葡萄籽原花青素对慢性间歇性低氧大鼠脑组织炎症反应及学习记忆能力的影响
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doi：10．3969/j．issn．1671-6825．2014．01．009葡萄籽原花青素对慢性间歇性低氧大鼠脑组织炎症反应及学习记忆能力的影响*赵雅宁1，2)，曹书华3)#，郭霞2)，王红阳2)1）天津中医药大学天津3000002）河北联合大学康复医学院唐山0630003）天津市第一中心医院急救医学研究所天津300000#通讯作者，男，1945年10月生，主任医师，教授，研究方向：重症医学，E-mail：zyning789@126．com关键词间歇性低氧；p38MAPK；IL-1β；学习记忆能力；葡萄籽原花青素；大鼠中图分类号Ｒ767摘要目的：探讨葡萄籽原花青素对慢性间歇性低氧大鼠脑组织炎症反应及学习记忆能力的影响。
方法：56只雄性SD大鼠随机分成对照组、模型组和葡萄籽原花青素高、低剂量干预组。
对照组暴露于空气中，余3组制备慢性间歇性低氧模型（低氧处理6周）。
葡萄籽原花青素高和低剂量干预组在低氧处理前2周开始每天1次灌胃葡萄籽原花青素200和100mg·kg－1。
低氧处理第2和6周，采用水迷宫实验测试大鼠学习记忆能力，电镜观察海马区神经细胞超微结构，免疫印迹法检测海马区脑组织磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）和IL-1β的表达。
结果：与对照组比较，模型组神经细胞超微结构受损严重，脑组织p-p38MAPK和IL-1β表达升高，水迷宫实验逃避潜伏期延长、穿台次数减少（P＜0．05）。
与模型组比较，葡萄籽原花青素干预组神经细胞超微结构的损伤减轻，脑组织p-p38MAPK和IL-1β表达水平降低，水迷宫实验逃避潜伏期缩短、穿台次数增多（P＜0．05）；高剂量干预组变化更为显著（P＜0．05）。
结论：葡萄籽原花青素可能通过减轻脑组织炎症反应，改善慢性间歇性低氧大鼠的学习记忆能力。
Effect of grape seed proanthocyanidin on inflammation and learning mem-ory capacity of rat model of chronic intermittent hypoxiaZHAO Yaning1，2），CAO Shuhua3），GUO Xia2），WANG Hongyang2）1）Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin3000002）Ｒehabilitation College，Hebei United University，Tangshan0630003）Emergency Medicine Unit，Tianjin First Central Hospital，Tian-jin300000Key words intermittent hypoxia；p38MAPK；IL-1β；learning memory capacity；grape seed proanthocyanidin；ratAbstract Aim：To investigate the effect of grape seed proanthocyanidin on inflammation and learning memory capaci-ty of rat with chronic intermittent hypoxia．Methods：A total of56male SD rats were randomly allocated into four groups：control group，model group，low and high dose of grape seed proanthocyanidin groups．Ｒats in control group were exposed in air，those in the other3groups suffered from intermittent hypoxia conditions for6weeks．2weeks before the hypoxia treatment，rats in low and high dose of grape seed proanthocyanidin groups were began to intragastricly administrate grape seed proanthocyanidin at dose of100and200mg·kg－1，once per day，respectively．At the2nd and6th week of hypoxia treatment，neuron pathology in hippocampal region was observed using electron microscope，the expressions of phosphoryla-ted p38MAPK and IL-1βproteins were detected by Western blot，and the learning memory capacity of rats were assessed by the Morris water maze．Ｒesults：Compared with those of control group，the microstructure of neuron was severely injured，the expressions of phosphorylated p38MAPK and IL-1βproteins significantly increased，and the escaping latency was pro-longed，the frequency of crossing the platform decreased in the model group（P＜0．05）．Compared with those of the model*河北省教育厅重点资助项目ZH2012046group，neuron pathology changes significantly improved，phosphorylated p38MAPK and IL-1βexpressions in brain tissue decreased，the escaping latency was shorter and the frequency of crossing the platform increased in the2grape seed proan-thocyanidin groups（P＜0．05），and the above mentioned changes in the high dose group were more significant（P＜0．05）．Conclusion：Grape seed proanthocyanidin could attenuate inflammation and improve learning memory capacity in rats with intermittent hypoxia．阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征（obstructive sleep aplnea-hypopnea syndrome，OSAHS）可造成患者警觉、执行能力和运动协调方面的认知障碍［1-2］。
OS-AHS神经损伤机制复杂。
临床资料［3］显示OSAHS 患者体内存在明显的炎症反应增强，而炎症反应在缺血缺氧性脑损伤的发生发展中发挥重要作用，且与认知障碍的形成密切相关。
原花青素是天然植物中广泛存在的一大类多酚类化合物的总称，属于植物多酚类物质，以葡萄籽中含量最为丰富。
研究［4-7］表明葡萄籽原花青素具有抗氧化、清除自由基、保护心血管、降血脂、抗肿瘤等功能。
作者采用浓度结合时间切换的方式建立慢性间歇性缺氧大鼠模型，模拟临床睡眠呼吸暂停的低氧状态，探讨葡萄籽原花青素对低氧大鼠脑组织磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）和IL-1β蛋白表达及学习记忆能力的影响。
1材料与方法1．1实验材料雄性SD大鼠56只购于北京维通利华公司，合格证SCXK（京）2002-003，体重310 350g。
p-p38MAPK单克隆抗体购自美国Cell Sig-naling公司，IL-1β多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
H-7650透射电镜为日本日立公司产品，数字测氧仪（建德市梅城电化分析仪器厂），低氧控制程序和低氧舱（天津医科大学），纯氮（天津六方气体高科技有限公司）。
1．2慢性间歇性低氧大鼠模型的建立［8］每天8：00 16：00将大鼠置于模型舱内，向舱内循环充入氮气和空气，每次循环2min，连续给予氮气30s，维持舱内氧体积分数最低至5%，随后均复氧至21%。
用数字测氧仪监测舱内氧浓度，使舱内氧浓度维持在规定浓度ʃ0．5%以内。
1．3实验分组将56只雄性SD大鼠随机分成对照组、模型组和葡萄籽原花青素高、低剂量干预组，每组14只。
模型组：按1．2方法制备模型；对照组：每天也将动物置于模型舱内，但暴露于正常空气中；高、低剂量干预组：在造模前2周开始每天1次灌胃葡萄籽原花青素200和100mg·kg－1，直至实验结束。
1．4脑组织超微结构观察在低氧处理第2和6周，每组分别随机抽取2只动物，常规麻醉，开胸、暴露心脏，用混合固定液灌流心脏，断头取脑，取海马区脑组织，参照文献［8］处理，透射电镜下观察神经细胞超微结构并摄片。
1．5学习记忆能力的测定在低氧处理第2和6周，每组分别随机抽取5只动物，按照Smith等［9］的方法，采用Morris水迷宫实验进行学习记忆能力的检测。
记录大鼠逃避潜伏期及撤去平台后动物穿越原平台位置的次数（穿台次数）［8］。
1．6脑组织p-p38MAPK和IL-1β蛋白的检测水迷宫实验后处死大鼠，迅速取双侧海马区脑组织，Western blot法检测p-p38MAPK和IL-1β蛋白，抗体分别稀释2000和1000倍。
ECL显色。
采用Gel-Doc凝胶成像分析系统分析蛋白条带的灰度值，以目的蛋白与内参β-actin条带平均灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。
1．7统计学处理应用SPSS10．0对数据进行处理，4组大鼠水迷宫实验逃避潜伏期和穿台次数、脑组织p-p38MAPK和IL-1β蛋白表达水平的比较采用单因素方差分析，检验水准α=0．05。
2结果2．14组大鼠海马区神经细胞超微结构的改变对照组神经细胞形状规则，胞质内线粒体丰富，胞核形状规则，核膜完整，染色质均匀，电子透明度高。
