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重组质粒的构建、转化和重组子的筛选与鉴定姓名:郑小煜学号:201100140069班级:11级生技班同组者:赵莉、高瑞【实验目的】1、学习在实现DNA的体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶，并利用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
2、通过对DNA的酶切，学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
3、学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。
4、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法。
5、学习并掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
6、在使用红白菌落法筛选获得重组子的基础上，本实验学习通过对重组子进行重组质粒DNA的抽提鉴定，以进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段，验证重组子是期望的重组子的方法。
7、通过学习掌握重组DNA分子鉴定的基本方法。
8、掌握α互补筛选法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。
9、学习用试剂盒提取重组质粒DNA的方法。
10、复习琼脂糖凝胶电泳的原理及方法。
【实验原理】外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。
重组的DNA分子在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
1、限制性核酸内切酶及酶切反应体外构建重组DNA分子，首先，要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，即当用一种或两种限制性核酸内切酶切割外源供体DNA时，能得到完整的目的基因。
其次，要选择具有相应的单一酶切位点的质粒或者噬菌体等载体分子作为克隆的载体。
重组子的筛选方法
重组子的筛选方法包括以下几种：
1. PCR筛选法：利用PCR扩增方法，在重组子序列两端设计引物，扩增出目标重组子序列。
该方法可快速、简便地筛选出重组子，但存在引物设计不当、PCR 扩增条件不适等问题。
2. Southern blotting法：利用重组子DNA序列特异性探针进行筛选，这种方法需要对目标重组子进行限制性酶切，分离重组子DNA片段，然后进行Southern blotting，根据特异的探针与重组子DNA序列的杂交情况，确定有无目标重组子，这种方法相对复杂，但有高准确性。
3. 包装体筛选法：将目标重组子所在的DNA片段插入载体中，建立重组子文库。
然后采用包装体技术将文库中的重组子片段插入病毒包装体中，再通过病毒感染将重组子片段转染到宿主细胞，筛选出含有目标重组子的克隆。
4. 负筛选法：利用重组子DNA序列中含有的特异性标记，通过筛选方法去除不含该标记的过渡物，从而筛选出含有目标重组子的样品。
以上是常见的几种重组子筛选方法，不同方法适用于不同的实验需求和实验条件。
