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无菌实验室操作规程标题：无菌实验室操作规程引言概述：无菌实验室是进行微生物实验和细胞培养的重要场所，为保证实验结果的准确性和可靠性，操作规程十分关键。
本文将详细介绍无菌实验室的操作规程，包括实验室准备、操作流程、设备消毒、个人防护和废物处理等方面。
一、实验室准备1.1 清洁实验室环境：无菌实验室应保持干净整洁，定期清洁地面、台面和设备，避免灰尘和细菌污染。
1.2 检查实验室设备：在进行实验前，要检查实验室设备是否正常运转，确保无菌实验室的各项设备都处于良好状态。
1.3 准备所需材料：提前准备好所需的培养基、试剂和实验用具，确保实验进行顺利。
二、操作流程2.1 洗手消毒：进入无菌实验室前，必须先进行手部消毒，避免将细菌带入实验室。
2.2 穿戴个人防护用具：穿戴实验服、手套、口罩和护目镜等个人防护用具，避免污染实验样品。
2.3 严格按照实验操作规程进行：在进行实验时，要按照操作规程的要求进行，避免操作失误导致实验失败。
三、设备消毒3.1 消毒实验台面：在进行实验前，要将实验台面用75%乙醇或其他消毒液擦拭消毒，避免细菌污染。
3.2 消毒实验用具：使用完实验用具后，要及时用高温或消毒液进行消毒，确保下次使用时无菌。
3.3 定期消毒实验室设备：定期对实验室设备进行消毒，保持实验室的无菌状态。
四、个人防护4.1 穿戴个人防护用具：在进行实验时，必须穿戴好实验服、手套、口罩和护目镜，避免接触细菌。
4.2 避免交叉污染：在实验过程中，要避免将实验用具和试剂带到其他实验室，避免交叉污染。
4.3 定期进行健康检查：实验人员要定期进行健康检查，确保身体健康，避免将疾病传播到实验室。
五、废物处理5.1 分装废物：在进行实验后，要将废物分类分装，避免混合造成交叉感染。
5.2 定期清理实验室废物：实验室废物要定期清理，避免细菌滋生和传播。
5.3 合理处理废物：将实验室废物交由专业机构处理，避免对环境和人体造成危害。
结论：无菌实验室操作规程十分重要，只有严格遵守规程，才能确保实验结果的准确性和可靠性。
革兰氏染色一、目的更好的观察细菌形态，并可按染色反应加以分类鉴别.二、原理1、化学学说:碘液在菌体内与结晶紫结合后又和菌体内的核糖核酸镁盐-蛋白质复合物结合，此结合物不易被95%乙醇脱掉，呈革兰氏染色阳性。
因革兰氏阴性菌缺乏核糖核酸镁盐，故对碘与结晶紫结合物摄取少，且不牢固，易被乙醇脱色，而呈革兰氏染色阴性。
2、等电点学说:革兰氏阳性菌的等电点在PH2-3，比阴性菌（PH4—5）更低。
加之碘为弱氧化剂，可降低革兰氏阳性菌的等电点，使两类菌的等电点差异扩大.因此，阳性菌和碱性染料的结合力比阴性菌更强。
3、渗透性学说:阳性菌含粘肽多、糖多,酒精使其脱水而致细胞壁间隙缩小,通透性降低，在菌体内保留了染料—碘复合物，故呈紫色。
阴性菌胞壁含粘肽少，通透性不受影响，菌体内染料—碘复合物较易透出，失去紫色,被复染成为红色。
三、标本痰涂片、分泌物涂片、细菌涂片等。
四、染液第一液：结晶紫乙醇饱和液(2g结晶紫溶于95％乙醇20ml内）+10g/l草酸铵水溶液80ml混匀。
第二液:碘1g，碘化钾2g,加少许蒸馏水，充分振摇，溶解后加蒸馏水至300ml。
第三液：95％乙醇或乙醇、丙酮(7：3）混合液。
第四液：稀释碳酸复红或沙黄溶液（2。
5％沙黄乙醇液10ml加蒸馏水90ml 混匀)（碱性复红8g溶于95%酒精100ml中制成饱和液,取10ml加入5％碳酸水溶液90ml混匀)用时用蒸馏水稀释10倍即可。
五、质量控制措施每周做一次革兰氏阴、阳性质控菌株染色对照（金葡菌、大肠杆菌）.六、操作步骤1、已固定的细菌(或其它）涂片,滴加第一液染1分钟水洗。
2、冲去残水滴加第二液，媒染1分钟，水洗。
3、去残水,用95％酒精脱色，至无明显紫色液渗出为止，水洗。
4、用第四液复染10-30秒钟，水洗，干后镜检。
七、结果可报区间革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
八、实验室解释1、染色关键在于涂片和脱色，故涂片要厚薄适宜。
脱色时若涂片上有水分，则脱色力强，易形成假阴性。
临床微生物检验基本技术标准操作规程微生物检验实验室标本处理标准操作规程 (137)微生物检验实验室标本接种标准操作规程 (138)微生物检验实验室细菌鉴定操作规程 (139)微生物检验实验室不染色标本检查法标准操作规程 (140)微生物检验实验室革兰染色标准操作规程 (141)微生物检验实验室抗酸染色标准操作规程 (142)微生物检验实验室墨汁染色标准操作规程 (144)微生物检验实验室药物敏感试验标准操作规程 (145)取粪便脓血部位标本根据检验申请单要求选择平板，立即接种。
4.6 尿标本接收标本后，立即对标本进行编号、登记，将尿标本混匀，用10ul定量接种环立即接种血琼脂平板、麦康凯平板，分离细菌和菌落计数。
参考文献[1] 周庭银编著.临床微生物诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2] 叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第3版.南京：东南大学出版社，2006编写人：AAA、BBB 操作人：本室操作人员批准人：XXX医院检验科微生物检验实验室标本接收标准操作规程文件编号：XXX-JY-CZ-WSW-0563灭菌。
用接种环伸入菌种管内挑取移种之菌落。
伸入斜面培养管内，先从斜面底部到顶端拖一条接种线，再自下而上蜿蜒划线，或直接自下而上蜿蜒划线。
将接种环垂直插入半固体培养基的中央，穿刺至培养基底部，然后穿刺线推出接种环。
4.4 穿刺培养法4.4.1 此法用于保存菌种，观察动力及某些生化反应。
4.4.2 以接种环挑取细菌培养物，插入半固体培养基的中央，穿刺至培养基底部，然后沿原穿刺线退出接种环。
4.5 液体培养基接种法用灭菌接种环挑取菌落或标本。
在试管内壁于液面交界处研磨，使细菌混匀在液体培养基中。
参考文献[1] 周庭银编著.临床微生物诊断与图解.第二版.上海：上海科学技术出版社，2007[2] 叶应妩，王毓三，申子瑜主编.全国临床检验操作规程.第3版.南京：东南大学出版社，2006编写人：AAA、BBB 操作人：本室操作人员批准人：革兰阳性球菌：选择GP卡（阳性菌鉴定卡）。
（最新）病原微生物实验室生物安全手册病原微生物实验室生物安全质量手册第 1 页共 46 页目录一、总则二、实验室生物安全管理体系三、生物因子生物危害评估四、实验室人员准入制度五、人员培训考核制度六、人员健康监护制度七、生物安全检查制度八、实验室人员生物安全行为规范及内务管理制度九、实验室菌种安全保管制度十、生物安全实验室资料档案管理制度十一、实验室废弃物管理制度十二、实验室消毒隔离制度十三、实验室生物危险标识使用规定十四、事件、伤害、事故和职业性疾病报告制度十五、实验室应急处置预案十六、生物安全标准操作规程(一)生物洁净安全柜标准操作规程(二)HH.BII.500电热恒温培养箱操作规程 (三)JY--B型生化培养箱操作规程(四)MJ-?型霉菌培养箱操作规程(五)SHJ系列净化工作台操作规程(六)立式压力蒸汽灭菌器操作规程(七)YXQ.WY.22.600?R型卧式圆形压力蒸汽灭菌器操作规程(八)YX930D电动吸引器操作规程(九)离心机操作规程(十)微生物实验室操作人员洗手、消毒操作规程十七、其他必要的管理性和技术性文件 (一)设施/设备监测，检测和维护制度 (二)防火安全制度第 2 页共 46 页(三)实验室用电安全制度(四)微生物实验室安全保卫制度第 3 页共 46 页一、总则1、目的为确保实验室全体员工熟悉生物安全法律、法规，建立生物安全意识，保证相关工作人员掌握开展工作必需的生物安全知识和技术，避免实验室感染，防止实验室事故，特制定此手册。
2、依据《病原微生物实验室生物安全管理条例》、《医疗废物管理条例》、《实验室生物安全通用要求》、《实验室生物安全手册》、《生物安全实验室建筑技术规范》 3、适用范围适用于进入微生物检查实验室所有工作人员。
4、修订国家及卫生部门涉及生物安全的法律法规发生修订更改时，本手册应相应作出修订。
二、实验室生物安全管理体系 1、公司成立生物安全委员会，全面负责公司生物安全工作。
菌落总数操作手册
一、概述
菌落总数是指在一定条件下生长的细菌菌落数，用于评估食品或环境的卫生质量。
本操作手册将详细介绍如何进行菌落总数检测，以确保实验结果的准确性和可靠性。
二、实验材料
1. 培养基：平板计数琼脂（PCA）
2. 试剂：无菌生理盐水
3. 器具：无菌棉签、无菌培养皿、无菌移液管（1mL）、天平、pH计、恒温培养箱、计时器、灭菌锅
三、实验步骤
1. 样品采集：使用无菌棉签采集适量样品，并放入无菌容器中。
对于液体样品，直接使用无菌移液管取样；对于固体或半固体样品，需将样品研磨或搅拌均匀后取样。
2. 样品稀释：将采集的样品进行稀释，使细菌能更好地在培养基上生长。
根据样品性质和预计菌落数，选择适当的稀释倍数。
一般采用10倍稀释法。
3. 制备平板：将PCA培养基加热融化后，冷却至45℃左右，倒入无菌培养皿中，每皿约15mL。
4. 接种样品：将稀释后的样品取1mL加入已制备好的平板中，用无菌玻璃棒均匀涂布在培养基上。
5. 培养：将培养皿倒置放入恒温培养箱中，在37℃下培养24-48小时。
6. 计数：计数平板上的菌落数，并记录结果。
根据实验要求，计算出样品中的菌落总数。
7. 结果报告：根据实验数据，撰写实验报告并向上级汇报检测结果。
四、注意事项
1. 实验前应保证所有器具和试剂的无菌状态，避免交叉污染。
2. 实验过程中要保持清洁卫生，避免人为误差。
中国疾病预防控制中心传染病预防控制所呼吸道传染病室肺炎链球菌相关实验技术操作手册细菌培养物核酸提取-简便提取法（DNA Extraction of Fast Method）提取开始前，请准备：37℃恒温水浴或金属浴。
70℃恒温水浴或金属浴。
100℃恒温水浴或金属浴。
透明质酸酶溶液（hyaluronidase，30mg/ml）。
变溶菌素溶液（mutanolysin，3000U/ml）。
提取步骤：1.在1.5ml离心管底部加入300µl 0.85%NaCl溶液。
2.刮取1取菌环新鲜培养的细菌于上述溶液中。
3.混合液于70℃环境，恒温孵育至少20min。
4.13000rpm离心2min，弃去上清。
5.加入80µl TE缓冲液重悬菌体。
6.加入6µl透明质酸酶溶液（hyaluronidase，30mg/ml），震荡混匀。
7.混和液于37℃环境，恒温孵育至少30min。
8.13000rpm离心2min，弃去上清。
9.加入80µl TE缓冲液重悬菌体。
10.加入10µl变溶菌素溶液（mutanolysin，3000U/ml），混匀。
11.混合液于37℃环境，恒温孵育至少60min。
12.混合液于100℃环境，灭活10min。
13.13000rpm离心2min，上清备用。
14.在离心管侧壁标记处标记菌株编号和提取时间；在离心管盖顶部标记菌株编号。
冷冻保存备用。
*Fast Extraction of DNA for Streptococcal Culture Isolates. CDC Strep Lab SOP.本手册仅供实验室内部使用2011年第1版。
微生物实验室标准操作程序质量手册实验操作者:XXXXXXXX执行日期：X年X月X日启用日期:XX年X月X日标准操作程序文件01 试剂贮存和配制区工作制度02 标本处理区工作制度03 细菌自动分析区工作制度04 试剂贮存和配制区标准操作程序05 标本处理区标准操作程序06 细菌自动分析区标准操作程序07 紫外消毒标准操作程序08 消毒液配制使用标准操作程序09 普通冰箱使用标准操作程序10 超低温冰箱标准操作规程11 洁净工作台使用操作规程12 VITEK32型自动分析系统标准操作程序13 移液器使用标准操作程序14 高速离心机操作标准操作程序15 冰箱维护和保养标准操作程序16 电热恒温水浴箱操作程序17 洁净工作台维护和保养程序18 可移动紫外消毒车使用操作程序19 加样器校准标准操作程序20 离心机维护保养操作程序21 温度计校准程序22 试剂的质检操作程序23_微生物实验室岗位职责（暂行）24 临床标本的保存程序25 临床检验及收费程序26 微生物检验收收费价格27 普通培养阴性操作程序28 真菌培养阴性操作程序29 苛养菌培养阴性操作程序30 抗酸杆菌培养阴性操作程序31 支原体培养检验操作程序标本处理区工作制度进入本区需穿工作服、工作鞋。
本区只能进行:临床标本的保存,标本接种、培养、及其菌株检验前处理、菌悬液制备、染色标本检查、非上机鉴定与药敏试验操作等危险操作，其它操作不得在此区进行.在整个本区的实验操作过程中，操作者必须戴手套、口罩和帽子，严格按照操作规程进行。
工作结束后必须立即对工作区进行清洁或消毒.非本实验室工作人员未经允许不得进入。
试剂配制和无菌区工作制度进入该区需穿专用工作服和工作鞋.本区只能进行贮存试剂的制备、试剂的分装和平板的制备。
在整个本区的实验操作过程中，操作者必须戴手套和帽子，严格按照操作规程进行.工作结束后必须立即对工作区进行清洁和消毒。
非本实验室工作人员未经允许不得进入。
微生物实验室生物安全管理手册宽城区疾病预防控制中心生物安全管理体系文件目录一、实验室人员和项目准入制度1.目的规范生物安全二级实验室的使用和管理，保证操作人员，实验对象和环境安全，确保检测结果准确可靠。
2.适用范围适用于生物安全二级实验室安全运转及在此环境下的所有检测工作。
3.职责进入生物安全二级实验室从事检测工作的所有人员严格按照本规定执行。
4.具体要求：4.1概述4.1.1生物安全二级实验室用于对检验者和环境有中度潜在危险样品的各项实验，必须符合下列规定：4.1.1.1具备操作资质的人员可在生物安全二级实验室内工作，其他任何人未经许可禁止进入实验室。
4.1.1.2在实验室内的一切活动，必须遵照生物安全手册的规定进行。
4.1.1.3实验室内污染的空气需通过高效过滤器后方能排出室外。
4.1.1.4实验室内产生的污水，必须经过消毒后方可进入公共污水系统。
4.1.1.5实验室的所有废弃品，必须通过高压灭菌后才能处理和清洗。
必须携出实验室的中间实验材料、更换维修的仪器设备、也只有在确保无病原微生物污染的条件下，才能携出实验室。
4.1.1.6实验室内准备二级全排式生物安全柜，所有可能造成污染的能够置于生物安全柜内的实验操作，置其内进行，以保证实验室内空间的安全。
4.1.2实验室运行的安全性要求本手册规定的各项要求，首先是为了保证实验室的安全运行，包括防止实验室工作人员的感染、防止实验室操作的病原微生物对环境的污染、防止检测样品的污染，保证实验结果的准确可靠。
4.1.3实验室工作的质量要求本手册规定的各项要求，同时也是为了保证实验室的工作质量，即：实验产生的各项结果和数据，必须准确可靠：实验室出具的检验报告，必须明确完整。
4.2实验室操作规程4.2.1启动实验室开始工作前半小时。
开启实验室主电源，使实验室及生物安全柜投入运行。
开启顺序：①开启屋顶风机②开启全排风③开启空调④开启安全柜⑤打开房间紫外线灯。
4.2.2个人防护工作人员按照下列要求进行个人防护，才能进入实验室区域：（1）在更衣室中换穿工作服和工作鞋。
杀菌系统操作手册客户方:新疆天润生物科技股份有限公司王晨光2013-8-1一.基础篇1. 杀菌机的作用：在一定的温度下，保持一定的时间，杀灭目标细菌；2. 脱气罐的作用：在真空状态下，将产品分散成薄膜，使产品中的气体（只要指氧气）从产品中逸出，以改善后列工序的工艺状况，并遏制成品的氧化，来保证产品风味。
影响脱气效果的三大因素：脱气温度、真空度、薄膜的厚度和面积；3. 均质机的作用：使牛奶中的脂肪在挤压、强冲击、失压膨胀的三重作用下破碎细化，从而使产品体系稳定，并利于消化吸收，提高营养价值；影响均质效果的三大因素：均质温度、均质压力、均质次数；4. 无菌罐的作用：I. 在正常生产时，避免了杀菌机的料回流。
减少了过度杀菌而产品褐变的风险；II. 在杀菌机进行清洗时，对灌装机持续供料。
减少了工艺辅助时间，提高了生产效率；III. 在灌装机出现故障时，对杀菌完的产品进行缓冲存储。
减少了杀菌机推料次数，降低了产品损耗；5. 工艺流程介绍：I. 系统的工艺流程：调配罐杀菌机无菌罐灌装机II. 杀菌机的工艺流程：III. 无菌罐的工艺流程：杀菌机十字阀组无菌罐灌装机末端阀组6. 部件位号的说明：本套设备中，所有部件的位号都是唯一的，知道了位号，就可以找到相应的部件。
以UAT1VA01为例：U A T1 VA 01设备名称设备序号部件所在位置部件类型部件序号I. 设备名称：U－杀菌机； E－脱气罐； S－无菌罐；II. 设备序号：如有多台同类设备，则按字母顺序依次排列；III. 部件所在位置：a. 在杀菌机中：T1－平衡缸部分； T3－闭环缓冲罐部分； DS－浓酸碱部分； W1－脱气均质预热段； W2、W3－低温水加热段； W4－高温水加热段； W5、W6－低温水热能回收段； W7－冷却段； F1－设备出口部分； WA－纯净水部分； T4－低温水缓冲罐部分； E1－高温水加热系统； E3－蛋白稳定辅助加热系统； ST－蒸汽进口部分；CS－冷凝水回收部分；b. 在杀菌机的脱气罐中：T1－脱气罐部分；c. 在无菌罐中：T1－无菌罐部分； CP－清洗进口部分； F1－十字阀组部分； CR－末端阀组部分； AR－无菌压缩空气部分； ST－蒸汽进口部分； CW－冷却水部分； A1－搅拌部分；IV. 部件类型：a. M－传感器：MT－温度； ML－液位； MP－压力； MC－电导率； MG－距离（接近开关）； MW－重量；b. V－阀门：VA-自动阀（包括气动阀和电磁阀）； VM－手动阀； VC－调节阀； VS－安全阀；c. PU－泵； PI－指针式压力表； TK－罐； HE－蒸汽/热水换热器； HH－保持管； FI－过滤器； CP－其它（包括视镜、疏水器、单向阀、破真空器等等）；V. 部件序号：即在同一设备、同一位置中，类型相同的部件的排列顺序；7. 部件状态的说明：鉴于工艺需要，阀门的无能源状态不是一致的。
医院检验科细菌室工作制度一、细菌室概述细菌室是医院检验科的重要组成部分，主要负责细菌相关的检验工作，包括细菌培养、鉴定、药敏试验等。
细菌室工作制度的建立和落实对于确保检验结果的准确性和科学性具有重要意义。
二、细菌室工作人员岗位职责及要求1. 实验室主任- 负责细菌室的日常管理和工作安排；- 确保实验室设备和试剂的正常运行和及时采购；- 指导和培训细菌室工作人员。
2. 技术人员- 负责细菌样本的接收、处理和分装；- 进行细菌培养和鉴定；- 进行药敏试验；- 编写细菌鉴定报告。
3. 实习人员- 协助技术人员进行实验室工作；- 学习并掌握细菌培养和鉴定技术。
三、细菌室工作流程1. 样本接收与处理- 接收样本并登记相关信息；- 按规定操作样本处理流程，保证样本的完整性和无菌状态。
2. 细菌培养- 根据标本的特征选择合适的培养基；- 按照操作规程进行细菌培养的准备工作，如对培养基进行准备、消毒等；- 将样本通过无菌操作接种于培养基上；- 控制培养条件以促进细菌的生长。
3. 细菌鉴定- 根据培养物的形态、生理生化特性等进行初步鉴定；- 进行进一步的鉴定确认，如进行酶学测试、血清学反应等。
4. 药敏试验- 选择合适的抗生素，按照规定方法进行药敏试验；- 判读药敏试验结果，制定相应的治疗方案。
5. 报告编写与审核- 技术人员根据鉴定和药敏结果撰写相关报告；- 报告经实验室主任审核后才能正式发布。
四、细菌室的质量控制1. 内部质量控制- 每天定期进行细菌培养试验的质量控制，包括使用质控菌株；- 定期检查和维护细菌室设备的正常状态；- 确保试剂的有效期和储存条件。
2. 外部质量控制- 定期参加相关质量控制活动，如参与外院质检组织的比对试验。
五、安全与卫生措施1. 维护实验室洁净- 细菌培养过程中保证操作台、仪器设备和容器的清洁；- 定期进行实验室消毒，以预防交叉感染。
2. 个人防护- 实验操作时戴上手套、口罩和工作服；- 操作前后进行手部消毒。
临床细菌检验工作的基本要求和技术一、对临床细菌检验人员的要求1．负责鉴定及签发报告的主管技术人员应通晓诊断细菌学的全面知识。
2．一般细菌室工作人员均应具备细菌传染、消毒、灭菌的知识。
3．通晓细菌室守则，并严格遵守。
4．负责人应不断更新知识，了解细菌学检验的新进展。
5．定期或随时与临床医师联系，主动参与临床病例讨论，了解病情及治疗情况，达到细菌检验与临床的密切联系。
6．工作人员应定期进行健康体检及必要的预防接种，增强自身抵抗能力。
二、工作人员守则在细菌室工作人员应注意，既不要给室内带来污染，也不要被室内的微生物感染。
工作人员必须遵守以下规则：1．穿专用的工作衣、帽入室；必要时应戴口罩。
2．不允许无关人员进入实验室。
3．室内禁止饮食、吸烟、闲谈等非专业活动。
4．养成在室内手不触及口、脸、头发及躯体的习惯。
5．操作中不可说话，以免口中飞沫污染标本。
6．每次完成工作和离开实验室前，应用肥皂洗手，接触了致病菌类，须用消毒剂消毒手。
7．个人物品不许带入室内。
8．当工作环境被细菌培养物污染，必须用适当的强消毒液泼撒覆盖污染物，并报告主管人员采取必要的措施。
9．工作人员被细菌培养物污染，应用弱或中等消毒剂清洗，必要时应给予药物治疗，并向主管负责人报告，进一步采用特殊措施。
基本染色方法染色的第一步是制作涂片。
菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片上涂布。
菌落涂片时，先取生理盐水1滴，置玻片上，用接种针挑取菌落，在盐水中涂布。
涂片时必须注意应轻轻操作。
猛烈的动作会改变菌细胞原有的排列形式，或造成细菌鞭毛脱落，影响结果的准确性。
制备的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细胞形态改变。
将固定后的涂片进行染色。
一、革兰染色本染色是最基本的染色法，可用于标本涂片或菌落涂片。
染色结果将细菌分为革兰阳性(紫色)和革兰阴性(红色)两类。
试剂1. 结晶紫溶液A液：结晶紫2g95％乙醇20mlB液：草酸铵0.8g蒸馏水80ml需在用前24h将A液、B液混合，过滤后装入试剂瓶内备用。
2．碘液碘1g碘化钾2g蒸馏水300ml碘与碘化钾混合并研磨，加入几毫升水，使其逐渐溶解，然后研磨，继续加入少量蒸馏水至完全溶解。
最后补足水量。
也可用少量蒸馏水，先将碘化钾完全溶解，再加入碘片，待完全溶解后，加水至300ml。
3．脱色液：95％乙醇。
4．复染液A. 贮存液：沙黄 2.5g95％乙醇100mlB. 应用液：A液10ml蒸馏水90ml染色方法：1．涂片经火焰固定，加结晶紫液染1 min，清水冲去染液。
2．加碘液染l min，水洗。
3．加脱色液，不时摇动约10～30s，至无紫色脱落为止，水洗。
4．加复染液，染30s，水洗。
5．干后镜检。
二、抗酸染色抗酸染色直接用于痰标本时，可以适当增加标本涂片的厚度，以提高检出率。
染厚涂片时，须掌握复染色时间。
如果背景过深，影响镜检。
奴卡菌及放线菌可呈弱抗酸性，取培养菌落涂片染色时，呈现两种现象，视野中有些菌细胞阳性，另外一些则阴性；有时同一个菌体上，红色的深浅亦有不同，观察时应予注意。
抗酸染色有两种常用方法：①碱性复红法又称萋纳(Ziehl—Neelsen)法。
②荧光染料金胺O法(也称金胺O-罗丹明B法)。
(一)碱性复红染色法试剂1．萋纳石炭酸复红溶液碱性复红乙醇饱和溶液10ml5％石炭酸溶液90ml2．脱色剂*浓盐酸3ml95％乙醇97ml3．复染液(吕弗勒美蓝液)美蓝乙醇饱和溶液30ml10％氢氧化钾0.1ml蒸馏水100ml染色方法1．涂片经火焰固定，加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾。
染5 min(若染色奴卡菌需要加长时间)，水洗。
2．加脱色剂，不时摇动玻片至无红色脱落为止，水洗。
3．加复染液，染0.5～l min，水洗。
4．干后镜检。
分枝杆菌呈红色，背景为蓝色。
*：奴卡菌、放线菌标本染色时，脱色剂改用2％硫酸水溶液。
(二)金胺O-罗丹明B染色法染剂1．罗丹明B液：罗丹明B 0.1g加蒸馏水100ml；2．0.1％金胺O液：金胺O 0.1g加蒸馏水95ml，再加入纯石炭酸5ml，混匀；3．3％盐酸酒精；4．稀释美蓝液：吕弗勒美蓝液10ml，加蒸馏水90ml，混匀。
方法1．涂片固定后加第1液30～90s。
2．弃去第1液后加第2液染15min。
3．用第3液脱色1～2min，水洗。
4．滴加第4液染30s，水洗，待干，荧光抗酸菌在暗背景中呈现金黄色荧光。
三、鞭毛染色用于观察菌体上有无鞭毛、鞭毛在菌体上的位置以及鞭毛的数量。
在细菌鉴定中，特别是非发酵菌的鉴定中很重要。
鞭毛染色可以直接从平板上挑选菌落，或从斜面上刮菌苔涂片即可，但必须注意动作尽量轻，以免鞭毛从菌体上脱落。
菌落应是生长在营养较好的琼脂平板(如血平板、营养琼脂)上的过夜培养物。
不可采用有抑制剂的选择性培养基，如中国蓝、麦康凯、SS琼脂等。
观察鞭毛时，应耐心寻找整个涂片上的菌细胞，因为并不是涂片上每个细菌细胞上的鞭毛特性及数量都一样，应以鞭毛数量最多的菌细胞为准。
鞭毛染色(改良Ryu法)试剂A液：5％石炭酸10ml鞣酸2g饱和硫酸铝钾液10mlB液：结晶紫酒精饱和液应用液：A液10份，B液1份，混合，室温存放。
染色方法1．玻片的处理：要求用新的载玻片。
用前须在95％酒精中浸泡24小时以上。
用时从酒精中取出，以干净纱布擦干后使用。
2．在玻片上滴蒸馏水两滴。
一张玻片上可同时制2个涂片。
3．用接种环挑取血平板上菌落少许，将细菌点在玻片上的蒸馏水滴的顶部。
一般只需点一下，仅允许极少量细菌进入水滴，不可搅动，以免鞭毛脱落。
4．玻片置室温自然干燥。
5．滴加染液于玻片上，染色。
6．约10～15min后，用蒸馏水缓慢冲去染液。
冲洗时应避免使染液表面的金属光泽液膜滞留在玻片上，影响镜检。
7．玻片自然干燥后，镜检时应从涂片的边缘开始，逐渐移向中心。
寻找细菌较少的视野，鞭毛容易观察。
细菌密集的地方，鞭毛被菌体挡住，不易观察。
四、异染颗粒染色用于白喉棒状杆菌染色，异染颗粒可明显地被显示出来。
标本直接涂片或细菌涂片均可用改良阿伯特(Albert)法染色来观察异染颗粒。
试剂甲液：甲苯胺蓝0.15g孔雀绿0.2g冰醋酸1ml95％乙醇2ml蒸馏水100ml将各染料先溶于乙醇，然后加入水与冰醋酸的混合液中，充分混匀。
静置24h后过滤备用。
乙液：碘2g碘化钾3g蒸馏水300ml先将碘化钾加少许蒸馏水(约2m1)，充分振摇，待完全溶解，再加入碘，使完全溶解后，加蒸馏水至300ml。
染色方法1. 涂片经火焰固定，加甲液，染3～5 min。
水洗。
2．滴加乙液，染l min。
水洗。
3．干后镜检，菌体呈绿色，异染颗粒呈蓝黑色。
五、墨汁荚膜染色用于观察菌体有无荚膜结构，借此鉴定某些菌，如新型隐球菌。
传统的方法是用印度墨汁，但目前国内无售。
常规工作可以用墨汁或墨水代替，但应注意颗粒不能太粗，否则影响观察结果。
有人用5％黑色素(nigrosin)水溶液做染料，效果较好。
试剂印度墨汁或5％黑色素水溶液。
染色方法将标本与1滴染色液在载玻片上混合，加上盖玻片，轻轻压一下，使标本混合液变薄。
在低倍镜下寻找有荚膜的菌细胞。
找到后，转换高倍镜确认。
葡萄球菌属一、常规鉴定葡萄球菌的鉴定：首先须与其他的革兰阳性球菌鉴别，然后再作属内种的鉴定。
(一) 与其他革兰阳性球菌鉴别临床标本中常见到的革兰阳性球菌，除葡萄球菌属外，还有微球菌属和气球菌属等。
所以，在菌属内菌种鉴定之前，首先与这几属细菌鉴别(见表)。
表葡萄球菌属与其他革兰阳性球菌的鉴别 a菌名特征b严格需氧四联状排列紧粘琼脂动力5%NaCl琼脂触酶c氧化酶d(改良法)厌氧下葡萄糖产酸e耐药杆菌肽f0.04U/片呋喃唑酮g100ug/片葡萄球菌属- D - b - + + - d + -气球菌属- + - - + - - (+) - -动性球菌属+ D - + + + ND - ND -口腔球菌属- D + - - 土- + - -微球菌属+ + - - + + + - - + 注： a．葡萄球菌属、动性球菌属、口腔球菌属、微球菌属皆隶于微球菌科。
b．符号：+，90％以上阳性；土，90％以上弱阳性；一，90％以上阴性；d，1l％一89％阳性；ND，未试验；( ) 迟缓反应。
c．在某些菌种中出现触酶弱阳性或假阳性反应，是由于在培养中补充血红素，活化某些菌株触酶活性。
d．Faller和Schleifer改良氧化酶试验为检出细胞色素C。
e．标准的氧化—发酵试验。
f．+，耐药或无抑菌环，微球菌、口腔球菌、气球菌敏感，抑菌环10～25mm。
g．十，耐药或抑菌环≤9mm；一，敏感，抑菌环15～35mm。
h．表皮葡萄球菌有些菌株生长时紧固地粘附于琼脂表面，此种特性与细菌产生浓的粘液相关。
1．与链球菌鉴别：葡萄球菌与链球菌的区别如下：在镜下，葡萄球菌以单、双、葡萄状排列，菌体呈圆形。
链球菌以成单、双、链状排列，菌体形态为圆形或椭圆形。
葡萄球菌触酶试验阳性，链球菌则阴性。
2．与微球菌的鉴别：实验室常用的鉴别依据是形态和发酵葡萄糖产酸。
在镜下，葡萄球菌以葡萄状排列为主，菌体较小；微球菌以四联排列为主，且菌体较大。
葡萄球菌发酵葡萄糖产酸试验阳性，微球菌阴性。
此外杆菌肽、呋喃唑酮敏感试验有利区别两属菌种。
(二) 临床8种常见葡萄球菌的鉴别目前葡萄球菌已被命名有27个种。
临床标本中最常见有意义菌种是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、溶血葡萄球菌、里昂葡萄球菌、施氏葡萄球菌、中间葡萄球菌和猪葡萄球菌。
首先用凝固酶试验将其分为凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌(包括中间和猪葡萄球菌)和凝固酶阴性的其他葡萄球菌，然后用新生霉素敏感试验。
推断新生霉素耐药为腐生葡萄球菌。
下表列出了关键鉴定试验来区别上述8个菌。
二、试验方法(一)触酶试验(过氧化氢酶试验)试剂：3％H2O2溶液，置棕色瓶内于4℃阴暗处保存。
方法：先挑取固体培养基上的菌落，置于洁净的玻片上，然后滴加3％过氧化氢溶液1～2滴。
静置之，lmin内产生大量气泡的为阳性，不产生气泡的为阴性。
表有临床意义的8种葡萄球菌关键性鉴定菌种试验菌落色素葡萄球菌凝固酶凝聚因子耐热DNA酶碱性磷酸酶吡咯烷酮酶鸟氨酸脱羧酶脲酶β半乳糖苷酶产生V|P新生霉素耐药多粘菌素B耐药需氧下产气D|蕈糖D|甘露醇D|甘露糖D|松二糖D|木糖D|纤维二糖麦芽糖蔗糖金黄色葡萄球菌+ + + + + - - d - + - + + + + + - - + + 表皮葡萄球菌- - - - + - (d)+ - + - + - - (+)(d)- - + + 溶血葡萄球菌 d - - - - + - - - + - - + d - (d)- - + + 里昂葡萄球菌 d - (+)- - + + d - + - d + - + (d)- - + + 施氏葡萄球菌- - + + + + - - (+)+ - - d - + - - - - - 腐生葡萄球菌 d - - - - - - + + + + - + d - + - - + + 中间型葡萄球- + d + + + - + + - - - + (d)+ d - - ±+ 猪葡萄球菌菌- d- + + - - d - - - + + - + - - - - +注意点：1．注意过氧化氢为3％，应用30％浓的H2O2，用时稀释10倍。
