单向双向免疫琼脂扩散

一、实验目的1. 掌握双向琼脂扩散试验的原理。

2. 熟悉双向琼脂扩散试验的操作方法。

3. 学会分析双向琼脂扩散试验的结果。

二、实验原理双向琼脂扩散试验（Double immunodiffusion test）是一种经典的免疫学实验方法，用于检测抗原与抗体之间的特异性结合。

该实验基于抗原与抗体在琼脂凝胶中相互扩散的原理。

当抗原和抗体在琼脂凝胶中相遇时，如果两者浓度比例合适，就会在两者相遇处形成白色沉淀线，称为沉淀反应。

三、实验材料1. 抗原：待检测的样品。

2. 抗体：已知抗体。

3. 琼脂粉：精制琼脂粉。

4. 生理盐水。

5. 载玻片。

6. 打孔器（直径3mm）。

7. 湿盒。

8. 吸管。

四、实验方法1. 制备琼脂板：用生理盐水配制1.0～1.5%琼脂，隔水煮沸使溶化，用吸管吸取3.5ml趁热浇于载玻片上，制成琼脂板。

2. 打孔：待琼脂凝固后，按图所示用打孔器打孔，并用针头挑去孔中琼脂（孔距为5mm）。

3. 加样：在孔中加抗体，在孔的周围加抗原。

加样时勿使样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。

4. 扩散：将加好样品的琼脂板置于湿盒内，于37℃温箱中放置24小时后观察结果。

五、实验结果1. 观察孔间沉淀线的数目与特征。

2. 分析沉淀线的形状、大小、位置等特征，判断抗原与抗体之间的特异性结合。

六、结果分析1. 若凝胶中抗原抗体是特异性的，则形成抗原—抗体复合物，在两孔之间出现一清晰致密白色的沉淀线，为阳性反应。

2. 若在72小时仍未出现沉淀线，则为阴性反应。

3. 结果分析时，需考虑抗原特异性、抗原浓度、沉淀线形状等因素。

七、讨论双向琼脂扩散试验是一种简单、灵敏、特异的方法，可用于检测抗原与抗体之间的特异性结合。

该实验在临床医学、生物学等领域有广泛的应用，如病原体检测、药物过敏检测、肿瘤标志物检测等。

在本实验中，我们成功进行了双向琼脂扩散试验，并观察到了清晰的沉淀线。

这表明抗原与抗体之间存在特异性结合，验证了实验结果的准确性。

双向琼脂扩散试验实验报告双向琼脂扩散试验实验报告引言：双向琼脂扩散试验是一种常用的生物化学实验方法，用于研究物质在琼脂凝胶中的扩散速率。

本实验旨在通过双向琼脂扩散试验，探究不同条件下物质扩散的规律和影响因素。

实验材料与方法：实验材料包括琼脂凝胶、试剂、显微镜等。

实验方法为双向琼脂扩散试验，将琼脂凝胶切割成一定大小的块状，然后在琼脂凝胶上添加待测物质。

待测物质会通过琼脂凝胶的孔隙扩散，形成扩散圈。

通过观察和测量扩散圈的直径，可以计算出物质在琼脂凝胶中的扩散速率。

实验结果与分析：在实验中，我们选择了两种不同的物质进行双向琼脂扩散试验，分别是葡萄糖和氨基酸。

在相同的实验条件下，观察到葡萄糖的扩散圈直径较大，扩散速率较快；而氨基酸的扩散圈直径较小，扩散速率较慢。

这说明物质的性质对其在琼脂凝胶中的扩散速率有着显著影响。

进一步实验表明，温度对物质在琼脂凝胶中的扩散速率也有一定的影响。

在较高的温度下，扩散圈的直径较大，扩散速率较快；而在较低的温度下，扩散圈的直径较小，扩散速率较慢。

这与分子热运动理论相符，温度越高，分子的热运动越剧烈，扩散速率越快。

此外，我们还发现琼脂凝胶的浓度对物质扩散速率的影响。

在浓度较高的琼脂凝胶中，扩散圈的直径较小，扩散速率较慢；而在浓度较低的琼脂凝胶中，扩散圈的直径较大，扩散速率较快。

这可能是因为高浓度的琼脂凝胶具有更多的孔隙，使物质扩散的路径更加复杂，从而降低了扩散速率。

结论：通过双向琼脂扩散试验，我们发现物质的性质、温度和琼脂凝胶浓度等因素都会对物质在琼脂凝胶中的扩散速率产生影响。

葡萄糖的扩散速率较快，而氨基酸的扩散速率较慢；温度越高，扩散速率越快；琼脂凝胶浓度越低，扩散速率越快。

这些研究结果对于理解物质在生物体内的扩散过程具有重要意义。

在生物学、药学等领域，我们可以利用双向琼脂扩散试验的方法，研究药物在组织中的扩散速率，从而指导药物的使用和疗效评估。

然而，双向琼脂扩散试验也存在一些局限性。

单向扩散试验：琼脂内混入抗体，待测抗原从局部向琼脂内自由扩散，如抗原和相应抗体结合，则形成沉淀环。

1、试管法：将一定量的抗体混入0.7%琼脂糖溶液中，注入小试管内，上层加抗原溶液使待测抗原在凝胶中自由扩散，在抗原抗体比例恰当位置形成沉淀环。

2、平板法：是将抗体或抗血清混入0.9%琼脂糖内，未凝固前倾注成平板，然后在上打孔，将抗原加入孔中，放37℃让其自由扩散，24～48h后可见孔周围出现沉淀环，测定环的直径或面积计算标本中待测抗原的浓度。

有两种计算方法：l）Mancini曲线：适用大分子抗原的和长时间扩散（>48h）的结果，沉淀环直径的平方与抗原浓度呈线性关系c/d2=k.（其中c为抗原浓度 d为沉淀环直径 k为常数）
3、单向扩散试验检测时的注意点：
（1）抗血清必须特异性强、效价高、亲和力强，在良好条件下保存。

（2）每次测定都必须作标准曲线。

（3）每次测定时必须用质控血清作质控。

（4）注意双环现象（出现了两种抗原性相同成分）。

（5）应用单克隆抗体测量多态性抗原时，测定值偏低；用多克隆抗体测量单克隆病时，测定值偏高。

实验 8 单向琼脂免疫扩散试验一、目的了解单向琼脂免疫扩散试验的原理和操作过程。

原理将某种特异性抗体混合于琼脂中，制成含抗体的琼脂板，再于琼脂板上打孔，并将一定量的抗原加入孔中。

抗体与琼脂混合后，不会再扩散，只有孔中抗原向四周呈辐射状扩散，如抗原与已知的抗体相对应，在两者比例适合处即出现由免疫复合物所形成的白色沉淀环，沉淀环的大小（直径或面积）与抗原浓度成正比。

以不同浓度的标准抗原与固定浓度的抗血清反应后测得沉淀环直径，然后从标准曲线中求得其含量。

主要用于测定血清IgG、IgM、IgA和补体成分的含量。

材料1. 抗原：待测人血清、已知含量的IgG参考蛋白2. 抗体：抗人IgG抗体3. 3%琼脂凝胶、4.5ⅹ10cm塑料板、直径3mm打孔器、注射器针头、定量加样器、湿盒（盒内铺有湿纱布）、半对数坐标纸。

方法1. 抗体琼脂板的制备（1）将3%琼脂置沸水浴加热溶化，吸取6ml加至试管内，置56水浴保温。

（2）用 0.9%生理盐水将抗人IgG抗体作适当稀释，吸取稀释好的抗人IgG6ml加至另一试管，置56℃水浴保温。

（3）将上述在56℃中保温的琼脂和已稀释好的抗体充分混匀，立即将此12ml含抗体的琼脂倾注于放在水平台上的塑料板上，待板冷却。

此抗体琼脂板的厚度为2mm，琼脂浓度为1.5%。

2. 稀释参考血清和待测血清;（1）稀释参考血清：每支冻干参考血清中加入蒸馏水0.5ml，待完全溶解后，用生理盐水稀释成几个不同稀释度。

例如参考血清IgG含量为11.66mg/ml。

参考血清稀释度1：10 1：16 1：20 1：32 1：40 1：64IgG相应含量为1166 728 583 364 291 182（2）待测血清用生理盐水作1：40稀释。

3. 打孔用打孔器在琼脂板上打孔，孔径3mm，孔间距15mm，用注射器针头挑出孔中琼脂，不可损坏孔缘。

4. 加样打孔后立即用微量加样器分别吸取各种稀释度参考血清10ul，准确地加到琼脂板孔中，每种稀释度加二个孔。

1. 掌握双向琼脂扩散试验的原理和操作方法。

2. 了解抗原与抗体在琼脂凝胶中相互扩散的规律。

3. 学会观察和分析实验结果，为后续实验奠定基础。

二、实验原理双向琼脂扩散试验是一种检测抗原与抗体相互作用的实验方法。

该实验原理为：将抗原和抗体分别加入琼脂凝胶板上的小孔中，抗原和抗体在琼脂凝胶中各自向四周扩散，当两者相遇时，在适当的比例处形成白色沉淀线。

根据沉淀线的特征和位置，可以判断抗原与抗体的特异性和浓度。

三、实验材料1. 琼脂凝胶：1.0～1.5%琼脂，隔水煮沸使溶化。

2. 抗原和抗体：已知抗原和抗体，如羊抗人全血清、小牛血清、正常人混合血清等。

3. 打孔器：直径3mm。

4. 吸管：用于加样。

5. 湿盒：用于保持琼脂凝胶湿润。

6. 温箱：用于恒温培养。

四、实验步骤1. 准备琼脂凝胶板：用生理盐水配制1.0～1.5%琼脂，隔水煮沸使溶化。

用吸管吸取3.5ml琼脂液，趁热浇于载玻片上，制成琼脂板。

待琼脂凝固后，用打孔器打孔，并用针头挑去孔中琼脂（孔距为5mm）。

2. 加样：在中央孔中加入抗体，周围孔中加入各种抗原。

加样时注意不要使样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。

3. 置入湿盒：将加好样品的琼脂板置于湿盒内。

4. 培养观察：将湿盒放入37℃温箱中培养24～48小时。

5. 结果观察：观察凝胶中抗原抗体孔间沉淀线的数目与特征，分析实验结果。

实验中，将羊抗人全血清作为抗体，小牛血清和正常人混合血清作为抗原，分别加入琼脂凝胶板上的小孔中。

经过24小时培养，观察结果如下：1. 中央孔与周围孔之间出现白色沉淀线，表明抗原与抗体发生了特异性结合。

2. 沉淀线清晰，表明抗原与抗体之间的比例适宜。

3. 沉淀线长度与抗原浓度成正比，可以用于半定量分析。

六、实验分析1. 双向琼脂扩散试验是一种检测抗原与抗体相互作用的常用方法，具有操作简便、结果直观等优点。

2. 实验结果表明，羊抗人全血清与羊抗人全血清、小牛血清和正常人混合血清之间具有特异性结合。

单向、双向免疫琼脂扩散和免疫电泳（Single Immunodiffusion and可溶性抗原与相应抗体以合适的比例发生特异反应时，在一定温度和电解质存在的条件下，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。

沉淀反应的抗原可以是多糖、蛋白质、脂类等。

根据抗原与抗体的不同条件及其它因素，沉淀反应可以分为以下三种主要形式。

即：环状沉淀反应(ring precipitation reaction)，凝胶中沉淀反应(precipitation reaction in gel)，如单向扩散、双向扩散、对流电泳、免疫电泳以及微生物学实验中的絮状沉淀反应(floccu lation precipitation reaction)，如梅毒血清检验中的康氏（Kahn）及克莱氏（Kline）试验以及检测白喉杆菌毒力的体外试验-Elek 氏试验，检测毒素或类毒素的絮状沉淀单位测定等。

本实验主要介绍凝胶中的沉淀反应。

（一）单向免疫扩散(Single immunodiffusion)—人群血清IgG 正常值测定一、基本原理在含有特异抗体的琼脂板中打孔，并在孔中加入定量的抗原，当抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合，即形成白色沉淀环，其直径或面积与抗原浓度呈正相关。

同时用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检测未知标本的抗原浓度(mg/ml 或U/ml)。

应用这一实验方法可检测正常人群或患者血清中IgG、IgA 及IgM 的水平。

二、实验材料2%离子琼脂或生理盐水琼脂（内含2%NaN3）。

标准马抗人IgG 血清（抗体）（北京生物制品研究所生产）工作标准参考蛋白（北京生物制品研究所生产）pH7.2 PBS.打孔器（孔径3mm）及打孔模板微量加样器湿盒（容器内加湿纱布或泡沫塑料）已制备好的含有1%马抗人IgG 抗体的琼脂板1/50 稀释的单人份待检血清标本三、实验方法（一）标准曲线的制备：1．按照玻片的大小，准备制做琼脂板所需要的1%离子琼脂。

沉淀实验——双向琼脂扩散实验内容提要：利用双向琼脂扩散试验测定不同浓度的鸡传染性法氏囊病病毒抗原药物扩散速率，观察实验结果并且总结关键词：双向琼脂扩散试验琼脂凝胶配制制板打孔封底加样稀释抗原响因素引言：目的：掌握双向琼脂扩散试验的基本操作和临床应用。

实验原理：琼脂的疏散网状结构有利于大分子的自由迁移，合适比例的抗原抗体结合后聚集形成沉淀，沉淀的产生组织抗原抗体复合物的自由运动，沉淀带行程一种特异性的半渗透性屏障，阻滞相同抗原抗体复合物，而允许不同的分子通过。

实验仪器和药品：Nacl、蒸馏水、琼脂粉、电炉、平皿、硫柳汞、打孔器、电子秤、酒精灯、微量移液器、微量反应板、鸡传染性法氏囊病病毒琼脂扩散试验阳性血清（兽药生字（2007）150138086青岛易邦生物工程有限公司）、鸡传染性法氏囊病病毒琼脂扩散试验抗原（兽药生字（2007）150138086青岛易邦生物工程有限公司）。

实验内容及步骤：1.琼脂凝胶的配制：取8g Nacl溶解于100ml蒸馏水中，加优质琼脂粉1g，电炉缓慢加热使之彻底融化。

2.制板：将清洁的平皿置于水平桌面上，每个平皿分别倒入加热融化的1%琼脂约10ml，使其厚度大约为3mm，注意切勿产生气泡。

置于4℃保存（需保存较长时间时加入1%硫柳汞1ml）3.打孔：冷凝后打孔，打孔器内径约3mm。

按图1在固定的位置用打孔器垂直打孔，用7号针头挑去孔中琼脂。

4．封底：将琼脂平板置于酒精灯上微微加热，使孔底琼脂微融而封住孔底。

5．加样：用微量移液器在中央孔加入已知的诊断抗原，外周孔加入待检血清，图2。

置于37℃培养箱中反应24h，观察实验。

注：（加样至孔满为止，不可外溢。

待孔内液体渗入凝胶后即可放入温盒中。

温盒约37℃，一般保存24-48h，观察抗原抗体产生的沉淀线）稀释抗原：将①里接入80ul抗原，将②--⑤接入40ul生理盐水，用移液枪吸取40ul①溶液，移入②中，混匀，然后从②吸取40ul溶液移入③中，混匀，然后从③吸取40ul溶液移入④中，混匀，然后从④吸取40ul溶液移入⑤中，混匀，⑥放入生理盐水40ul。

双向琼脂扩散试验结果
双向琼脂扩散试验的结果根据实验情况可能会有所不同，以下是可能的结果：
1. 阳性结果：如果试验中观察到从试验点向外扩散的白色或透明区域，表示样品中存在可扩散物质。

这表明样品中存在抗原物质，可能是病原体或其他需要检测的物质。

2. 阴性结果：如果试验中观察不到任何扩散区域或只有样品溶液扩散，并且没有其他颜色的扩散区域出现，表示样品中没有可扩散的物质。

这表明样品中没有抗原物质存在。

需要注意的是，双向琼脂扩散试验仅能检测到可扩散的物质是否存在，但不能确定具体是哪种物质。

为了更准确地确定抗原物质，可以进行进一步的实验或使用其他检测方法。

单向双向琼脂扩散原理
单向琼脂扩散原理：指在两种不同物质所构成的液体界面上，分子从浓度较高的一侧沿着浓度梯度扩散到浓度较低的一侧，并在该界面上形成扩散层。

单向琼脂扩散可以用来纯化溶液中的蛋白质、多肽、核酸等大分子。

双向琼脂扩散原理：指在两种不同物质所构成的液体界面上，两种物质分子在相互作用下沿着浓度梯度双向扩散，从而形成扩散层。

双向琼脂扩散可以用于测定某些大分子在同一界面上基于层析之外的相互作用。