FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→染色体显带→荧光显微镜检测→结果分析。FISH(fluorescence in situ hybridization) 荧光标记的原位杂交技术
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试剂和说明
提供的材料
一盒包含4种试剂，可做20次试验，一次检测22mm×22mm靶区。
X/Y DNA探针盒：
X/Y DNA探针（已提前变性）：﹣20℃避光保存
DAPIⅡ复染剂：﹣20℃避光保存
NP-40：﹣25~﹣30℃
22×SSC：﹣20℃~﹣25℃
储存和处理
未开封X/Y DNA试剂盒﹣20℃避光干燥处保存。20×SSC盐和NP-40可以单独储存于室温。阳性对照片应在-20 ℃条件下，密封加干燥剂保存。
需要但公司不提供的材料
实验室试剂
超纯甲酰胺
100%乙醇，室温储存
浓缩的（12N）盐酸
1N氢氧化钠
纯净水（蒸馏水或去离子水或Milli-Q），室温储存
固定剂（3:1 甲醇：乙酸）每日新鲜配置
Drierite(商品名，干燥用无水硫酸)和液氮
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实验室设备
荧光显微镜设备和推荐的滤光片
相差光学显微镜
预清洁的显微镜玻片
载玻片加热器（45℃-50℃）
22mm×22mm玻璃盖玻片
可调容积吸管（1-10ul）和无菌微量移液管头
聚丙烯微量离心管（0.5ml或1.5ml）
计时器
磁力搅拌器
漩涡混合器
微量离心机
刻度量筒
水浴锅（67±2℃和73±1℃）
有氧培养箱（42℃）
钻石笔
湿盒
镊子
一次性注射器（5ml）
染色缸（6）建议型号：Wheaton Product.No.900620竖式染色缸
pH剂和pH试纸
温度计
金属丝试管架
橡胶胶水
0.45um细孔过滤设备
工作液的准备
20×SSC
66g 20×SSC
200ml 纯化水
250ml 最终量
彻底混合，用pH计室温下测pH。如果需要，用浓盐酸调pH到5.3。加纯水至总量250ml。通过0.45um孔径的过滤设备过滤。室温储存6个月。
变性液
49ml 甲酰胺
7ml 20×SSC pH 5.3
14ml 纯化水
70ml 最终量
充分混合，放置于玻璃染缸。用pH计室温下测pH。确保pH在7.0-8.0。储存于有盖容器2-8℃。可最多使用1周。每次用前测定pH。
乙醇洗液
用100%乙醇和纯化水v/v稀释70%，85%。盖紧容器盖子室温下储存。若未发生蒸发或因过量使用所致溶液稀释，可使用1周。
0.4×SSC洗液
950ml 纯化水
20ml 20×SSC pH 5.3
1000ml 最终量
彻底混合。用pH计室温下测pH，用1N氢氧化钠调pH至7.0-7.5。加纯水至总量1000ml。通过0.45um孔径的过滤设备过滤。未使用过的液体室温储存6个月。使用过的液体当日丢弃。
0.1%NP-40在2×SSC中
100ml 20×SSC pH 5.3
849ml 纯化水
1ml NP-40
1000ml 最终量
彻底混合，用pH计室温下测pH，用1N氢氧化钠调pH至7.0-7.5.加纯水至总量1000ml。通过0.45um孔径的过滤设备过滤。加入70ml至染缸中保持室温。未使用的液体于加盖容器中室温储存6个月。使用过的液体当日丢弃。
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标本收集、处理、储存和玻片准备
标本收集和处理
FISH测试步骤
标本DNA变性：
1.在准备玻片前将杂交湿盒（一个密闭容器）置于42℃培养箱预热至42℃。
2.加入变性液至玻片染色缸并于73±1℃水浴至少30min。使用前测量温度。
3.标本DNA变性：将准备好的玻片浸泡在73±1℃变性液中5min。每一个玻片染色缸一
次不要放入超过4张玻片。
4.用镊子将玻片从变性液中移出并立即置于室温下70%酒精洗液。摇动玻片除去甲酰胺。
让玻片立于酒精洗液中1min。
5.从70%酒精中移出玻片，依次用85%、100%酒精重复步骤4。
6.晾干多余的酒精：用吸墨纸触及玻片底边并用实验室擦拭纸擦拭玻片下面。
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7.在滴加探针溶液前，将玻片置于45-50℃载玻片加热器上不超过2min。
注意：如果在探针准备好之前玻片已备好超过2min，玻片应保留在100%酒精广口瓶内。在将玻片置于玻片加热器前不要风干。
探针准备
1.将探针在室温复温，以降低其粘度便于准确吸取。
2.涡流混合。在微量离心机轻微离心1-3s，使内容物沉于试管底部。再次轻轻涡流混合。注意：探针是提前变性的，在标本玻片上滴于靶区。
杂交
1.将10ul探针溶液滴于玻片的靶区。立即将22mm×22mm盖玻片覆盖于探针溶液上使溶
液在盖玻片下均匀扩散。气泡会干扰杂交，应避免。
注意：在盖上盖玻片前勿将探针溶液滴在多个靶区。
2.将玻片置于提前预热至42℃的杂交湿盒中，盖紧湿盒的盖子。
3.将杂交湿盒放于42℃培养箱，杂交过程至少30min。
注意：在一些标本中，为获取更强的信号，也许需要更长的杂交时间。可能过夜培养（长达16小时）。超过1小时的培养，盖玻片必须用橡胶胶水一类的可清除密封剂密封，杂交湿盒必须加湿。过程如下。
用5ml注射器抽橡胶胶水。在盖玻片和玻片周围涂少量橡胶胶水，从而形成密封圈。
将玻片置于加湿的杂交湿盒中（一个密闭容器,内置一片浸湿的吸墨纸或在容器内侧贴1in.×3in.纸巾）。
用密闭门关盖湿盒，培养1-16小时。
培养后，从玻片上除去橡胶胶水。
杂交后洗涤
1.加入0.4×SSC（pH7.0-7.5）至玻片染色缸中。将玻片染色缸放于73±1℃水浴中至少30min
或者直至溶液温度达到73±1℃，以预热0.4×SSC溶液。
注意：如果一次杂交的玻片数量超过4片，必须分批次洗涤。每次洗涤前洗液温度必须回至73±1℃。
2.从第一张玻片的靶区移去盖玻片并立即将玻片置于含0.4×SSC玻片染色缸中。摇动玻片
1-3秒。重复操作剩下3张玻片，73±1℃温育2min。
注意：在新加入玻片前不要移去盖玻片？在最后一张玻片加入水浴后开始计时2min。
3.从水浴中拿出所有玻片放于室温2×SSC/0.1%NP-40缸中50-60s。玻片放置于水浴后摇动
1-3s。
