临床细菌检验工作的基本要求和技术一、对临床细菌检验人员的要求1．负责鉴定及签发报告的主管技术人员应通晓诊断细菌学的全面知识。
2．一般细菌室工作人员均应具备细菌传染、消毒、灭菌的知识。
3．通晓细菌室守则，并严格遵守。
4．负责人应不断更新知识，了解细菌学检验的新进展。
5．定期或随时与临床医师联系，主动参与临床病例讨论，了解病情及治疗情况，达到细菌检验与临床的密切联系。
6．工作人员应定期进行健康体检及必要的预防接种，增强自身抵抗能力。
二、工作人员守则在细菌室工作人员应注意，既不要给室内带来污染，也不要被室内的微生物感染。
工作人员必须遵守以下规则：1．穿专用的工作衣、帽入室；必要时应戴口罩。
2．不允许无关人员进入实验室。
3．室内禁止饮食、吸烟、闲谈等非专业活动。
4．养成在室内手不触及口、脸、头发及躯体的习惯。
5．操作中不可说话，以免口中飞沫污染标本。
6．每次完成工作和离开实验室前，应用肥皂洗手，接触了致病菌类，须用消毒剂消毒手。
7．个人物品不许带入室内。
8．当工作环境被细菌培养物污染，必须用适当的强消毒液泼撒覆盖污染物，并报告主管人员采取必要的措施。
9．工作人员被细菌培养物污染，应用弱或中等消毒剂清洗，必要时应给予药物治疗，并向主管负责人报告，进一步采用特殊措施。
基本染色方法染色的第一步是制作涂片。
菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布。
菌落涂片时，先取生理盐水1滴，置玻片上，用接种针挑取菌落，在盐水中涂布。
涂片时必须注意应轻轻操作。
猛烈的动作会改变菌细胞原有的排列形式，或造成细菌鞭毛脱落，影响结果的准确性。
制备的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细胞形态改变。
将固定后的涂片进行染色。
一、革兰染色本染色是最基本的染色法，可用于标本涂片或菌落涂片。
染色结果将细菌分为革兰阳性(紫色)和革兰阴性(红色)两类。
试剂1. 结晶紫溶液A液：结晶紫2g95％乙醇20mlB液：草酸铵0.8g蒸馏水80ml需在用前24h将A液、B液混合，过滤后装入试剂瓶内备用。
2．碘液碘1g碘化钾2g蒸馏水300ml碘与碘化钾混合并研磨，加入几毫升水，使其逐渐溶解，然后研磨，继续加入少量蒸馏水至完全溶解。
最后补足水量。
也可用少量蒸馏水，先将碘化钾完全溶解，再加入碘片，待完全溶解后，加水至300ml。
3．脱色液：95％乙醇。
4．复染液A. 贮存液：沙黄 2.5g95％乙醇100mlB. 应用液：A液10ml蒸馏水90ml染色方法：1．涂片经火焰固定，加结晶紫液染1 min，清水冲去染液。
2．加碘液染l min，水洗。
3．加脱色液，不时摇动约10～30s，至无紫色脱落为止，水洗。
4．加复染液，染30s，水洗。
5．干后镜检。
二、抗酸染色抗酸染色直接用于痰标本时，可以适当增加标本涂片的厚度，以提高检出率。
染厚涂片时，须掌握复染色时间。
如果背景过深，影响镜检。
奴卡菌及放线菌可呈弱抗酸性，取培养菌落涂片染色时，呈现两种现象，视野中有些菌细胞阳性，另外一些则阴性；有时同一个菌体上，红色的深浅亦有不同，观察时应予注意。
抗酸染色有两种常用方法：①碱性复红法又称萋纳(Ziehl—Neelsen)法。
②荧光染料金胺O法(也称金胺O-罗丹明B法)。
(一)碱性复红染色法试剂1．萋纳石炭酸复红溶液碱性复红乙醇饱和溶液10ml5％石炭酸溶液90ml2．脱色剂*浓盐酸3ml95％乙醇97ml3．复染液(吕弗勒美蓝液)美蓝乙醇饱和溶液30ml10％氢氧化钾0.1ml蒸馏水100ml染色方法1．涂片经火焰固定，加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾。
染5 min(若染色奴卡菌需要加长时间)，水洗。
2．加脱色剂，不时摇动玻片至无红色脱落为止，水洗。
3．加复染液，染0.5～l min，水洗。
4．干后镜检。
分枝杆菌呈红色，背景为蓝色。
*：奴卡菌、放线菌标本染色时，脱色剂改用2％硫酸水溶液。
(二)金胺O-罗丹明B染色法染剂1．罗丹明B液：罗丹明B 0.1g加蒸馏水100ml；2．0.1％金胺O液：金胺O 0.1g加蒸馏水95ml，再加入纯石炭酸5ml，混匀；3．3％盐酸酒精；4．稀释美蓝液：吕弗勒美蓝液10ml，加蒸馏水90ml，混匀。
方法1．涂片固定后加第1液30～90s。
2．弃去第1液后加第2液染15min。
3．用第3液脱色1～2min，水洗。
4．滴加第4液染30s，水洗，待干，荧光抗酸菌在暗背景中呈现金黄色荧光。
三、鞭毛染色用于观察菌体上有无鞭毛、鞭毛在菌体上的位置以及鞭毛的数量。
在细菌鉴定中，特别是非发酵菌的鉴定中很重要。
鞭毛染色可以直接从平板上挑选菌落，或从斜面上刮菌苔涂片即可，但必须注意动作尽量轻，以免鞭毛从菌体上脱落。
菌落应是生长在营养较好的琼脂平板(如血平板、营养琼脂)上的过夜培养物。
不可采用有抑制剂的选择性培养基，如中国蓝、麦康凯、SS琼脂等。
观察鞭毛时，应耐心寻找整个涂片上的菌细胞，因为并不是涂片上每个细菌细胞上的鞭毛特性及数量都一样，应以鞭毛数量最多的菌细胞为准。
鞭毛染色(改良Ryu法)试剂A液：5％石炭酸10ml鞣酸2g饱和硫酸铝钾液10mlB液：结晶紫酒精饱和液应用液：A液10份，B液1份，混合，室温存放。
染色方法1．玻片的处理：要求用新的载玻片。
用前须在95％酒精中浸泡24小时以上。
用时从酒精中取出，以干净纱布擦干后使用。
2．在玻片上滴蒸馏水两滴。
一张玻片上可同时制2个涂片。
3．用接种环挑取血平板上菌落少许，将细菌点在玻片上的蒸馏水滴的顶部。
一般只需点一下，仅允许极少量细菌进入水滴，不可搅动，以免鞭毛脱落。
4．玻片置室温自然干燥。
5．滴加染液于玻片上，染色。
6．约10～15min后，用蒸馏水缓慢冲去染液。
冲洗时应避免使染液表面的金属光泽液膜滞留在玻片上，影响镜检。
7．玻片自然干燥后，镜检时应从涂片的边缘开始，逐渐移向中心。
寻找细菌较少的视野，鞭毛容易观察。
细菌密集的地方，鞭毛被菌体挡住，不易观察。
四、异染颗粒染色用于白喉棒状杆菌染色，异染颗粒可明显地被显示出来。
标本直接涂片或细菌涂片均可用改良阿伯特(Albert)法染色来观察异染颗粒。
试剂甲液：甲苯胺蓝0.15g孔雀绿0.2g冰醋酸1ml95％乙醇2ml蒸馏水100ml将各染料先溶于乙醇，然后加入水与冰醋酸的混合液中，充分混匀。
静置24h后过滤备用。
乙液：碘2g碘化钾3g蒸馏水300ml先将碘化钾加少许蒸馏水(约2m1)，充分振摇，待完全溶解，再加入碘，使完全溶解后，加蒸馏水至300ml。
染色方法1. 涂片经火焰固定，加甲液，染3～5 min。
水洗。
2．滴加乙液，染l min。
水洗。
3．干后镜检，菌体呈绿色，异染颗粒呈蓝黑色。
五、墨汁荚膜染色用于观察菌体有无荚膜结构，借此鉴定某些菌，如新型隐球菌。
传统的方法是用印度墨汁，但目前国内无售。
常规工作可以用墨汁或墨水代替，但应注意颗粒不能太粗，否则影响观察结果。
有人用5％黑色素(nigrosin)水溶液做染料，效果较好。
试剂印度墨汁或5％黑色素水溶液。
染色方法将标本与1滴染色液在载玻片上混合，加上盖玻片，轻轻压一下，使标本混合液变薄。
在低倍镜下寻找有荚膜的菌细胞。
找到后，转换高倍镜确认。
葡萄球菌属一、常规鉴定葡萄球菌的鉴定：首先须与其他的革兰阳性球菌鉴别，然后再作属内种的鉴定。
(一) 与其他革兰阳性球菌鉴别临床标本中常见到的革兰阳性球菌，除葡萄球菌属外，还有微球菌属和气球菌属等。
所以，在菌属内菌种鉴定之前，首先与这几属细菌鉴别(见表)。
表葡萄球菌属与其他革兰阳性球菌的鉴别 a菌名特征b严格需氧四联状排列紧粘琼脂动力5%NaCl琼脂触酶c氧化酶d(改良法)厌氧下葡萄糖产酸e耐药杆菌肽f0.04U/片呋喃唑酮g100ug/片葡萄球菌属- D - b - + + - d + -气球菌属- + - - + - - (+) - -动性球菌属+ D - + + + ND - ND -口腔球菌属- D + - - 土- + - -微球菌属+ + - - + + + - - + 注： a．葡萄球菌属、动性球菌属、口腔球菌属、微球菌属皆隶于微球菌科。
b．符号：+，90％以上阳性；土，90％以上弱阳性；一，90％以上阴性；d，1l％一89％阳性；ND，未试验；( ) 迟缓反应。
c．在某些菌种中出现触酶弱阳性或假阳性反应，是由于在培养中补充血红素，活化某些菌株触酶活性。
d．Faller和Schleifer改良氧化酶试验为检出细胞色素C。
e．标准的氧化—发酵试验。
f．+，耐药或无抑菌环，微球菌、口腔球菌、气球菌敏感，抑菌环10～25mm。
g．十，耐药或抑菌环≤9mm；一，敏感，抑菌环15～35mm。
h．表皮葡萄球菌有些菌株生长时紧固地粘附于琼脂表面，此种特性与细菌产生浓的粘液相关。
1．与链球菌鉴别：葡萄球菌与链球菌的区别如下：在镜下，葡萄球菌以单、双、葡萄状排列，菌体呈圆形。
链球菌以成单、双、链状排列，菌体形态为圆形或椭圆形。
葡萄球菌触酶试验阳性，链球菌则阴性。
2．与微球菌的鉴别：实验室常用的鉴别依据是形态和发酵葡萄糖产酸。
在镜下，葡萄球菌以葡萄状排列为主，菌体较小；微球菌以四联排列为主，且菌体较大。
葡萄球菌发酵葡萄糖产酸试验阳性，微球菌阴性。
此外杆菌肽、呋喃唑酮敏感试验有利区别两属菌种。
(二) 临床8种常见葡萄球菌的鉴别目前葡萄球菌已被命名有27个种。
临床标本中最常见有意义菌种是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、溶血葡萄球菌、里昂葡萄球菌、施氏葡萄球菌、中间葡萄球菌和猪葡萄球菌。
首先用凝固酶试验将其分为凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌(包括中间和猪葡萄球菌)和凝固酶阴性的其他葡萄球菌，然后用新生霉素敏感试验。
推断新生霉素耐药为腐生葡萄球菌。
下表列出了关键鉴定试验来区别上述8个菌。
二、试验方法(一)触酶试验(过氧化氢酶试验)试剂：3％H2O2溶液，置棕色瓶内于4℃阴暗处保存。
方法：先挑取固体培养基上的菌落，置于洁净的玻片上，然后滴加3％过氧化氢溶液1～2滴。
静置之，lmin内产生大量气泡的为阳性，不产生气泡的为阴性。
表有临床意义的8种葡萄球菌关键性鉴定菌种试验菌落色素葡萄球菌凝固酶凝聚因子耐热DNA酶碱性磷酸酶吡咯烷酮酶鸟氨酸脱羧酶脲酶β半乳糖苷酶产生V|P新生霉素耐药多粘菌素B耐药需氧下产气D|蕈糖D|甘露醇D|甘露糖D|松二糖D|木糖D|纤维二糖麦芽糖蔗糖金黄色葡萄球菌+ + + + + - - d - + - + + + + + - - + + 表皮葡萄球菌- - - - + - (d)+ - + - + - - (+)(d)- - + + 溶血葡萄球菌 d - - - - + - - - + - - + d - (d)- - + + 里昂葡萄球菌 d - (+)- - + + d - + - d + - + (d)- - + + 施氏葡萄球菌- - + + + + - - (+)+ - - d - + - - - - - 腐生葡萄球菌 d - - - - - - + + + + - + d - + - - + + 中间型葡萄球- + d + + + - + + - - - + (d)+ d - - ±+ 猪葡萄球菌菌- d- + + - - d - - - + + - + - - - - +注意点：1．注意过氧化氢为3％，应用30％浓的H2O2，用时稀释10倍。
![实验室生物安全手册[1]](https://img.taocdn.com/s1/m/7b76c18ace2f0066f53322c3.png)
