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奶牛母牛的胚胎移植技术俗称借腹怀胎，是提高良种母牛繁殖潜力、加快品种更新的一项实用高新技术。
主要包括供体、受体的准备，供体的超数排卵与配种，胚胎的收集、检查、冷冻保存和移植等几个基本环节。
1．供体、受体的准备供体、受体均要求为青壮年牛，膘情中等偏上，繁殖机能正常，一般应有2个以上正常的繁殖周期。
此外，供体应是良种，鲜胚移植时，供、受体发情要同步，数量比例要适当，一般为1:5-8为宜。
2．供体的超数排卵与配种牛每次发情后一般只排一个卵，利用外源性促性腺激素处理能使卵巢一次排出多个卵子，即为超数排卵技术。
通常在母牛发情周期的第9-14天肌肉注射FSH进行超排处理，连续注射4天，每日早晚各一次，总量为40-50毫克，剂量均等或递减，第三天的第五次注射时，同时注射PGF2a。
，一般在注射48小时后，母牛即发情排卵。
超排处理以后的发情供体母牛，用活率高、密度大的优良公牛精液配种，适当增加人工授精的次数，两次输精间隔8-10小时。
3．胚胎的收集牛胚胎移植通常用非手术法，利用双通式导管冲卵器多次向子宫角注入冲卵液，反复冲洗回收桑椹至囊胚期胚胎。
4．胚胎的检查在实体显微镜下从回收的冲卵液中检出胚胎，主要依据形态学进行分类，选发育阶段正常，外形匀称，卵裂球比较紧密的A、B级胚胎可供移植或冷冻保存。
目前，每头供体牛一般可获得8枚左右可用胚。
5．胚胎的冷冻保存胚胎冷冻保存可以克服鲜胚移植受时间、地点等因素的限制，为胚胎移植技术推广应用和充分发挥其优势提供了保证。
冷冻方法有缓慢降温法、快速冷冻法和一步冷冻法等3种。
快速冷冻法因胚胎解冻后存活率及移植成功率较高，为目前生产中最常用的方法。
简要介绍如下：室温条件下，先将胚胎加入1.4摩尔甘油冷冻液中脱水平衡20分钟，再装入0.25毫升细管，然后将装有胚胎的细管放入程控冷冻仪中，0℃平衡10分钟，以1℃/分的速度降至-6－-7℃，人工植冰并平衡10分钟，然后以0.3℃/分的速度降温至-35－-38℃，投入液氮保存。
一、实验背景随着生物技术领域的不断发展，胚胎移植技术已经广泛应用于畜牧业生产中。
近年来，关于胚胎移植后胚胎发育与受体母体相互作用的研究逐渐增多。
本研究旨在探讨胚胎移植过程中，胚胎与受体母牛脑部的相互作用及其对胚胎发育的影响。
二、实验材料与方法1. 实验动物：选取健康、发育正常的荷斯坦奶牛作为供体，选取年龄、体重、健康状况相似的荷斯坦奶牛作为受体。
2. 实验分组：将供体和受体奶牛随机分为三组，每组5头。
3. 胚胎采集：采用超排卵技术采集供体奶牛的卵母细胞，体外受精后培养至桑椹胚期，进行胚胎移植。
4. 脑部组织采集：在胚胎移植后第5天、第10天、第15天分别对受体奶牛进行麻醉，采集脑部组织样本。
5. 实验方法：a. 采用免疫组化技术检测受体奶牛脑部组织中与胚胎发育相关的基因表达。
b. 利用实时荧光定量PCR技术检测受体奶牛脑部组织中相关基因的mRNA表达水平。
c. 采用蛋白质印迹技术检测受体奶牛脑部组织中相关蛋白的表达水平。
三、实验结果1. 胚胎移植后，受体奶牛脑部组织中与胚胎发育相关的基因表达水平显著升高。
2. 实时荧光定量PCR结果显示，受体奶牛脑部组织中相关基因的mRNA表达水平在胚胎移植后第5天、第10天、第15天均显著升高。
3. 蛋白质印迹结果显示，受体奶牛脑部组织中相关蛋白的表达水平在胚胎移植后第5天、第10天、第15天均显著升高。
四、讨论与分析1. 胚胎移植过程中，受体奶牛脑部组织中与胚胎发育相关的基因表达水平显著升高，表明胚胎移植对受体奶牛脑部组织产生了显著影响。
2. 实时荧光定量PCR和蛋白质印迹结果显示，受体奶牛脑部组织中相关基因和蛋白的表达水平在胚胎移植后第5天、第10天、第15天均显著升高，提示胚胎移植后受体奶牛脑部组织可能发生了适应性改变，以适应胚胎的发育需求。
3. 本研究结果表明，胚胎移植过程中，受体奶牛脑部组织与胚胎之间可能存在相互作用，这种相互作用可能对胚胎发育产生重要影响。
Cow Reproduction and Management奶牛胚胎移植技术要点及应用前景操礼军1，汪 晖2，杜婷婷1，刘 莉1*，胡永青1*1 新疆畜牧科学院畜牧业质量标准研究所，新疆乌鲁木齐 8300002 新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，新疆乌鲁木齐 830000摘 要：胚胎移植方案增加了遗传改良并缩短了世代间隔。
因此，胚胎移植作为一种有利的技术，有助于在短时间内实现遗传进步和增加有价值的育种者数量。
牛胚胎移植技术涉及供体和受体动物的选择和管理，以及胚胎的收集和移植。
在牛中使用胚胎移植的主要目标是提高有价值的雌性的繁殖率。
因此，有价值的雌性的后代数量增加到至少比正常情况下高出5 倍的水平。
体内胚胎生产的阶段包括供体动物和受体动物的选择，所选供体和受体的发情周期的同步，诱导超排卵和随后的供体授精，收集（通过子宫冲洗），胚胎的评估和移植。
牛胚胎移植计划的成功和经济取决于多种因素：在任何胚胎移植计划中，使用高质量的精液和高比例的正常运动细胞是非常关键的一步；转移的对象必须是与供体处于同一周期的受者；受赠者必须具有经证实的生殖能力，无先天性或传染性疾病，以获得高受孕率，并具有健壮的体型，以避免难产问题。
目前胚胎移植已广泛应用在遗传改良、种畜繁育和保种、疾病控制、基因工程研究等方面。
随着技术的发展，胚胎移植必将在实际生产中发挥更多的应用价值。
关键词：奶牛；胚胎移植；应用；前景文章编号：1671-4393（2023）09-0074-06 DOI:10.12377/1671-4393.23.09.120 引言在畜牧业中，胚胎移植技术已成为动物学家和育种学家改善畜群遗传，并迅速增加优良畜种的有力工具，目前已广泛应用在遗传改良、种畜繁育和保种、疾病控制、基因工程研究等方面。
具体到牛上，胚胎移植技术是指将一头良种母牛配种后的早期胚胎取出，移植到另外一头或数头同种的、生理状况相同或相似的母牛生殖道的适当基金项目：自治区重大科技专项-新疆奶业创新项目（2020A01001-4-3-1）作者简介：操礼军（1973-），男，安徽桐城人，本科，高级畜牧师，研究方向为遗传育种；汪 晖（1986-），女，新疆乌鲁木齐人，本科，实验师，研究方向为农产品品质检测与评价；杜婷婷（1997-），女，新疆奎屯人，硕士，研究方向为食品营养与安全。
动物胚胎工程技术的研究进展及展望摘要：动物胚胎工程是用人工的方法对动物卵母细胞或胚胎进行改造的技术，在育种中可使优良的种质特性和遗传潜力得到充分的发挥，是家畜繁殖领域的一次技术革命。
本文综述了动物胚胎工程包含的技术及研究进展，并对胚胎工程技术发展前景进行了展望。
关键词：胚胎工程；技术；研究进展动物胚胎工程是用人工的方法对动物卵母细胞或胚胎进行改造的技术，包含胚胎移植、排卵控制、胚胎冷冻保存、体外受精与显微受精、胚胎分割与胚胎嵌合、胚胎性别控制、胚胎干细胞、动物克隆等技术[1]。
这些技术的出现不仅大大扩展胚胎移植的研究领域，而且促进畜牧业、医药卫生行业发展，具有重大理论意义。
1 胚胎移植技术哺乳动物的胚胎移植始于1890年，当时英国剑桥大学Heape首次获得兔受精卵移植的成功。
Heape的成功，第一次证实了受精卵在寄主体内发育的可能性，从而奠定胚胎移植的生理学基础和原则。
2 排卵控制排卵控制分为排卵时间控制和排卵数量的控制。
控制排卵时间的目的是得到特定发育阶段卵母细胞，如做微注射转基因使用的原核胚。
排卵数量的控制又称为超数排卵，是为了获得更多的卵子。
目前在控制排卵中常用的激素有FSH、LH、PMSG、HCG等[3]。
3 胚胎冷冻保存胚胎冷冻是对胚胎采取一定保护措施和降温程序，使之在-196℃条件下细胞内一切新陈代谢过程中的化学反应被抑制从而处于一种“停滞”状态，但又不失去升温后恢复代谢的能力，从而能够得到长期保存的一种生物技术[4]。
玻璃化冷冻技术作为一种新发展起来的生物技术，具有许多潜在的应用价值。
而应用此项技术进行卵母细胞冷冻保存，可将优良品种动物废弃卵巢中的大量卵母细胞保存起来，向建立“精子库”和“胚胎库”那样建立“卵子库”，为体外受精、核移植、转基因等各种胚胎生物技术的开展提供充足的材料，并解除了时间和空间上的限制；而且可以为珍稀动物、濒危动物的遗传资源的保存提供可能。
5 胚胎分割和嵌合5.1 胚胎分割胚胎分割是采用显微手术的方法，将早期胚胎一分为二，一分为四或更多次的分割，再（或经过体外培养后）移回受体妊娠产仔，是动物克隆的一种[8]。
REPRODUCTION & BREEDING繁殖育种2018·9奶牛胚胎移植技术研究进展薛洁1,2，刘文浩1，吕湾2，杨海昱2，杨凌2，李荣岭1，李建斌1，仲跻峰1（1.山东省农业科学院奶牛研究中心，济南 250131；2.河北工程大学，邯郸 056001）中图分类号：S858.23 文献标识码：A 文章编号：1004-4264（2018）09-0022-05DOI: 10.19305/ki.11-3009/s.2018.09.006摘 要：胚胎移植技术是一项能够充分发挥优秀母畜繁殖潜力的技术。
本文概述了奶牛胚胎移植技术的研究进展，包括超数排卵、胚胎收集、胚胎移植、胚胎冷冻保存、体外胚胎培养、胚胎分割、胚胎活检和性别鉴定以及胚胎克隆。
关键词：超数排卵；胚胎移植；胚胎分割；胚胎性别鉴定胚胎移植（ET）是提高动物繁殖力的一种有效方法。
虽然母牛的胚胎移植不能体现出公牛的遗传潜力，但可以让母牛生产更多的后代，比一年一次的自然分娩更能发挥优秀母牛的作用。
1890年，Heape将2个四细胞时期的安哥拉兔胚胎移植到一只受精的比利时兔输卵管中，产下了4只比利时和2只安哥拉幼兔[1]，这是第一次成功移植哺乳动物胚胎。
目前，结合活体采卵（OPU）、体外受精（IVF）和ET的体外胚胎生产已经发展成为一种替代传统超排和ET的方法。
而胚胎冷冻、储存等技术使得在国际间运输胚胎、防止某些传染病传播、青年牛提前受孕产犊成为可能，还可以在移植前进行胚胎评估（如遗传价值或遗传疾病等）。
1 超数排卵ET通常从超数排卵开始。
Casida等首先开展了牛的超数排卵研究[2]，后来，英国剑桥农业研究委员会的Rowson等开发了使用孕马血清促性腺激素/马绒毛膜促性腺激素（PMSG）诱导超排的方法[3]。
由于PMSG半衰期长，只需要注射一次就可达到超排的目的，但发现经常回收到不成熟的卵泡和低质量的胚胎，超排效果相当不稳定。
Dziuk等研究了利用促卵泡素（FSH）进行超数排卵的方法[4]。
给母牛每天注射2次FSH，连续注射4d，可获得更一致的超排结果[5]。
多年来，商业化ET程序已形成，一般牛在发情的第8~13天注射FSH，而同期发情方案使超排更容易、方便。
最近有报道指出，使用透明质酸作为稀释剂注射1或2次FSH的超排效果，与用盐水作为稀释剂多次注射FSH的超排效果一致[6,7]。
超数排卵的一个显著特征是动物对促性腺激素处理的反应不一致。
在牛上使用类似的超排方案，可以回收0~100个卵母细胞，其中优质胚胎有0~60个。
过去的25年里，牛超排获得胚胎的平均数量变化不大。
美国胚胎移植协会（AETA）报告指出，1998~2010年，肉牛超排获得胚胎的平均数（7.1个/次）比奶牛（6.2个/次）略多一些。
实际上与Looney报道的2.000多头肉牛超排获得的胚胎平均数（6.2个/次）和Hasler等报道的600多头荷斯坦牛超排获得的胚胎平均数（6.4个/次）没有差异。
2 胚胎收集最初，收集牛胚胎需要进行手术。
手术具有侵入性、费用高、耗时长的缺点，且需要专门技术人员及复杂的手术设施，并且不能在农场现场进行。
此外，奶牛收稿日期：2018-01-30基金项目：国家奶牛产业技术体系建设专项经费（CARS-36）；山东省农业科学院农业科技创新工程（CXGC2016A04）；山东省农业良种工程（2016LZGC027）；山东省自然基金面上项目（ZR2016CM37）。
作者简介：薛洁（1996-），女，硕士生，研究方向为奶牛育种；刘文浩（1972-），本科，副研究员。
两人为共同第一作者。
通讯作者：李建斌，博士，研究员；杨凌，博士，教授。
REPRODUCTION & BREEDING繁殖育种2018·9原因可能是发生了布鲁氏菌病。
20世纪70年代，牛胚胎几乎全部通过中线切口手术法移植，并且与手术采集胚胎的缺点相似。
加拿大魁北克省MeGill大学Baker开发了一个相对简单的侧腹部移植手术，并很快应用于农场。
该方法在美国的大规模ET中证明是非常成功的，怀孕率可超过70％[12]。
然而，侧腹手术移植并不理想，因为使用该方法包括固定牛只和术前腰椎区局部麻醉，再手术打开侧腹部，然后在无菌条件下找到子宫角，通过子宫角穿刺移植胚胎，最后缝合切口。
非手术法移植的研发得益于定时人工授精技术（AI）的发展。
供体和受体同步发情对于成功的ET来说非常重要，还可以减小受体牛群的大小。
在一项研究中[12]，前列腺素诱导发情的受体与自然发情的受体相比，妊娠率略有上升。
发情不同步会影响鲜胚和冻胚的怀孕率，在24h内同步对怀孕率没有显著影响，胚胎移植从手术转为非手术移植，妊娠率没有明显的下降[13]。
非手术ET的一个早期问题是没有使用特定的设备，1984~1985年IMV公司引入了针对非手术ET的设备后，使不同鲜胚移植方案的妊娠率相近。
然而，相对于手术法，成功的非手术法需要更多的经验，特别是丰富的直肠触诊经验[10]。
4 胚胎冷冻保存尽管Polge等首次报道了精子冷冻保存成功，但冷冻胚胎会100％死亡。
胚胎比精子含有更多的水分，所以有效脱水至关重要，这可以防止冰冻对胚胎的伤害。
直到1972年，小鼠胚胎冷冻保存成功[14]。
1973年首次报道了牛胚胎冷冻保存成功[15]。
同冷冻精子一样，最佳冷却速率也适用于冷冻胚胎。
最佳冷却速率取决于细胞含水量和易脱水程度。
由于早期胚胎细胞非常大，所以冷却速率就要非常慢（<1℃/min）。
系统地比较降温速率、升温速率和不同防冻剂的使用效果后发现，以-0.5℃/min的速率将胚胎从-5~7℃冷却到-30~-35℃，可使水有足够的时间渗出细胞，而不会形成破坏性的细胞内冰晶。
之后的改进是在细胞过脱水前，将冷却的胚胎（-30~-35℃）投入液氮，还要以最小化渗透肿胀的方式从细胞中除去冷冻保护剂[16]。
1976年英国向新西兰出口牛冷冻胚胎，此举证明对于有价值遗传物质的国际交换来说，胚胎冷冻保存无可替代。
的泌乳使胚胎回收或转移难以顺利进行，而对个别动物的反复手术往往使卵巢发生粘连等疾病。
非手术回收对于ET实践者和动物来说更简单，且成本相对较低。
最初Rowson和Dowling [8]在剑桥研发了非手术法。
他们制造了一台用于从活体中采集胚胎的设备，该设备有一个带有充气口的导管，可以穿过子宫颈冲洗子宫角。
Minnesota大学的Dziuk等[4]和日本的Sugie [9]也报道了非手术采集胚胎的技术。
Drost等和Rowe等报道了使用Foley导管的进展。
此后，商业ET使用该技术的数量迅速增加。
非手术采集牛胚胎通常要使用大量的冲洗液（500~2000mL）来冲洗子宫。
这种冲洗液通常被收集在一个1L的量筒中，30min或更长时间后，胚胎将沉降到底部。
然后丢弃大部分冲洗液，在剩下的100mL中检索胚胎。
20世纪80年代中期，研究了几种胚胎过滤器模型，其中最好的一个开发成商品。
过滤器可以连接非手术冲洗设备的流出管，然后用冲洗液可通过的不锈钢或尼龙筛将胚胎封入塑料杯中，缩短了检索卵子和胚胎的时间，非常方便。
在商业化产品出现前，大多数ET研究者均使用自己制作的培养液。
通常使用含有1％的热处理过的新生小牛血清改良Dulbecco's.PBS进行冲洗，而使用10％新生小牛血清来保存胚胎[10]。
现在，一些公司制造并销售专门用于冲洗、保存、转移和冷冻保存的培养液。
这些培养液一般不含血清，但牛血清白蛋白（BSA）是常见的成分。
经证明，不含生物来源成分且不需要冷藏的合成培养液也是有效的[11]。
尽管牛胚胎发育到7d时进行冷冻保存最佳，但通常在发情后6~8d收集，胚胎处于桑葚胚后期到囊胚阶段。
显微镜评估包括确定发育阶段（特别参考收集当天）、胚胎结构、卵裂球的外观形态、分化程度和其他退化迹象等。
胚胎质量的描述性定义最早由Elsden等提出，目前仍然作为胚胎质量评估的基础。
牛胚胎的质量评价是Robertson和Nelson基于形态学提出的，现在国际上已经认可。
3 胚胎移植1949年，Umbaugh报道了在德克萨斯州进行了牛的胚胎移植，并且4头受体牛妊娠，但后来全部流产，REPRODUCTION & BREEDING繁殖育种2018·9现今，胚胎冷冻保存是ET程序的重要组成部分。
事实上，美国约有70％的牛胚胎被冷冻，而不是在收集后立即转移。
冷冻技术可以使胚胎一次性收集，然后在另一个合适的时间、地点，根据确切的受体数量进行移植。
20世纪80年代早期，二甲基亚砜是最常用的冷冻保护剂，后来被甘油取代，随后乙二醇作为冷冻保护剂被迅速而广泛地接受[17]。
直接移植就是将细管解冻并放置在ET枪中。
在直接移植之前，先将胚胎解冻，然后用蔗糖将胚胎复水，并重新装入细管进行移植。
使用乙二醇法直接移植对ET产业发展具有积极影响。
Hasler报道，从鲜胚移植转为冻胚移植，妊娠率会降低10%~13%[13]。
Hasler认为胚胎发育阶段也是影响冻胚移植是否成功的重要因素，从73.000次的移植数据得出：晚期桑椹胚（4期）、早期囊胚（5期）、囊胚（6期）及扩张期囊胚（7期）的受胎率分别是53.7％、55.3％、52.1％和43.8％，6期和7期胚胎妊娠率显著低于4期和5期[18]。
5 体外胚胎培养IVF通常指组成胚胎体外生产（IVP）的所有步骤，包括体外成熟、IVF和体外培养。
1951年，Chang和Austin首次证明了兔和大鼠精子获能的必要性。
兔是第一个通过IVF产生后代的哺乳动物[19]。
然而，兔和小鼠的IVF程序最初并不能应用于牛。
Iritani和Niwa首次报道了牛IVF的成功案例，他们使用了发情期母牛输卵管、子宫或兔子宫中的获能精子[20]。
Newcomb等证明体外成熟的卵母细胞可以在牛输卵管中受精并生产小牛[21]。
1981年，第一头试管牛在Pennsylva-nia大学出生。
Critser等移植体外成熟-IVF的牛胚胎并成功分娩。
Hanada.等移植IVF胚胎，成功分娩了两头小牛。
1987年，在爱尔兰都柏林大学出生了第一批来自体外成熟、IVF和体外培养的小牛[22]。
整个80年代，牛体外胚胎生产技术仍然是主要的研究技术，但ET行业很少使用。
利用直肠超声波采卵的技术，通常称为OPU，已经成为活牛采卵的主要技术。
20世纪80年代，OPU和IVP的发展为商业ET方案奠定了基础[10]。
此期，另外两个重要发现为：一是39℃下的牛卵母细胞可更有效地进行IVF [23]；二是体外精子获能（使用肝素）的发展[24]。
美国利用OPU技术年生产胚胎的总量从2000年的2.000个增加到2015年的32.000个。
