HPLC法测定酱油中的苯甲酸和山梨酸

应用高效液相色谱法测定食品中3种防腐剂的含量摘要：近年食品抽检中发现食品防腐剂超标使用，因此了解常见食品中防腐剂含量，可为食品安全监管提供参考。

采用高效液相色谱法对糖果、中式糕点及酱卤肉制品中苯甲酸、山梨酸及脱氢乙酸含量进行测定分析。

结果表明，中式糕点均含有苯甲酸，属于违法添加苯甲酸类防腐剂的食品；酱卤肉制品山梨酸含量超过国家标准规定的限值；其他食品的苯甲酸、山梨酸和脱氢乙酸含量均符合国家标准规定。

可见，苯甲酸、山梨酸存在超标使用问题，需要加强抽样检查监督管理力度，增加食品安全水平。

关键词：苯甲酸；山梨酸；脱氢乙酸；高效液相色谱随着经济水平的发展和科技水平的提高，市场上不断出现各式各样、色彩鲜明、可口美味、形状各式的食品，而多数食品易受微生物影响发生腐败变质，但为了到达更好的贮藏效果，会人为的在食品中适量添加如苯甲酸、山梨酸、脱氧乙酸等常用的食品防腐剂已达到增加食品储存时间的目的。

在国家发布的GB2760《食品添加剂使用标准》中就对所有类型的防腐剂在各种食品中的最多用量设定了严苛的要求，在规定范围内添加可以有效保证食品安全问题，但化学防腐剂长期且大量被人体摄入则可能会对人体有影响，如诱发癌症、导致畸变、引起中毒及其他影响人体健康的潜在危害[1,2]。

因此通过合适的方法检测食品中防腐剂的含量对我们来说是非常必要的。

目前国家标准或地方标准中很少有能够同时检测苯甲酸、山梨酸和脱氢乙酸的方法，即使有同时检测的方法但检测过程过于复杂。

本文应用高效液相色谱法对6种食品中苯甲酸、山梨酸、脱氧乙酸3种防腐剂的含量进行测定。

1材料与方法1.1 仪器与试剂本次实验所用样品均采集于本市各镇商场超市、门店，实验所用主要仪器为QC系列超纯水机、离心机、数控超声波清洗器、涡旋混匀仪、电子天平；试验条件是高效液相色谱；试剂为甲醇、苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸。

1.2 实验方法1.2.1 苯甲酸、山梨酸及脱氢乙酸标准溶液配制依次从不同标准储备液中提取出一定数量的溶液，将其掺杂搅拌制作成混合标准液，其浓度是100μg/mL；接着，置于0-4℃环境内贮存备用，用水分别进行稀释，使其变成1μg/mL、5μg/mL、10μg/L、20μg/mL以及50μg/mL的混合标准工作溶液。

高效液相色谱法同时测定食品中苯甲酸山梨酸脱氢乙酸的步骤1 材料与方法：1.1仪器：(1)高效液相色谱仪(2)分析天平，(3)酸度计，(4)离心机，(5)振荡器，(6)超纯水仪；试剂：(1)苯甲酸，(2)山梨酸，(3)脱氢乙酸，(4)甲醇；提取试剂：(1)0.3%盐酸乙醇溶液,(2)0.02mol/L磷酸氢二钾溶液1.2标准溶液的配制精密称取苯甲酸，山梨酸，脱氢乙酸对照品各适量，加乙醇溶解，配制成1.0mg/ml 的标准储备溶液。

1.3色谱参数和条件（1）色谱柱：DIONEX Acclaim 120 C18(4.6*250mm,5μm)（2）流动相：甲醇—0.02mol/L磷酸氢二钾溶液（10:90）（3）流速：1.0ml/min（4）进样量：10μL（5）检测波长：230nm(苯甲酸，山梨酸)，293nm（脱氢乙酸）1.4样品处理1.4.1 固体样品（如熟肉制品.豆制品及糕点类）（1）称取捣碎混匀的样品5g ( 精确至0.01g ) 于具塞三角瓶中，（2）精密加入25ml提取溶剂，振荡1h后，于4℃放置24h ，（3）离心，取上清液3ml，用水定量稀释至10ml，离心，经0.45 μm滤膜过滤，（4）进液相色谱仪分析。

1.4.2 液体样品( 如冷冻饮品)（1）将样品于室温下解冻后，称取10g ( 精确至0.001g ) 于25ml 量瓶中，（2）用提取溶剂定容至刻度，混匀，于4℃放置24h ，（3）离心，取上清液3ml ，用水定量稀释至10ml，离心，经0.45μm滤膜过滤，（4）进液相色谱仪分析。

2数据处理2.1标准曲线与检出限精密量取标准储备溶液适量，用提取溶剂定量稀释制成每ml 中含0.1μg,0.5μg,1μg,4μg,8μg,12μg,16μg,20μg 的标准混合溶液，按前述色谱条件进行测定， 且每个浓度做两组平行试验，以浓度C(μg/ml)为横坐标，峰面积A 为纵坐标制作标准曲线；以浓度C(μg/ml) 对峰面积A 进行线性回归，按信噪比3，计算检出限2.2 精密度和方法回收率试验（1）精密度实验：取同一对照品溶液( 各浓度均为10μg/ml ) ，重复进样，测出各峰面积的 RSD 值。

酱油中苯甲酸和山梨酸含量测定摘要：目的：采用碱溶液反相萃取—高效液相色谱法（HPLC）测定酱油中苯甲酸和山梨酸。

方法：以国标萃取法为基础，再对其用碱溶液进行反萃取的方法，对酱油样品进行前处理，通过加内标物的方法提高实验的精确度。

结果：苯甲酸和山梨酸的线性回归相关指数都大于0.99、最小检出限（LOD）都低于0.1ppm，加标回收率皆大于84%，相对偏差皆小于16%。

结论：该方法灵敏、可靠，可用于酱油中苯甲酸和山梨酸的快速定量检测。

关键词：反相萃取；高效液相色谱法；酱油；苯甲酸；山梨酸酱油是我国传统的、富有特色的、使用最广的、味道鲜美的调味品，它赋予食品以适当的色、香、味，具有杀菌治病、调味之功用。

由于酱油营养丰富，适于微生物生长繁殖，而微生物又是到处不在无孔不入，所以细菌、霉菌和酵母之类微生物的侵袭通常是导致酱油败坏的主要因素。

为了保藏酱油，防止酱油腐败变质，保持酱油的鲜度和良好的品质，达到其对保质期的要求，酱油中一般都使用食品常用防腐剂—苯甲酸和山梨酸，但过多防腐剂会严重损害人体健康，国家对防腐剂的使用有严格限量规定，因而检测酱油中防腐剂的含量具有重要意义。

目前酱油中苯甲酸和山梨酸的测定方法主要有气相色谱法、高效液相色谱法和薄层色谱法，其中高效液相色谱法因其仪器精确度高，在苯甲酸和山梨酸的检测中最常用。

对于酱油的前处理国标是对其先进行酸化，再通过乙醚进行萃取，除此之外还有其他诸多方法，如对粘度比较大的进行固相萃取、通过加入亚铁氰化钾和乙酸锌溶液沉淀蛋白质、脂肪并过滤后进行测定、还有就是本文所用的对国标处理后的样品进行碱溶液反相萃取。

这样可以大大的减少样品中的杂质，从而减少了杂质峰对高效液相色谱检测的影响。

另外本文所采用的内标法的处理方法是一个创新之举，避免了外标法测定时前处理萃取不完全以及其他处理过程带来的损失从而大大的提高了检测的准确度。

1 实验部分1.1 溶液配制乙酸铵溶液( 0. 02 mol /L) : 准确称取乙酸铵1. 542 g, 用水溶解, 定容至1 000 mL, 经0. 45Lm 膜过滤。

食品中苯甲酸和山梨酸的分析苯甲酸和山梨酸是食品中常见的有机酸,它们可以提供食品的酸味和调味。

但这两种酸也有一定的毒性,因此在食品中的含量是有限制的。

为了对食品中苯甲酸和山梨酸进行分析,通常使用一些常见的分析方法,例如色谱分析、光度分析和红外光谱分析等。

具体来说,色谱分析是一种常用的分离和测定有机物的方法,可以将混合物中的各组分分离出来,并对各组分进行测定。

苯甲酸和山梨酸可以通过色谱分析进行测定,例如可以使用液相色谱法（HPLC）或气相色谱法（GC）等。

光度分析是另一种常用的分析方法,可以通过检测物质吸收光谱来测定有机物的浓度。

苯甲酸和山梨酸都可以通过光度分析进行测定,可以使用吸光度测定法或比色法等。

红外光谱分析是另一种常用的分析方法,可以通过检测物质吸收红外光谱来测定有机物的结构和浓度。

苯甲酸和山梨酸也可以通过红外光谱分析进行测定。

这些分析方法都具有一定的优点和局限性,在实际应用中,需要根据实际情况选择合适的分析方法进行分析。

通常,在对食品中苯甲酸和山梨酸进行分析时,需要结合多种分析方法的优势,以便提高分析的准确性和灵敏度。

此外,在进行食品中苯甲酸和山梨酸的分析时,还需要注意样品的前处理和样品的储存方式,以便保证分析的准确性。

苯甲酸和山梨酸在食品中的含量是有限制的,因为这两种酸都有一定的毒性。

例如,苯甲酸可能会对人体的呼吸系统和神经系统造成危害,而山梨酸可能会对人体的消化系统造成危害。

因此,在食品中苯甲酸和山梨酸的含量一般都有严格的限制。

通过进行食品中苯甲酸和山梨酸的分析,可以了解食品中这两种酸的含量,从而保证食品的质量和安全。

因此,食品中苯甲酸和山梨酸的分析是食品质量控制和食品安全管理中的重要环节。

卫生化学实验七高效液相色谱法HPLC测定饮料中山梨酸和苯甲酸一、实验目的与要求1、掌握高效液相色谱法测定饮料中苯甲酸和山梨酸的原理和方法2、了解高效液相色谱仪的基本结构和使用方法3、熟悉饮料样品的处理方法二、实验方法与原理苯甲酸和山梨酸广泛用于食品防腐剂,能够引起人的再生障碍性贫血,粒状白细胞缺乏等;因此国家严格限制其使用量;在本实验中,样品首先经过超声和加热除去二氧化碳和乙醇,然后过滤注入高效液相色谱仪,经反相C18液相色谱柱分离后,紫外检测器230 nm波长处检测;以色谱峰的保留时间定性,色谱峰面积在一定范围内与浓度呈线性关系进行定量分析;三、实验仪器与试剂1、仪器：高效液相色谱仪Waters,美国：2487紫外检测器、1525高压输液系统、717进样系统、Waters Breeze色谱工作站；超声震荡仪；100 ml烧杯1个； 1 ml和100 μl移液枪；离心管若干个；离心管架；微孔滤膜0.22 μm;2、试剂：1 甲醇色谱纯；醋酸铵溶液0.02 mol/L,色谱纯；流动相分别超声脱气10 min2 山梨酸储备溶液1.0 mg/ml：准确称取0.2500 g山梨酸,加超纯水定容至250 ml;3 苯甲酸储备液1.0 mg/ml：准确称取0.2500 g苯甲酸,加超纯水定容至250 ml;四、实验步骤1、样品处理碳酸饮料雪碧：吸取10 ml碳酸溶液超声5 min,然后用微孔滤膜0.22 μm 过滤,滤液备用;吸取100 μl滤液于离心管中,并加入900 μl超纯水,混合均匀标记为样品;2、配制标准溶液1 取一定量的苯甲酸储备液,经滤膜过滤于离心管中;吸取滤液50 μl于另一离心管并加入950 μl超纯水,得到50 μg/ml的苯甲酸标准品,做好标记;2 同理得到50 μg/ml的山梨酸标准品,做好标记;3 混合标准品配制：分别吸取500 μl过滤后的苯甲酸和山梨酸储备液于离心管中混合均匀,得到500 μg/ml的混合标准品;吸取50 μl混合标准品500 μg/ml于离心管中并加入950 μl超纯水,得到25 μg/ml的混合样,标记为混标;3、色谱条件：色谱柱：C18反相键合色谱柱流动相：甲醇-0.02 mol/L醋酸铵溶液5 : 95流速：1 ml/min 检测波长：230 nm 进样量10 μl4、标准品和样品测定1 分别进苯甲酸50 μg/ml、山梨酸50 μg/ml标准品,确定保留时间;2 记录混合标准品25 μg/ml的峰面积并按下式计算样品中苯甲酸和山梨酸含量：计算方法：Cx=F×Cs×Ax÷As式中：Cx—为样品中被测物的含量μg/ml；Cs—为苯甲酸或山梨酸标准品的含量μg/ml;F—为稀释倍数；Ax—样品的峰面积；As—标准品的峰面积;五、实验数据记录及结果计算1、苯甲酸、山梨酸标准品的保留时间物质苯甲酸山梨酸保留时间min 6.780 9.1522、混合标准品及样品的峰面积物质苯甲酸山梨酸样品苯甲酸山梨酸峰面积mAUmin 386576 2067181 234426 31073、实验结果计算根据公式：Cx=F×Cs×Ax÷As计算得：C苯甲酸=10×25×234426÷386576=151.6μg/mlC山梨酸=10×25×3107÷2067181=0.375μg/ml雪碧中含有151.6μg/ml的苯甲酸,0.375μg/ml的山梨酸;六、注意事项1、如果被测溶液含有气泡,对测定和仪器的使用均有影响,因此需要将被测溶液超声加热除去二氧化碳;2 、苯甲酸的灵敏波长为230 nm,山梨酸的灵敏波长为254 nm,在此波长测定时苯甲酸的灵敏度较低;因此波长选择230 nm;3、平衡前用甲醇：水5:95冲洗柱子15 min,再用甲醇-0.02 mol/L醋酸铵溶液5:95进行平衡;4、开机顺序：高压输液系统、进样系统、柱温箱、检测器、电脑软件;5 、使用盐做流动相的时候：水：甲醇=95: 5冲洗柱子20 min以上；然后用甲醇冲洗色谱柱20 min以上,保存色谱柱;6 、关机：清洗结束后,点击并将泵流量输入为0,等压力降为0时,关掉泵电源,退出Breeze工作站,再关闭仪器各部分电源及计算机;7、注意在移液枪加完一种试剂之后,一定要记得换枪头。

液相色谱法检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的疑难详解苯甲酸、山梨酸、糖精钠是衡量食品卫生质量的重要指标，苯甲酸、山梨酸的检测参照GB/，糖精钠的检测参照GB/T，即可开展实验。

苯甲酸、山梨酸、糖精钠虽是较常见的检测项目，但是要得到一个准确可靠的结果，也存在一定的难度，许多新手常出现因对方法理解发生偏差而检测出错的事故。

笔者根据自己多年该方面工作的实际经验出发，以苯甲酸、山梨酸为着重点，从样品前处理、检测仪器的选择、超标时的判断等几个易出问题的方面，进行了详细的阐述。

2样品前处理的注意事项GB/和GB/在文字结构上有缺陷，在涉及用仪器法测定苯甲酸、山梨酸、糖精钠时，只讲述了液体样品的前处理方法，没有涉及对固体样品的前处理。

食品样品往往含有大量的油脂、蛋白质，对提取极为不利；如处理不干净也会污染色谱柱，影响检测工作。

这类样品处理的关键在于如何找到一种较理想的沉淀剂，尽量排除待测样品中的油脂、蛋白质，且不影响待测物组分的回收率。

GB/使用5％硫酸铜溶液沉淀蛋白，对于蛋白质含量较低的食品尚可，对于豆粉、奶粉、月饼等高油脂、高蛋白样品则沉淀效果不理想。

如用10％钨酸钠溶液作为沉淀剂，效果好些；如用10％亚铁氰化钾溶液和20％醋酸锌溶液则效果更理想（这是笔者目前用过最理想的沉淀剂）。

具体操作步骤如下：取一定量样品，捣碎，利用四分法原理称取样品克于50ml比色管中，加水20ml，浸泡、振荡均匀，加入氢氧化钠溶液(1mol/L) ml，加入%亚铁氰化钾溶液，20%乙酸锌溶液，定容，振荡使其充分混匀后,用滤纸初滤除去沉淀物,初滤液过μm微孔滤膜,收集滤液于样品瓶中，样品处理液和标准有溶液各进样5uL 测定。

用这种方法简单易行，接触有机试剂少，重复性和回收率都令人满意；缺点是一定要用液相色谱法检测，有一定局限。

3检测仪器的选择虽然液相色谱仪操作起来比气相色谱仪要复杂，但笔者建议如条件许可仍尽量用液相色谱法检测。

原因如下：液相色谱法所用的样品处理方法远比气相色谱法简单，且不需使用有机试剂。

高效液相色谱法测定食醋和酱油中苯甲酸钠和山梨酸钾含量摘要：【目的】用高效液相色谱法测定食醋和酱油中苯甲酸钠和山梨酸钾含量。

【方法】以Hyperclone BDS C18柱(150×4.60 mm，5μm，phenomenex)为色谱柱；检测波长215~230nm，进样量10μL，流动相：甲醇：0.02mol/L 乙酸铵(35：65)，流量0.8mL/min，柱温30℃【结果】：食醋中的苯甲酸钠含量为127.15899ug/mol，酱油中的苯甲酸钠含量为723.60033ug/mol，未见则出山梨酸钾。

【结论】：高效液相色谱法具有高速、高效、高灵敏度的优点，所以数据准确，用外标法计算结果操作简单，计算方便，得出样品中苯甲酸钠的含量。

关键词：高效液相色谱法外标法苯甲酸钠山梨酸钾一、前言苯甲酸钠，化学式：C6H5O2Na，是苯甲酸的钠盐，苯甲酸钠是很常用的防腐剂，有防止变质，延长保质期的效果。

山梨酸钾别名2,4-己二烯酸钾，是山梨酸的钾盐，也是防腐剂。

本实验采用高效液相色谱法对酱油和醋中的苯甲酸钠和山梨酸钾的含量测定，方法简便快速，实用于苯甲酸钠和山梨酸钾的定量分析。

苯甲酸结构式：山梨酸钾结构式：二、实验目的和实验原理2.1.实验目的：（1）了解高效液相色谱仪基本结构和工作原理，以及初步掌握其操作技能；（2）学习高效液相色谱保留值定性方法和外标法的标准曲线定量方法；（3）掌握RP-HPLC法对食品中苯甲酸钠和山梨酸钾的测定方法；2.2．实验原理：将样品加热去除其中的二氧化碳和乙醇，用（1+1）氨水调pH值近中性，过滤后进高效液相色谱仪，进行反相色谱C18柱分离后，根据保留时间和峰面积进行定性定量分析。

三、仪器与试剂及试剂处理3.1. 仪器：高效液相色谱仪【高压输液泵LC-6A，检测器SPD-10A，保温箱CPD-10AS，进样阀7725I】；电子天平；纯水仪；离心机；超声波清洗机。

3.2．试剂：（1）色谱甲醇经滤膜0.45μm过滤；（2）（1+1）氨水：氨水与水等体积混合；（3）乙酸铵溶液0.02mol/L：称取1.54g乙酸铵，加水溶解并定容至1000ml，经过（0.45μm）过滤；（4）碳酸氢钠溶液20g/L：称取2g碳酸氢钠（优纯级），加水至100ml，振荡溶解；（5）苯甲酸钠标准储备液：准确称取0.1000g苯甲酸钠，加碳酸氢钠溶液（20g/L）5ml，加热溶解，移入100ml容量瓶中，加水定容至刻度。

HPLC法测定酱油中苯甲酸、山梨酸的含量及六省酱油样品测定结果分析张国跃;乔蓉霞;齐化元【摘要】目的:建立HPLC法测定酱油中苯甲酸、山梨酸含量的方法,分析各省添加状况.方法:采用HPLC法测定酱油中苯甲酸、山梨酸的含量.色谱柱:C18250mm×4.6mm,5-10μm;流动相:甲醇:0.02mol/L乙酸铵溶液(5:95);流速:1.0mL/min.结果:苯甲酸、山梨酸进样量分别在0.20396-3.50947μg和0.2-3.0μg范围内,与峰面积呈良好的线性关系.回归方程分别为Y=3E+06X-80251,r=1;Y=5E+06X-158903,r=1;苯甲酸平均回收率为98.31%,RDS=1.43%;山梨酸平均回收率为90.26%,RDS=2.82%.结论:该测定方法简单、快速、准确,适用于大批量样品的快速分析;六省酱油中均存在不同程度添加苯甲酸、山梨酸的情况.【期刊名称】《中国医药科学》【年(卷),期】2011(001)008【总页数】3页(P37-38,40)【关键词】HPLC法;酱油;苯甲酸;山梨酸【作者】张国跃;乔蓉霞;齐化元【作者单位】陕西省食品药品检验所,陕西,西安,710061;陕西省食品药品检验所,陕西,西安,710061;陕西省卫生监督所,陕西,西安,710054【正文语种】中文【中图分类】R155.5酱油是我国使用最广的调味品之一，由于酱油营养丰富，适于微生物生长繁殖，为了防止酱油腐败变质，保持酱油的鲜度和良好的品质，酱油中一般都会添加防腐剂苯甲酸、山梨酸。

随着现代食品工业的发展，食品添加剂的超量和超范围使用现象十分严重，对食品添加剂的检测也越来越受到人们的重视。

本实验用高效液相色谱法同时测定酱油中苯甲酸、山梨酸的含量，方法简便、快捷，适用于大批量样品的快速检测。

本次试验共收集到六个省份共计180批样品（每省30批），测定结果表明，六个省份酱油中均有不同程度添加苯甲酸、山梨酸的情况。