原生质体的制备

拟南芥原生质体制备转化方法选取开花前生长良好情况的拟南芥（Columbia型）叶片，用刀片切成0.5-1 mm宽的叶条；浸于配置好的酶解液中（每5-10 mL酶解液约10-20片叶子）；暗箱抽真空，30 min；转移至室温，继续黑暗酶解3-5 h；当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放；加入等量的W5溶液稀释酶解液；用60-100目筛子（W5溶液润湿）过滤酶解液；将滤液转移至30 mL eppendorf管，500-700 g离心1-2 min，弃上清；加入10 mL预冷的W5溶液轻柔重悬原生质体；放于冰上静置30 min；保持室温在23℃以下；500 g离心8-10 min，弃上清；加入1 mL MMG溶液重悬原生质体（使其终浓度约在2×105个/mL）；即得到原生质体溶液。

用移液器吸取100 L的以上原生质体溶液于1.5 mL eppendorf管，加入10L DNA（10-20 g的质粒DNA），轻柔混合后，加入110 L PEG溶液，轻柔拍打eppendorf管使其混合完全；室温下诱导转化5-15 min；加入400-440 L W5溶液稀释转化混合液，轻柔颠倒，使之混合完好以终止转化反应；500 g离心2 min，弃上清；加入1 mL W5溶液悬浮清洗，500 g 离心2 min，弃上清；再用1 mL WI溶液轻柔重悬原生质体；室温（20-25℃）下，诱导载体表达18小时以上。

相关溶液配制PEG4000溶液（现用现配）组分用量PEG4000 1 g1 M CaCl20.25 mL0.8甘露醇0.625 mL水0.75 mL纤维素酶解液试剂15 mL酶液体系1-1.5 % Cellulase R10 (YaKult Honsha) 0.225 g 纤维素酶0.2-0.4 % Mecerozyme R10 (YaKult Honsha) 0.045 g 果胶酶0.4 M 甘露醇 1.09 g甘露醇干粉20 mM KCl 1 mL 0.3 M KCl20 mM MES, pH5.7 1 mL 0.3 M MES，pH5.7加水10 mL55℃水浴加热10 min，冷却至室温后加入以下试剂10 mM CaCl2 1 mL 0.15 M CaCl20.1% BSA 1 mL 1.5 % BSA5 mM β-巯基乙醇1mL 75 mM β-巯基乙醇用0.45 m滤膜过滤后即可使用。

一株内生真菌的原生质体制备及再生过程研究
材料准备：
内生真菌菌株
无菌工作台和器具（如培养皿、显微镜片、移液器等）无菌培养基（如琼脂、乳糖酸钠琼脂培养基等）
无菌培养液（如培养基溶液）
去离子水或无菌PBS缓冲液
培养基制备：
根据内生真菌的要求配制适宜的无菌培养基。

煮沸溶液中加入琼脂，并搅拌至溶解。

转移至培养器并加盖，进行高压灭菌。

菌种处理：
在无菌条件下，将内生真菌分离出来。

用无菌培养液或去离子水洗涤菌株，去除杂质。

原生质体制备：
将清洗后的菌株转移到含有少量无菌培养液的培养皿中。

用显微镜检查，确保菌株没有受到污染。

在无菌条件下，用移液器将菌株转移到新的培养皿中。

将培养皿置于振荡器中，以帮助分离真菌的原生质体。

过一段时间后，观察原生质体的形成情况。

原生质体再生：
将形成的原生质体转移到含有适宜培养基的培养皿中。

在适宜的温度（一般为25-30摄氏度）下，进行培养。

定期观察并记录原生质体再生的过程。

根据需要，可以进行进一步的培养和分离。

原生质体的制备：1、选取3-4周长势良好的植株的展开叶片（通常选取第5~7片真叶）。

2、用新的锋利的刀子从叶片的中部切0.5-1 mm叶条，比较理想的情况下，每克新鲜叶片中大约含有107个原生质体（大约100-150个叶条在5-10 ml酶溶液中消化）。

对于常规实验，10-20个叶条消化在5-10 ml酶溶液中将得到0.5-1×106个原生质体，足够25-100个样品使用。

3、快速而温柔的转移叶条到准备好的酶溶液中（10-20叶条在5-10 ml酶液中），用平头镊子将叶条完全淹没。

4、用真空泵将叶条在黑暗中真空30 min。

5、室温下在黑暗中至少消化3 h（继续消化，不要摇晃）。

经过轻微转动后酶溶液应该变成绿色，这表明原生质体已经被释放。

6、用显微镜检查原生质体的释放（拟南芥叶肉的原生质体的大小大约为30-50μm）。

7、用等体积的W5溶液稀释酶溶液，通过过滤去除没有消化的叶片组织。

8、用水洗去75 μm尼龙过滤器中的酒精（通常浸泡在95%乙醇中）并去除过量的水，用W5溶液润洗过滤器后过滤原生质体。

9、将原生质体溶液转移到30 mL圆底离心管中，100×g离心5 min，尽可能的去除上清液。

10、用计数板进行细胞计数，每2×105个原生质体加入1 mL W5溶液，在冰，上静置30 min。

11、室温下沉降原生质体15 min，去除W5溶液，每2×105个原生质体加入1 mL MMG溶液重悬浮。

12、在2 mL离心管中分别加入10 mL DNA（5-10 kb的质粒DNA 10-20 mg）和100 mL原生质体（2×104个原生质体细胞），轻轻混匀。

13、加入110 mL PEG溶液，轻弹试管完全混匀。

14、室温下孵育转染混合物15 min（反应5 min足够）。

15、室温下，用400-440 mL W5溶液稀释转染混合物，轻轻摇动或倒置离心管混匀来停止转染过程。

植物原生质体的制备原理
植物原生质体的制备原理是利用生物学方法将植物细胞的质膜和细胞壁打破，使得细胞质与细胞器分离，获得纯净的细胞质。

具体制备原理如下：
1. 选择新鲜的植物组织，例如嫩叶片、根尖等，并将其切碎。

2. 将切碎的组织置于适当的缓冲液中，缓冲液中含有维持细胞渗透压的某些成分，如蔗糖。

3. 经过一定时间的培养，细胞内的质膜和细胞壁会被渗透液逐渐分解，从而使细胞质暴露在外。

4. 使用过滤纸或细孔滤网将悬浊液过滤，以去除细胞壁碎片和其他杂质。

5. 对滤液进行离心，以分离更纯净的细胞质。

6. 最后，将分离得到的细胞质保存在低温条件下，或进行后续的实验操作。

通过上述步骤，就可以制备得到植物原生质体，供后续的生物学研究和实验使用。

在分离原生质体的酶溶液内，需加入一定量的渗透稳定剂，其作用是保持原生质体膜的稳定，避免破裂。

常用的两种系统为：①糖溶液系统：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0．40～0．80mol／L。

本系统还可促进分离的原生质体再生细胞壁并继续分裂；②盐溶液系统：包括KCL、MgSO4和KH2PO4等。

其优点是获得的原生质体不受生理状态的影响，因而材料不必在严格的控制条件下栽培，不受植株年龄的影响，使某些酶有较大的活性使原生质体稳定。

另外，添加牛血清蛋白可减少或防止降解壁过程中对细胞器的破坏。

近年来多采用在盐溶液内进行原生质体分离，然后再用糖溶液作渗透稳定剂的培养基中培养。

通常在酶液中使用的等渗剂为0．55～0．6mol甘露醇。

原始pH值提高到7．0时生活的原生质体数量进一步增加，损伤的原生质体也少得多。

原生质体纯化常用过滤和离心相结合的方法，步骤大致如下：
1．将原生质体混合液经筛孔大小为40－100um的滤网过滤，以除去未消化的细胞团块和筛管、导管等杂质，收集滤液。

2．将收集到的滤液离心，转速以将原生质体沉淀而碎片等仍悬浮在上清液中为准，一般以500r／min离心15min。

用吸管谨慎地吸会上清液。

3．将离心下来的原生质体重新悬浮在洗液中（除不含酶外，其他成分和酶液相同），再次离心，去上清液，如此重复三次。

4．用培养基清洗一次，最后用培养基将原生质调到一定密度进行培养。

一般原生质体的培养密度为104～106／ml。

细菌原生质体的制备要求：1、写出完整的原生质体的制备的实验操作步骤2、写出分离培养基及相关试剂所需的量、仪器和器皿所需的数量。

说明：通过实验一获得出发菌（细菌）之后，第二周再对该菌进行诱变，第三周再进行该菌的碳源谱、及抗药性测定（链霉素或青霉素），第四周再制备原生质体。

培养基与试剂 (1) 分离培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉 即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中 再加入15g琼脂粉 pH调至7.2 121℃灭菌15min 待冷却至50℃左右时 于超净工作台倒平板。

注: 先将可溶性淀粉加少量蒸馏水调成糊状 再加到溶化好的培养基中 调匀; (2) 分离培养基液体培养基采用牛肉膏蛋白胨固体培养基加0.2%可溶性淀粉,即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸馏水中 pH调至7.2,121℃灭菌15min。

(3) 检测试剂, 路戈氏碘液, 碘片1g ,碘化钾2g, 蒸馏水300mL。

配制方法: 先用少量35mL蒸馏水溶解碘化钾 ,再加入碘片 ,待碘片完全溶解后 ,加水稀释至300mL于棕色瓶内备用.实验方法: 1. 微生物的分离; 用梯度稀释法来分离淀粉酶产生菌。

取所采的土样5g加入到三角瓶中,加入无菌水45mL,30℃摇床振荡30min制成土壤悬液 ,此时的稀释度为10-1。

另取7支试管 分别记作10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8共8个梯度 每支试管内加入9mL无菌水。

用无菌移液管从三角瓶中吸取1mL土壤悬液加入到10-2试管中混匀, 再从此试管中吸取1mL加入到10-2试管中, 依此类推直至10-7试管。

分别从10-6、10-7、10-8三个稀释度的试管中吸取100uL悬液, 均匀涂布于分离培养基平板上, 于30℃培养36h 等长出菌落后, 将检测试剂卢戈氏碘液加入到平板中, 菌落周围形成水解圈的菌株即是产淀粉酶的菌株, 因淀粉遇碘变蓝色 ,如菌落周围有无色圈说明该菌能分解淀粉。

植物细胞原生质体的制备与融合。

1、相关概念：（1）原生质体：是指那些已去除全部细胞壁的细胞。

细胞外仅由细胞膜包裹，呈圆形，要在高渗液中才能维持细胞的相对稳定。

此外，在酶解过程中残存少量细胞壁的原生质体称为原生质球或球状体。

（2）原生质体融合：即体细胞杂交。

用人工的方法，把分离的不同品种或不同种的原生质体诱导成融合细胞，再经离体培养诱导分化和再生完整植株的整个过程。

若取材为体细胞，则成为体细胞杂交。

2、原生质体的制备：在植物组织里，原生质体被坚硬的细胞壁包裹着，而且由于果胶质等使细胞相互紧紧粘连在一起。

在愈伤组织中，这种粘连相对松些；在细胞悬浮培养物中，只有存在细胞团的情况下，有轻度的粘连。

如果破除这种粘连作用，即可使细胞分离开来，进一步去除细胞壁，就能使裸露的原生质体游离出来。

游离效率的高低主要与植物材料和酶混合浓的组成有关。

基本程序如下：取材→除菌→酶解（加酶、渗透压稳定剂）→原生质体的收集与纯化→洗涤→原生质体活力的测定。

（1）取材与除菌：原则上植物任何部位的外植体都可成为制备原生质体的材料。

但人们往往对活跃生长的器官和组织更感兴趣。

因为，由此制得的原生质体一般都生活力较强，再生与分生比例较高。

常用的外植体包括：种子根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。

对外植体的除菌要因材而异，悬浮培养细胞一般无需除菌。

对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗再以清水洗2-3次，然后浸入70%酒精消毒后，再放进3%次氯酸钠处理。

最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。

（2）酶解：现以叶片为例说明如何制备植物原生质体。

①配制酶解反应液:反应液应是一种pH值在5.5-5.8的缓冲液，内含纤维素酶0.3%-3.0%以及渗透压稳定剂，细胞膜保护剂和表面活性剂等。

③酶解：除菌绿。

反应液转绿是酶解成功的一项重要指标，说明已有不少原生质体游离在反应液中。

经镜检确认后应及时终止反应，避免脆弱的原生质体受到更多的损害。

链霉菌原生质体的制备透压极为敏感的球质体, 最外层是裸露的细胞物及细胞器缺损少, 修复能力高, 再生效果好。

质膜, 失去了细胞壁的原生质体, 染色体但由于菌种不同仍然存在差异。

如吸水链霉菌DN A在诱变剂作用下, 更易引起死亡突变, 敏感性提菌株及庆丰链霉菌的菌井冈变种的4 201 V A S高。

菌种的敏感性越高, 诱发突变的机会越大。

株, 以对数中期为好, 再生率为静止期的 40, 因此, 用原生质体代替孢子、菌丝细胞作为诱变 50 倍。

而菌株则以对数后期为好, 再生率 2 V A育种的材料, 能显著提高诱发突变的频率, 由于是静止期的 24 倍。

( ) 2菌丝的预处理链霉菌的破壁一般都去除了细胞壁, 原生质体膜易于融合, 即使没有接合、转化和转导等遗传系统也能发生基因组采用溶菌酶。

有些链霉菌种对溶菌酶敏感 , 如的融合重组。

庆丰链霉菌, 菌丝培养时不需经过预处理, 即可直接制备出原生质体。

但很多菌种对溶菌酶不用原生质体融合及诱变进行育种, 具有用孢子、菌丝的细胞融合、诱变育种不可替代的优敏感, 菌丝必须经过预处理。

方法有:越性。

? 在培养基中加入 0. 5%, 4% 的甘氨酸。

原生质体制备和再生的一般程序: 菌丝培具体浓度随菌种而异。

甘氨酸可以代替2丙氨 D养?菌丝悬液?离心得到菌丝沉淀?用蔗糖液酸掺入细胞壁, 破坏细胞壁肽聚糖短肽间的交洗涤两次?加酶液酶解一定时间得到原生质体联, 引起细胞壁结构的不完整以便于酶解脱壁。

悬液?原生质体的分离和离心收集?用高 ? 甘氨酸在增加菌丝对酶的敏感性的同时, 也P渗液重新悬浮原生质体?原生质体再生抑制菌丝的生长, 使菌丝量锐减。

因此为了减少1 原生质体的制备甘氨酸对菌丝生长的抑制作用, 培养基内加甘(1. 1 菌丝氨酸的量可酌情减少, 并同时增加过量蔗糖可( ) ) 能干扰细胞的正常代谢, 也得到相同效果。

? 1菌丝的培养时间处于不同生长时期分两次培养菌丝, 使得菌丝在新鲜培养基中能的菌体, 经过处理后都可以形成原生质体, 但其活性差异很大。