实时检测荧光信号的变化,可以确定PCR进程中的DNA产物量。
由于每个模板的起始拷贝数不同,因此不同模板的Ct值也不同。
通过比较不同模板的Ct值,可以确定模板的起始拷贝数。
实时荧光定量PCR具有许多优点,如高灵敏度、高特异性和高自动化程度。
它可以用于多种类型的样本检测,包括血液、组织、细胞培养液等。
此外,实时荧光定量PCR还可以用于基因表达分析、突变检测和病原体鉴定等应用。
实时荧光定量PCR是一种非常有用的技术,可以用于多种类型的样本检测和分析。
它的基本原理是利用DNA聚合酶的外切酶活性和荧光染料标记的引物来实时监测DNA的合成过程。
通过比较不同模板的Ct值,可以确定模板的起始拷贝数,从而实现定量分析。
定量PCR的原理和应用一、定量PCR的概述定量PCR(Quantitative PCR,简称qPCR)是一种用于精确测定DNA或RNA 在样本中的相对或绝对数量的技术。
相比传统的定性PCR,定量PCR能提供更加准确和可靠的分子生物学定量分析结果。
本文将介绍定量PCR的原理、方法和应用。
二、定量PCR的原理定量PCR基于传统PCR技术,通过测量PCR产物的实时累积情况来确定起始模板的数量。
其主要原理包括:1.设计引物和探针:定量PCR需要使用特异性引物和荧光探针来扩增和检测目标序列,引物的设计应考虑碱基配对的特异性和温度互补性。
2.实时检测:在PCR反应过程中,荧光探针与目标序列发生特异性结合,形成荧光信号。
通过实时监测PCR产物的荧光信号强度,可以确定目标序列的起始数量。
3.标准曲线法:定量PCR通常需要构建标准曲线来确定目标序列的起始数量。
标准曲线是由一系列已知起始数量的标准品制备而成,根据标准曲线上的荧光信号强度和已知起始数量的关系,可以推断出未知样本中目标序列的起始数量。
三、定量PCR的步骤定量PCR通常包括以下步骤:1.样本处理:将待测样本中的DNA或RNA提取和纯化,以获得高质量的核酸模板。
2.引物和探针设计:根据目标序列的特异性和相关基因信息,设计引物和荧光探针。
3.PCR反应体系的配置:根据实验需求和PCR仪器要求,配置PCR反应混合液,包括引物、荧光探针、DNA模板和PCR反应缓冲液等。
4.PCR反应条件的设置:确定PCR反应的温度和时间参数,包括退火温度、延伸时间和扩增周期数等。
5.实时荧光监测:将PCR反应体系加载到实时荧光PCR仪中,监测PCR反应过程中荧光信号的强度变化。
6.数据分析:利用实时荧光PCR仪软件对荧光信号数据进行分析,绘制标准曲线和计算目标序列的起始数量。
四、定量PCR的应用定量PCR在生物学研究和临床诊断中具有广泛的应用。
以下是定量PCR的主要应用领域:1.基因表达分析:通过定量PCR可以测定不同组织或细胞中特定基因的表达水平,揭示基因在生物学过程中的功能和调控机制。
实时荧光定量pcr的原理和方法实时荧光定量PCR(qPCR)是一种分子生物学技术,用于检测和定量特定DNA或RNA序列的存在和相对丰度。
它可以在短时间内快速、准确地测量目标序列的数量,并在许多领域中被广泛应用,包括基因表达分析、病原体检测和基因突变分析等。
实时荧光定量PCR的主要原理是通过放大DNA模板,并使用荧光探针或染料进行实时监测。
这些荧光探针通常是DNA寡核苷酸序列,带有一个共振能量转移对(RET pair),由一个荧光引物(donor)和另一个荧光引物(acceptor)组成。
在初始的PCR循环中,通过在高温下使DNA变性,使两个引物和DNA分离。
在下一个低温的退火步骤中,这两个引物会与DNA互补结合。
当两个引物结合到DNA模板上时,它们的荧光引物也会接近彼此,从而使共振能量转移发生,导致荧光信号减弱或消失。
这种现象被称为荧光淬灭。
当PCR循环继续进行时,每个复制周期会以指数级增加DNA模板的数量。
由于引物的结合会导致荧光淬灭,因此在每个PCR循环的末尾,荧光信号将与DNA模板的数量成正比。
实时荧光定量PCR中常用的荧光探针有探针PCR和SYBR Green。
探针PCR使用两个引物和一个荧光探针,该探针带有一个荧光团和一个辅助荧光团。
在荧光探针与DNA模板结合时,两个荧光团之间的共振能量转移会发生,导致荧光信号的减弱。
SYBR Green则是一种将DNA结合的染料,在PCR循环中,SYBR Green会与所有DNA结合,并发出荧光信号。
使用探针PCR时,可以通过测量荧光信号的减弱来确定目标DNA的存在量。
而使用SYBR Green时,可以通过测量荧光信号的增加来判断目标DNA的数量。
实时荧光定量PCR的操作过程如下:1. DNA提取和纯化:从样品中提取所需的DNA或RNA,并经过纯化处理,以去除可能干扰PCR反应的杂质。
2. 引物设计:设计适合的引物和荧光探针,以在PCR反应中特异性地扩增目标序列。
实时荧光定量PCR原理操作及其应用实时荧光定量PCR的原理是通过PCR反应循环进行DNA扩增,同时使用特定的荧光探针进行反应监测。
通常使用SYBR Green I染料或荧光探针(例如TaqMan探针或Molecular Beacons)来标记扩增的目标序列。
SYBR Green I染料可以与双链DNA结合,并产生荧光信号,使荧光信号量和PCR产物量成正比。
而荧光探针则与靶标区域特异性杂交,并在PCR 反应中产生荧光信号。
1.DNA/RNA提取:从样品中提取目标DNA或RNA,确保提取的质量和纯度满足后续PCR反应的需求。
2.引物设计:设计和合成适当的引物,用于扩增目标序列。
引物应该具有高特异性,确保只扩增目标序列,而不出现非特异性扩增。
3.qPCR反应体系:配置PCR反应体系,包括引物、模板DNA/RNA,核酸酶、聚合酶、缓冲液和荧光探针(如果使用)。
4.PCR反应程序:设置PCR反应程序,通常包括初步变性、扩增和检测阶段。
PCR循环次数根据目标序列的丰度和检测灵敏度来确定。
5.监测荧光信号:在PCR反应过程中实时监测荧光信号的强度。
根据荧光信号大小可以计算目标序列的拷贝数。
1.基因表达分析:通过qPCR可以定量检测和分析基因在不同生物样品(如组织、细胞)中的表达水平。
2.病原体检测:qPCR可以快速检测和定量病原微生物(如细菌、病毒、真菌)的DNA或RNA,用于临床诊断和流行病学调查。
3.突变分析:qPCR可以检测和定量基因突变,用于遗传病的诊断和研究。
4.体外诊断:qPCR可以用于检测和定量很多疾病相关的生物标志物,如肿瘤标志物、心脏病标志物等,用于疾病的早期诊断和疗效评估。
5.生物学研究:qPCR可以用于研究和分析基因调控、DNA修复、细胞周期等生物过程,以及研究新的基因和基因功能。
总之,实时荧光定量PCR技术可以实时、准确和敏感地定量检测并扩增DNA或RNA的特定序列,具有广泛的应用前景,对于许多研究和诊断领域都具有重要意义。
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通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。
实时荧光定量PCR是实验室最常用的实验。
研究基因在mRNA表达水平,以及验证基因敲除后下游靶基因变化情况等等。
对于新手来说,如何快速设计引物呢?首先,推荐三个在线设计实时荧光定量PCR引物的网站,不用安装软件,直接上网就可搞定。
一、Primerbank1. 首先进入网站主页,/primerbank/。
选择Keyword,根据自己需求选择种属以及基因名称。
比如设计人类BCL2基因。
2.点击submit后可以看到以下界面,网站会推荐多对引物,可以根据引物长度、Tm值选择。
二、Pubmed1. 在Pubmed网站找到BCL2基因组序列,点击FASTA获得基因序列后,将基因序列下载到桌面上。
2.点开pubmed主页上面的Blast,进入Primer-BLAST, 输入基因序列,可以根据自己实验要求选择引物长度。
3.点击Get primer之后,可以得到多对引物序列。
可以根据引物长度等要求进行筛选。
三、Primerplus31.在Pubmed-gene获得基因序列后,在primer3plus主页上输入基因序列,网址; /cgi-bin/dev/primer3plus.cgi。
2.点击general setting,设置引物扩增长度,一般可设置扩增长度偏大一些,然后根据推荐引物选取合适扩增长度。
3. 点击pick primers后,首先会看到优选推荐的一对引物,同时在序列中看到引物所在位置。
Primer3plus网站中可以看到引物Tm值以及GC含量。
最后简单介绍一下实时荧光定量PCR引物设计原则:(1)引物长度一般在15~30碱基之间,过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于TaqDNA聚合酶进行反应。
PCR和定量PCR的引物和探针设计PCR(聚合酶链反应)和定量PCR(实时荧光定量聚合酶链反应)是现代分子生物学中常用的实验技术,用于扩增和检测DNA序列。
在 PCR和定量 PCR 中,引物(primers)和探针(probes)的设计是非常重要的,因为它们直接影响到实验的灵敏度和特异性。
引物是一对短的DNA分子,通常由15-30个核苷酸组成,它们会被限制性酶切割出位于目标序列两端的DNA片段。
引物的设计需遵循以下几个原则:1.引物的碱基组成:引物应具有合适的碱基组成。
GC含量较高的引物有更强的互补性和比特性,但也更容易形成二聚体,影响PCR反应的特异性和效率。
通常引物的GC含量应在40%-60%之间。
2.引物的长度:引物的长度应在18-28个碱基对之间。
引物过短会导致扩增产物的非特异性,引物过长会降低扩增效率。
3. 引物的 Tm 值: Tm 值(熔解温度)是指引物与模板 DNA 结合时解链的温度。
引物的 Tm 值应保持一致,一般在55°C - 65°C 之间。
在设计扩增子(amplifier)时,引物的 Tm 值差异应在1°C 以内,以确保扩增的特异性。
探针是一种特殊的分子,它包含一个与目标序列完全互补的引物序列和一个荧光染料分子。
探针的设计需遵循以下几个原则:1. 荧光染料的选择:选择一个与实验设备所能感测的波长相适应的荧光染料。
常见的荧光染料有荧光素(Fluorescein)、荧光素异硫氰酯(FITC)以及羧基甲基罗damine(ROX)等。
2. Quencher 的选择:设定探针的Quencher。
一般使用的Quencher是BHQ1,或者参考其他文献上的Quencher的讯息。
3.引物和探针的序列:引物和探针的序列应与目标序列完全互补。
引物和探针的设计应尽量避免任意位置出现连续的鸟嘌呤(G)或者鸟嘧啶(C),以避免互结和三聚体的形成。
4.引物和探针的位置:引物和探针的位置非常重要。