糖基转移酶的研究概述 邓传怀 （河北大学生命科学学院２０１２生物技术中国保定０７１０００） 摘要糖基转移酶在生物体内催化活化的糖连接到不同的受体分子，如蛋白、核酸、寡糖、脂上，糖基化的产物具有很多生物学功能并具有高度的底物专一性。本文综述了糖基转移酶的种类、功能、特性及其在组合生物合成中的应用与研究前景。 关键词糖基转移酶结构功能应用 Outline about research of glycosyltransferases Deng Chuanhuai ( College of Life Sciences , Biotechnology 2012, Hebei University , Baoding ) Abstract Glycosyltransferase catalyzing the biosynthesis of the sugar attached to different activated receptor molecules, such as proteins, nucleic acids, oligosaccharides, the lipid glycosylation product has many biological functions with a high degree of substrate specificity[1]. In glycosylation project, carried out by enzymatic protein glycosylation and important means of natural glycosylated glycoproteins to study the structure and function of glycoproteins[2].This article provides anoverview of the categories, functions, characteristics of Gtfs, their app lications in combinatorial biosynthesis, and the p rospects for research. Key Words Glycosyltransferase Structure and Function Application 糖基转移酶是广泛存在于内质网和高尔基体内的一大类酶类[3]，参与体内重要的活性物质如糖蛋白和糖脂中糖链的合成。其作用是把相应的活性供体(通常是二磷酸核苷NDP-糖)
期末考核 课程：Glycobiology 植物糖基转移酶研究进展 ：*** 学号：*** 班级：*** 时间：****
植物糖基转移酶研究进展 摘要:糖基转移酶一类是能够催化糖基从激活的供体转移到特定的受体分子上的一类酶，在生物体中普遍存在并形成了超基因家族。糖基转移酶广泛参与植物生命活动的各种生物学过程。本文综述了近年来的研究报道，综述了糖基转移酶的分类、分离鉴定方法及在生物学功能方面的研究进展，期望为相关研究工作提供参考。 关键词:植物糖基转移酶，分类，分离鉴定，生物学功能 糖基转移酶（Glycosyltransferases，GT，EC 2.4.x.y）是一类催化糖基转移的酶，通过产生糖苷键将供体糖分子或相关基团转移至特异的受体上。糖基转移酶几乎存在于所有的生物体中，其所催化的糖基化反应是最重要的生物学反应之一，直接参与二糖、单糖苷、聚糖苷等的生物合成。糖基供体分子包括双糖、多糖、1-磷酸糖、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸，植物中最常见的供体为UDP-Glc。受体可以是糖类、脂类、蛋白质、抗生素和核酸。糖基转移酶催化供体-受体形成α、β两种糖苷键，产物为多糖、糖蛋白、糖脂以及糖苷化合物等。全基因组测序发现真核生物中约1%的基因编码糖基转酶。 1糖基转移酶的分类 目前，对糖基转移酶的分类主要根据Campbell等提出的GT Family 分类系统（数据收录在CAZy数据库中）。糖基转移酶作为高度分歧的多源基因家族，根据蛋白氨基酸序列的一致性、催化特性以及保守序列对其进行分类。因此，一特定的糖基转移酶既可以通过生物化学的方法鉴定其底物，也可以通过生物信息学方法研究其与已知酶基因或酶蛋白氨基酸序列的同源性对其进行分类。目前，依据这种分类方法，糖基转移酶被分为94个家族。根据其的折叠方式可将绝大多数酶分为两个超家族，GT-A超家族和GT-B超家族（图1）。根据催化反应机制、产物的立体化学异构性，在这两个超家族中糖基转移酶又分为反向型和保留型两大类（图2）。 GT-A型折叠的空间结构有两个紧密相连的β/α/β类Rossmann折叠区域。GT-A家族成员需要一个D-X-D基序用来结合二价金金属离子（多为Mn2+），这有助于UDP-糖供体的PPi在酶活性位点上的固定，对于催化反应是不可或缺的。GT-A难以识别UDP-糖供体以外的供体，所以受体的多样性较低。GT-B型折叠的空间含有两个正对的β/α/β类Rossmann折叠区域，连接方式灵活。GT-B成员无需二价金属离子维持活性，这是GT-B与GT-A家族成员的一个显著区别。此外，通过结构分析和PSI-BLAST发现了由跨膜GT组成GT-C超家族，其折叠方式全为反向型，活性位点位于长环部，一般含有8-13个跨膜螺旋。
海藻糖水解酶蛋白的重组表达 摘要：用试剂盒法从培养的菌液中提取出玫瑰微球菌QS412菌株基因组，然后用琼脂糖凝胶电泳来检测。筛选合适的引物后，将所提基因组用PCR 进行扩增，扩增后的结果用电泳图来展示。 关键词：海藻糖；玫瑰微球菌；琼脂糖凝胶电泳；引物；PCR 1 综述 1.1 海藻糖的简介 海藻糖，英文名Trehalose ，分子式C 12H 22O 11，英文化学名称（α-D-glucosido-α-D-glucosidemycose ）。由于海藻糖具有稳定细胞膜和蛋白质结构、抗逆保鲜等独特的生物学特性，正越来越多地被人们应用到生产活动、日常生活的诸多方面。 海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，是因为海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。许多对外界恶劣环境表现出 非凡抗逆耐受力的物种，都与它们体内存在大量的海藻糖有直接的关系。而自然界中如蔗糖、葡萄糖等其它糖类，均不具备这一功能。这一独特的功能特性，使得海藻糖除了可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其他生物制品的优良活性保护剂以外，还是保持细胞活性、保湿类化妆品的重要成分，更可作为防止食品劣化、保持食品新鲜风味、提升食品品质的独特食品配料，大大拓展了海藻糖作为天然食用甜味糖的功能。 1.2 麦芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase ） 1995年日本林原生化研究所报道的，用两种他们发现的新酶即低聚麦芽糖基海藻糖生成酶(MTSase)和低聚麦芽糖基海藻糖水解酶(MTHase)进行协同作用，可以由淀粉直接通过酶法转化生产海藻糖。具体途径如下： 麦芽低聚糖海藻糖 麦芽低聚糖 ） 麦芽低聚海藻糖合成酶????????→?ase (MTS 麦芽低聚糖 海藻糖麦芽低聚糖海藻糖 ） 水解酶（麦芽寡糖基海藻酶 +?????→?ase MTH 该方法指通过微生物中的麦芽寡糖基海藻糖合成酶（MTSase ）和麦芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase ）的协同作用，将一定链长的直链淀粉转化为海藻糖。麦芽寡糖基海藻糖合成酶是一种分子内转糖基酶，催化麦芽寡糖(淀粉液化液)还原端的葡萄糖基和相邻的葡萄糖基间的α,α-1,4 葡萄糖苷键转化成α,α-1,1 葡萄糖苷键，生成麦芽寡糖基海藻糖；麦芽寡糖基海藻糖水解酶专一水解麦芽寡糖基海藻糖的麦芽寡糖基和海藻糖基间的α,α-1,4 糖苷键，以上两种酶联合作用，每次从麦芽寡糖生成海藻糖和少两个葡萄糖单位的麦芽寡糖。
糖基转移酶与糖基转移酶抑制剂 摘要：糖基转移酶在生物体内催化活化的糖连接到不同的受体分子，如蛋白、核酸、寡糖、脂和小分子上，糖基化的产物具有很多生物学功能。其是糖蛋白、糖脂中糖链生物合成的关键酶之一。与此同时，对糖基化抑制剂的研究也是必要的。两者在治疗一些因为糖基转移酶非正常表达引起的疾病有很大作用。 关键词：糖基转移酶；糖基化；糖基化抑制剂 前言：糖基转移酶是广泛存在于内质网和高尔基体内的一大类酶，参与体内重要生物活性物质如糖蛋白和糖脂中糖链的合成，其作用是把相应的活性供体(通常是二磷酸核苷NDP-糖)的单糖部分转移至糖、蛋白质、脂类和核酸等，完成后者的糖基化加工，实现其生物学功能。因此糖基转移酶的表达和活性的变化与许多疾病联系在一起，并可作为某些疾病的诊断标志，如α-1,3-半乳糖基转移酶活性在体内的再现会引发自身免疫反应，导致类风湿，并在器官异体移植中引起排斥反应；N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶、岩藻糖基转移酶等在成熟细胞中活性的明显升高被视为肿瘤发生的重要标志，并且被认为是肿瘤迁移恶化的重要原因。因此设计合成糖基转移酶抑制剂，对于寻找抗肿瘤、抗免疫系统等新药研究有重要意义。 1 糖基转移酶的存在 糖蛋白是通过蛋白质的糖基化组装实现的，而糖基化过程则通过多种糖基转移酶完成——在肽链合成的同时或合成后，在糖基转移酶的催化下，糖链被连接到肽链的特定糖基化位点上。糖基转移酶具有高度的底物专一性，即同时对糖基的供体和受体具有专一性。对糖基转移酶进行研究，是糖基化研究的第1步。目前已对多种糖基转移酶的结构以及编码它们的基因研究清楚,并认为糖链的合成没有特定的模板，而是通过糖基转移酶将糖基由其供体转移到受体上。糖链可以认为是基因的次级产物,一个基因编码一个糖基转移酶,一个糖基转移酶专一地催化一个糖苷键的合成；这样一条糖链的合成就需要一个多酶系统,也就对应了一个基因组。下文简要介绍几类重要的糖基转移酶。 1.1 N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(N-acetylglucosa-minyl-transferase,Gnt) 糖蛋白中糖链通过还原端的N-乙酰氨基葡萄糖以β-1,4糖苷键与蛋白质肽链上Asn-XXX-Ser/Thr序列(XXX为除脯氨酸以外的氨基酸)中Asn残基上的氨基(-NH2)相连，被称为N-糖链。真核细胞中N-糖链的合成途径高度保守，其第1步合成由GnT完成。1999年, Strasser等依据动物GnT保守区序列设计简并引物，从烟草文库中分离到编码GnT的基因GnTI，这也是植物中第1个被鉴定的GnT基因。随后利用同样的方法从拟南芥、马铃薯中分离和鉴定出一系列GnT基因, 这些基因与动物GnT基因均有较高的序列相似性。后续研究发现
货号：MS2606 规格：100管/48样海藻糖酶（Trehalase，THL）试剂盒说明书 微量法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： THL（EC 3.2.1.28）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。海藻糖酶主要功能在于生物体分解海藻糖生成葡萄糖而直接用于能量供应。 测定原理： 采用3,5－二硝基水杨酸法测定THL催化海藻糖产生的还原糖的含量。还原糖与3,5－二硝基水杨酸共热生成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比，由此判断THL活性的高低。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 提取液：液体100mL×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体7mL×1瓶，4℃保存； 试剂二：粉剂×1支，4℃保存，用时加入1mL试剂一，充分溶解待用；用不完的试剂4℃保存； 试剂三：液体10mL×1瓶，4℃保存； 试剂四：液体10mL×1瓶，常温避光保存； 样品测定的准备： 1、细菌或细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3S，间隔10S，重复30次）；8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织的处理：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），冰浴中匀浆。8000g ，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 3、血清（浆）的处理：按照血清（浆）体积（mL）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议取0.1mL血清（浆）加入1mL提取液），冰浴中匀浆。8000g ，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 测定步骤： 1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。 2、调节水浴锅至95度。 3、加样表（在EP管中依次加入下列试剂）： 第1页，共3页
海藻糖合酶的作用机理及固定化 海藻糖对生物体具有神奇的保护作用，是因为海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。许多对外界恶劣环境表现出非凡抗逆耐受力的物种，都与它们体内存在大量的海藻糖有直接的关系。海藻糖合酶可以特异性地催化麦芽糖转化为海藻糖。常温菌中的海藻糖合酶最适反应温度一般在25-35℃，最适pH6.5-8.0左右，这样的反应条件给工业化生产带来一定的麻烦。而某些噬热菌中的海藻糖合酶具有耐酸、耐高温的特性，有利于降低工业化生产成本。 2007年Wang等人研究发现水生栖热菌的海藻糖合酶(TtTS)C端415个氨基酸残基(TtTSDN)与该酶的热稳定性和水解活性密切相关。删除(TtTSDN)的TtTS(TtTSDC)最适反应温度由65℃降低到40℃，同时水解活性增加、热稳定性降低，在80℃下保温30min后，TtTS保留88％的酶活力，TtTSDC只保留20％的酶活力；将TtTSDN与来自耐辐射奇球菌的低温海藻糖合酶(DrTS)融合后(DrTS -TtTSDN)，该酶的最适反应温度由15℃升到40℃，同时水解活性降低、热稳定性提高，在60℃条件下保温30min后，Drts –TtTSDN保留83％的酶活力，而DrTS的酶活力几乎全部丧失。现已发现海藻糖合酶的分子量主要集中在60kD-80kD左右，因此构建基因工程菌，将其克隆到经济易操作的大肠杆菌系统中进行异源表达不失为一种较好的解决方案。同时酶的固定化技术可以大大提高酶的使用效率，有人对海藻糖合酶的固定化研究做了相应的尝试，Cho等人研究表明，固定化的Thermus caldophilus GK24海藻糖合酶最适pH 没有发生改变，但最适温度从45℃提高到65℃，固定化的酶在70℃条件下保温16d仍能保持90%以上的酶活力，而非固定化的酶保温6d后只剩下13%的酶活力。固定化的酶在批次发酵的过程中能反复利用10次以上。 酶的固定化近年来发展迅速，随着酶活性及失活机制这一酶学基本理论的深入研究，将对海藻糖合酶的固定化技术的设计具有指导意义。可以展望，为使海藻糖合酶的生产成本大幅降低，除近一步完善从胞外源提取海藻糖合酶直接作固定化酶，使用胞内源直接作固定化细胞，使培养过程保留在不受损害的细胞中且可原位再生其活性，对控制副反应，提高稳定性有重要作用。着眼于在具有综合性能的新型载体及简便固定化方法基础上，具有效率高、稳定性强的固定化体系及可连续操作与运行的反应器，将会给海藻糖合酶的低成本、高效率生产提供可能。
尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)使用说明 货号：U8180 规格：200U 保存：-20℃保存。 产品说明： UDG酶分子量25kDa，能特异性识别DNA单链或双链中的尿嘧啶残基，并从DNA上水解去除尿嘧啶残基，防止DNA发生突变，是碱基切除修复过程中的重要组分，对RNA无活性。UDG酶常被用于消除PCR扩增中的残余污染。在PCR反应液配制时，将dUTP和dTTP按一定的比例混用，使得扩增产物都含有脱氧尿嘧啶。在进行PCR扩增前，在PCR混合液添加UNG 酶，并增加2分钟37℃～50℃的保温步骤即可消除以往PCR产物的残留污染，由于UNG 在PCR循环中的94℃变性一步便可被灭活，因此不会影响新的含dU的PCR产物。 活性定义： 60分钟内催化1nmol尿嘧啶从含尿嘧啶双链DNA上释放所需要的酶量定义为一个单位。 质量控制： 经多次柱纯化，SDS-PAGE检测纯度大于95%；PCR方法检测无大肠杆菌DNA残留，无核酸内、外切酶污染。 1×UDG反应缓冲液： 20m M Tris-HCl(pH8.0a t25℃)；1mM Dithiothreitol；1m M EDTA（可使用1×Taq反应缓冲液） 使用建议： U D G酶在Taq酶反应缓冲液中同样具有活性。在P CR反应液中直接添加UDG酶即可，
推荐用量为0.2U每50μl体系，在PCR循环程序前增加2分钟37℃～50℃保温及可完全消除多达1ng含UTP模板的污染。 应用实例： UNG酶特异性降解含UTP的DNA模板 反应体系（以50μl反应体系为例）PCR循环程序： 2×Taq PCR MasterMix25μl50℃，2分钟（降解含UTP的染模板）500bp模板（含UTP）1ng94℃，4分钟（灭活UDG，模板变性）500bp引物对终浓度0.2μM30次循环：94℃，30秒 250bp模板（无UTP掺入）1ng54℃，30秒 250bp引物对2终浓度0.2μM72℃，30秒 ddH2O up to50μl72℃5分钟 对照组未添加UDG酶；4℃保温 验组每50μl反应体系中添加0.2U UDG酶。 常用PCR残余污染消除体系及PCR程序（50μl扩增体系）
海藻糖生物合成及应用研究进展 曲茂华 张凤英 何名芳 陈卫平* （江西农业大学食品科学与工程学院 南昌 330045） 摘 要：海藻糖是一种非还原性二糖，是生物细胞抵抗不良环境的应激代谢产物，它可广泛用于食品、化妆品、生物医药和农业等领域。本文对最近几年海藻糖在生物细胞中的合成途经及酶调控机制、海藻糖生产合成方法及生产菌种、海藻糖对生物细胞保护作用机理及海藻糖在相关领域中的应用等研究进展进行了综述。 关键词：海藻糖，酶，合成，调控机制，应用 Research progress of trehalose biosynthesis and applications QU Mao-hua ZHANG Fengying HE Mingfang CHEN Weiping * (Institute of food science and engineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China) Abstract: Trehalose, a disaccharide with non-reducing as metabolite of cell in hostile environment, was used in domains of food, cosmetic, biological medicine and agricultural. The newest research progress of trehalose including synthesis pathways with enzyme regulatory mechanism, synthesis methods with producing strains, mechanism of protection for cell and applications in relative domains was reviewed in this paper. Key words: trehalose; enzyme; synthesis; regulatory mechanism; application 中图分类号：TS245.9 文献标识码：A 文章编号:2013120023 作者简介：曲茂华（1989-），硕士研究生，研究方向为食品微生物。 *通讯作者 海藻糖是一种非还原性二糖，分子式是C 12H 22O 11?2H 2O ，广泛分布于自然界中许多生物细胞中。海藻糖是一种生物应激代谢产物，一些在极端环境生长的古生菌、真菌，以及一些生长在不良环境中的动植物细胞中海藻糖含量较高。甚至在可以用于清理核污染的抗辐射型细菌如耐辐射球菌（Deinococcus radiodurans ）[1]中也发现了海藻糖的存在。海藻糖在生物细胞中的作用是保护细胞抵抗不良环境的影响，其功能是保护细胞质膜，蛋白质、核酸等生物大分子空间结构和功能活性，维持渗透压和防止细胞内营养成分流失。由于海藻糖具有以上功能，它可用于医学生物制品中起到保护剂的作用[2]；增强农作物抗逆性[3]，通过转基因手段来培育耐盐碱型农作物[4]，培育抗冻果蔬等；同时，海藻糖不具有还原性，不会发生美拉德反应，可以作为稳定的添加剂应用于食品工业。因此，对海藻糖进行研究具有重要意义，本文针对海藻糖生物合成、作用机理、应用方面的最新研究进展进行综述。 1海藻糖合成的相关酶以及调控途径 1.1海藻糖合成途径 目前对海藻糖合成代谢途径的研究文献较丰富。研究发现在生物体内的海藻糖合成途径主要有以下几条：一是 OtsAB 途径，通过TPS （Trehalose-6-phosphate synthase ，6-磷酸海藻糖合成酶）和 TPP （Trehalose-6-phosphate phosphatase ，6-磷酸海藻糖磷酸酯酶）酶来形成海藻糖[5]。在酵 网络出版时间：2014-02-20 16:01 网络出版地址：https://www.doczj.com/doc/5711565423.html,/kcms/detail/11.1759.TS.20140220.1601.030.html
海藻糖对酶热稳定性保护作用的研究 李 群 袁勤生 李永丰 (华东理工大学生化研究所,上海200237) 摘 要 初步研究了海藻糖在保护酶蛋白热稳定性方面的作用。实验表明:海藻糖可以作为一种天然保藏剂,有效地提高酶蛋白的热稳定性;本文还分别比较了葡萄糖、蔗糖、甘露醇和海藻糖对酶蛋白的保护效果,结果发现海藻糖保护效果最佳,蔗糖次之,葡萄糖和甘露醇较差。 关键词 海藻糖;乙醇脱氢酶;超氧化物岐化酶(SOD);热稳定性 酶在医药、化工、食品及临床与化学分析等领域获得了广泛的应用。但是由于酶不稳定而使其应用开发受到限制。虽然引起酶蛋白变性的因素很多,如物理因素、化学因素以及生物学因素等,但是温度却是造成酶失活的最主要因素。近年来,一种建立在海藻糖基础上的天然保藏剂,为酶的热稳定性保护提供了新的方法。海藻糖是由两个葡萄糖残基通过半缩醛羟基结合而成的一个非还原性二糖,在昆虫、无脊椎动物、酵母、真菌的孢子和子实体以及高等植物中都发现其存在,化学性质很稳定[1]。本文采用海藻糖作为酶的稳定介质,初步研究了它对乙醇脱氢酶和SOD 的保护作用,并比较了葡萄糖、蔗糖、甘露醇和海藻糖在保护酶活方面的效果。 1 材料与方法 1.1 材料 海藻糖由上海生化试剂商店提供;SOD 由华东理工大学生化研究所提供;葡萄糖、蔗糖、甘露醇均为分析纯试剂。 1.2 方法 1.2.1 酵母中乙醇脱氢酶的制备[2] 150ml0.066mol/L的Na2HPO4溶液加入到达50克酿酒酵母细胞中,37℃水浴中搅拌保温2h后,取出,室温下再搅拌抽提3h,离心弃菌体,上清液立即置于55℃水浴中15m in,冷却后离心,上清液置0℃冰箱中过夜。 冰浴下按每100ml的抽提液中,加入50m l的冷丙酮,20min后,0℃离心,弃沉淀;再在上清液中按每100ml加入55ml冷丙酮, 0℃维持20m in后离心,弃上清液,沉淀用冰水溶解,置透析袋中透析3h,3500r/min下离心20m in,弃沉淀。每100ml上清液中加入36g硫酸铵,0℃冰箱放置3h,14000r/m in离心20min,弃上清液;沉淀用15ml水溶解,加入3g硫酸铵,盐析3h后离心弃沉淀。上清液中即含有乙醇脱氢酶。 乙醇脱氢酶活力测定采用Dotzayer 法[3]。 1.2.2 酵母蛋白的制备及测定(4) 20克酵母中加水30ml,在-20℃下速冻2h,取出放在20℃恒温水浴中保温30min,为一次冻融;重复三次。离心取出上清液,得到酵母蛋白。 利用紫外分光光度计分别测定酵母蛋白溶液样品在260nm,280nm处的吸光度值,按下表计算蛋白含量: 蛋白质浓度(mg/m l)= 1.55A280-0.77A260 28 药 物 生 物 技 术 Pharm aceutical Biotechnology 1997,4(1):28～31 收稿日期 1996-05-20
题名: 糖苷酶与糖基转移酶催化转糖反应的特征与机理研究 作者: 周坤 答辩日期: 2013-1-23 中文摘要: 糖苷化合物的生物合成在合成领域中占有重要地位，然而目前报道的生物合成方法，无论是糖苷酶还是糖基转移酶，均无法实现效率与收益的双赢，因此寻找特异、有 效的糖苷类化合物的合成工具，并对其催化特性与催化机制的研究成为生物转糖的 一个重要方面。本文以生物转糖为研究对象，应用实验与计算结合的手段，进行了 生物转糖酶的筛选及其与底物识别结合等性质研究。基于所建立的快速有效的筛选 方法，对来自海洋的样品进行了筛选，首次从中国黄海海域筛选得到1株具有高效 转糖活性的菌株DL001。菌的形态学研究及16SrDNA序列分析表明，该菌为节杆 菌。对转糖产物的结构鉴定表明该菌能以α-1,4和α-1,6方式向底物转糖。采用四 步柱层析联用的方法，从DL001菌的发酵液上清中分离得到具有转糖活性的糖苷 酶AG-I。底物特异性分析表明该酶对水解底物和糖基供体的专一性高，但却能以葡 萄糖苷、木糖苷和烷基醇作为糖基受体。其中该酶对pNP-糖苷化合物的转糖效率 高达42-60%，并能进一步以转糖产物为受体继续发生糖基化反应，表明该酶可作 为一个有效的生物合成工具用于工业合成。我们以酵母来源的α-糖苷酶和羟基香豆 素类化合物为研究对象，组合应用对接方法、分子表面的静电势和轨道能分析等方 法，来阐明α-糖苷酶与其配体产生特异性结合的关键特征。结果表明，氢键、分子 静电势和分子轨道能量等特征对配体与α-糖苷酶特异性识别有重要作用，并且这些 特征作为一种推动力促使配体以最优构象与受体α-糖苷酶相互作用。我们建立了一 个糖基化位点的数据库，并基于此构建了一个基于先验概率的判别分析模型用于糖 基化位点的预测。进一步的特征分析表明位置R1上的氨基酸性质及所有位点中与 疏水性相关的氨基酸性质对糖基化影响较大，而糖基化位点C端的二级结构性质和 N端的的物化性质对糖基化的影响也不可忽略。这个模型不仅为糖基化位点的预测 提供了一个有效工具，并为深入理解糖基化的影响因素提供有效信息。考虑到我们 模型的公共可获得性，我们提供了一个可下载的程序供人们来预测糖基化位点。
Analysis of glk 12，15 葡萄糖通过葡萄糖激酶的ATP依赖的磷酸化是由通过根据弗兰克尔和Horecker 的使用过量的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶监测细胞提取物中NADPH的形成。反应体系为 2 ml，50 mM Tris buffer pH7.65；10 mM MgCl2；50mM甘露糖；加入0.1mL酶。在反应中，NADP+被还原生成NADPH，其产量与样品GLK活性呈正相关，NADPH在340nm处有一吸收峰，因此测吸光度，每分钟记录一次直至吸光度不再变化，测出每分钟光密度的增加值。根据以下公式计算：酶活性=吸光度变化（min）/6.22（NADPH吸光系数） Analysis of manB 中文 酶的测定原理是根D-甘露糖-l-磷酸作底物,反应后经酸水解无机磷的减少而测定。标准的反应溶液中,含有D-甘露糖-1-磷酸(0.5m mol/l) 、D-葡萄糖-2,6-二磷酸 ( 0.0 1mmo l/L),醋酸镁 (2.5m mol /L),组氨酸(5m mol /L),Tris -Hcl(10 mmol/ l,pH8.0 )的缓冲液和微克量的酶液。反应总体积为 50μL,在30 ℃下反应10分钟,然后加4.25 mL 0.74 mol /L H2SO4 .消化20 分钟,再加125 m1 钼酸铵和25 μL F -S试剂 ,在100℃水浴下煮沸7 -10分钟,冷却,在670 nm波长下测光密度。以酶液先消化后加底物经同样处理的样品作对照测光密度。以两者的光密度正差显示酶活性。 Analysis of gmd and wcaG 17 利用分光和色谱测定试验系统进行测量GDP-D-甘露糖4,6-脱水酶和GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖3,5-差向异构酶-4-还原酶的活性。GDP-D-甘露糖4,6-脱水酶标准测定体系含有50mM的Tris/盐酸缓冲液pH7.5，10mM的氯化镁，4mM的GDP-D-甘露糖，50μMNADPH+和GMD含粗提物终体积为100μL。该反应在37℃进行60分钟，每隔一段时间测量一次。最后加入1900μL 100mM NaOH终止反应并在37℃下孵育20min，然后在320nm下测吸光度。GDP-4-酮-6-脱氧-D-甘露糖3,5-差向异构酶-4-还原酶活性测量依靠加入在第一步骤中的反应，然后通过在340 nm和37℃下测量NADPH的消耗量测定。 Analysis of fuct 1-。。 标准测定混合物含有38nM寡糖受体，20mM的MnCl2，1％的Triton X-100，50mM的二甲胂-HCl缓冲液（pH值 5.8），0.37 μM GDP-岩藻糖（270.0 mCi/mmol），和酶（0.4 mg protein），100μL的终体积。温育在37℃，1h。终止反应用300μL氯仿/甲醇（2/1，v/v），然后将产物通过TLC，乙醇/吡啶/ 1-丁醇/水/乙酸(100/10/10/30/3, by vol)在下层相分离。掺入糖脂的放射性活度是用图像分析仪和并用液体闪烁计数器测定。