体外抗氧化实验方案

LI Jing, WANG Qian, LAN Yang, ZHANG Li-ming
( Department of Pharmacy, Ningxia Medical University, Ningxia Yinchuan 750004, China)
A bstract：The flavonoids of Viok yedoensis Makino were extracted by solvent extraction, the anti-oxidant activity of
第 45卷第21期 2017年 11月
广州化工
Guangzhou Chemical Industry
Vol. 4 5 No.21 Nov.2017
紫花地丁黄酮体外抗氧化实验
李 静 ，王 倩 ，兰 杨 ，张立明
( 宁 夏 医 科 大 学 药 学 院 ， 宁 夏 银 川 750004)
DPPH 摘 要 ：运用溶剂提取法提取紫花地丁黄酮类成分，采 用
(芋 ）循环水式真空栗，郑州中天实验仪器有限公司。 1.3试 剂
芦 丁 标 准 品 ，中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 所 ；A lC l3 . 6 H2O 、 9 5 % 乙醇（A R ) ，天津大茂试剂厂；无 水 乙 醇 （A R ) ，天津市大 茂化学试剂厂；石 油 醚 （60 ~ 9 0 益 ，A R ) ，天津市大茂化学试 剂 厂 ；石油醚(30 ~ 6 0 益 ，A R ) ，天 津 市 大 茂 化 学 试 剂 厂 ；乙 酸乙酯（A R ) ，天津市大茂化学试剂厂；正 己 烷 （A ，上 海 广 诺 化 学 科 技 有 限 公 司 ； 硫 酸 亚 铁 （A R ) ，天 津 市 大 茂 化 学 试 剂 厂 ；3 0 % 过 氧 化 氢 (A R ) ，上海广诺化学科技有限公司；D PP H ，东京化成工业株 式 会 社 ；抗 坏 血 酸 ， W O L S E N 公 司 。

PTIO自由基清除：一个新颖而简单的体外抗氧化分析法
李熙灿（广州中医药大学，2017.10）
目前的体外抗氧化分析方法有数个局限性，经常导致不一致的结果。

本研究通过使用PTIO自由基，建立了一种新的抗氧化实验。

经各种因素的调查后，实验方案的简述如下：在PTIO·和样品溶液中分别加入磷酸盐缓冲液（pH 7.4，50mM），分别在37°C 温育2小时，然后用分光光度法在557 nm处测定。

基于20个纯化合物和30个冻干水提物的结果表明，PTIO·清除有良好的线性关系，稳定性和重现性。

UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS分析提示，PTIO·遇到L-抗坏血酸时给出m/z 234。

因此, 作为一种抗氧化分析法，PTIO·清除具有四种优点:（1）以氧为中心的自由基为自由基模型；（2）以生理缓冲液为溶液；（3）测量简单且直接；（4）干扰小。

它不仅可以用于评价氧化活性，还可以用于构效关系的分析。

PTIO·清除过程，没有立体选择性，并且至少只涉及H +转移。

[参考文献]
Xican Li. 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl 3‑Oxide (PTIO•) Radical Scavenging: A New and Simple Antioxidant Assay in Vitro. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2017, 65, 6288−6297.。

【最新整理，下载后即可编辑】3.2.5 体外抗氧化实验发酵液的预处理：将摇瓶结束的发酵液装入无菌的10ml 离心管里，在天平上仔细平衡到10g ，在4℃，10000rpm ，离心10min ，小心转移上清液到新管子里标记备用。

（1）对超氧阴离子的清除作用 利用邻苯三酚自氧化体系测定样品对超氧阴离子的清除作用。

取50 mmol·L -1的Tris-HCI 缓冲液3 mL (pH=8.2，含有2 mmol·L -1的Na 2EDTA)，加入l mL 待检样品，于25℃保温10 min ，然后加入25 ℃预温的5 mmol·L -1的邻苯三酚0.3 mL(预先用10 mmol·L -1的盐酸配制)，精确反应4 min ，用0.5 mL 浓盐酸终止反应，测定其在320 nm 下的吸光度。

以10 mmol·L -1的盐酸作为空白调零，按如下公式计算清除率：()%100A A A -A ⨯-=对照样品空白样品对照清除率 (1)式中A 对照为未加待检样品的邻苯三酚反应体系的吸光度（用1mL 10 mmol·L -1的盐酸替代样品）；A 样品为加入待检样品后的邻苯三酚反应体系的吸光度；A 样品空白为加入待检样品后的无邻苯三酚的反应体系的吸光度（用0.3mL 10 mmol·L -1的盐酸替代邻苯三酚溶液）。

注意事项：1、 所用的两个比色皿杯子必须是石英的，上面会写着“Q ”,或“S ”，不得使用玻璃的，玻璃比色皿要么什么都不写，要么写着 “G ”。

2、 测定前要用100g 砝码和天平标定所用的移液枪插上枪头后是否精准，要求误差不超过5‰，不是5％。

3、 测定大量数据前，使用者先配制10g/L 的Vc ，做三个平行测定，精准度达到5%以内再开始正确的测定。

4、 测定时由于每个人有使用习惯和误差，中间不得换人换枪。

（2）对DPPH ·的清除作用DPPH·溶液的配制：准确称取47 mg DPPH·，用无水乙醇溶解并定容至100 mL ，避光保存(0～4℃)，使用时稀释至120 μmol·L -1。

体外抗氧化实验一、溶液配制pH 8.2的50 mmol/L Tris-HC1缓冲液100 ml；8 mol/L HCl，10mmol/L HCl 100 ml；25 mmol/L邻苯三酚溶液（用10 mmol/L HCl作为溶剂）25 ml；1 mg/ml 维生素C 100 ml（用10 mmol/L HCl作为溶剂）。

二、抗氧化实验1.取5.0 mL pH 8.2的50 mmol/L Tris-HC1缓冲液，4.6 mL蒸馏水，混匀，于25℃恒温水浴中保温20min，取出后立即加入在25℃预热过的25 mmol/L邻苯三酚溶液0.4 mL迅速摇匀后于25℃恒温水浴中反应5 min，加入8 mol/L HCl 1mL 终止反应，于波长320nm处测定吸光度Ac。

以蒸馏水作参比。

2. 取5.0 mL pH 8.2的50 mmol/L Tris-HC1缓冲液，3.6 mL蒸馏水，1 ml枇杷花提取物，混匀，于25℃恒温水浴中保温20min，取出后立即加入在25℃预热过的25 mmol/L邻苯三酚溶液0.4 mL，迅速摇匀后于25℃恒温水浴中反应5 min，加入8 mol/L HCl 1mL 终止反应，于波长320nm处测定吸光度As。

3. 取5.0 mL pH 8.2的50 mmol/L Tris-HC1缓冲液，2.6 mL蒸馏水，2 ml枇杷花提取物，混匀，于25℃恒温水浴中保温20min，取出后立即加入在25℃预热过的25 mmol/L邻苯三酚溶液0.4 mL，迅速摇匀后于25℃恒温水浴中反应5 min，加入8 mol/L HCl 1mL 终止反应，于波长320nm处测定吸光度As。

4. 取5.0 mL pH 8.2的50 mmol/L Tris-HC1缓冲液，1.6 mL蒸馏水，3 ml枇杷花提取物，混匀，于25℃恒温水浴中保温20min，取出后立即加入在25℃预热过的25 mmol/L邻苯三酚溶液0.4 mL，迅速摇匀后于25℃恒温水浴中反应5 min，加入8 mol/L HCl 1mL 终止反应，于波长320nm处测定吸光度As。

3.2.5 体外抗氧化实验发酵液的预处理：将摇瓶结束的发酵液装入无菌的10ml 离心管里，在天平上仔细平衡到10g ，在4℃，10000rpm ，离心10min ，小心转移上清液到新管子里标记备用。

（1）对超氧阴离子的清除作用利用邻苯三酚自氧化体系测定样品对超氧阴离子的清除作用。

取50 mmol·L -1的Tris -HCI 缓冲液3 mL (pH=8.2，含有2 mmol·L -1的Na 2EDTA)，加入l mL 待检样品，于25℃保温10 min ，然后加入25 ℃预温的5 mmol·L -1的邻苯三酚0.3 mL(预先用10 mmol·L -1的盐酸配制)，精确反应4 min ，用0.5 mL 浓盐酸终止反应，测定其在320 nm 下的吸光度。

以10 mmol·L -1的盐酸作为空白调零，按如下公式计算清除率：()%100A A A -A ⨯-=对照样品空白样品对照清除率 (1)式中A 对照为未加待检样品的邻苯三酚反应体系的吸光度（用1mL 10mmol·L -1的盐酸替代样品）；A 样品为加入待检样品后的邻苯三酚反应体系的吸光度；A 样品空白为加入待检样品后的无邻苯三酚的反应体系的吸光度（用0.3mL 10mmol·L -1的盐酸替代邻苯三酚溶液）。

注意事项：1、 所用的两个比色皿杯子必须是石英的，上面会写着“Q ”,或“S ”，不得使用玻璃的，玻璃比色皿要么什么都不写，要么写着 “G ”。

2、 测定前要用100g 砝码和天平标定所用的移液枪插上枪头后是否精准，要求误差不超过5‰，不是5％。

3、 测定大量数据前，使用者先配制10g/L 的Vc ，做三个平行测定，精准度达到5%以内再开始正确的测定。

4、测定时由于每个人有使用习惯和误差，中间不得换人换枪。

（2）对DPPH ·的清除作用DPPH·溶液的配制：准确称取47 mg DPPH·，用无水乙醇溶解并定容至100 mL ，避光保存(0～4℃)，使用时稀释至120 μmol·L -1。

多肽体外抗氧化——铁氰化钾还原法一．实验原理：样品（蝇蛆多肽提取物）将铁氰化钾（K3Fe(CN)6）还原成亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6)，亚铁氰化钾再与三氯化铁反应生成普鲁士蓝（亚铁氰化铁Fe4[Fe(CN)6]3），在700nm 测吸光度值，通过测定吸光度来判断受试物还原力的强弱。

铁氰化钾溶液为黄色，猜测用三氯乙酸（CCL3COOH ）与反应剩余的铁氰化钾生成沉淀，离心除去，排除对吸光度数值的影响。

二．试剂的配置V1=0.10005585L V2=0.10003205L三．实验步骤；1ml 样液+2.5ml,0.2mol/l磷酸缓冲液（ph6.6）+2.5ml,1%铁氰化钾2.5ml,10%TCA（三氯乙酸）取1ml 上清液+0.2ml,0.1%三氯化铁+1ml 蒸馏水室温反应10min后在700nm处测吸光度多肽的浓度分别为10,20,30,40,50mg/ml四。

结果与分析以质量浓度为横坐标，吸光度值做纵坐标画图，对多肽的总还原能力与VC的总还原能力进行比较。

From:猪皮胶原多肽的体外抗氧化特性研究注意：配置不同浓度的样品溶液梯度，依次加入一定量磷酸缓冲液（保证溶液反应的PH环境，如2.5ml pH=6.6）、一定量浓度的铁氰化钾溶液（2.5ml 1%），混合均匀，将该体系置于一定温度下（比如：50℃,不能过高，不然会使物质失活，适当加热可以保证反应程度和时间）恒温水浴放置一定时间（如20min，以反应充分为宜），取出加入三氯乙酸溶液混匀，置于离心机内3000转离心10min（离心机使用时一定保证对侧样品等重），取一定量上清液于另一试管中，加入蒸馏水和三氯化铁溶液（3K4Fe(CN)6 + 4FeCl3 →Fe4[Fe(CN)6]3 + 12KCl ，黄色晶体亚铁氰化钾放进三氯化铁的溶液中，产生颜色很鲜艳的蓝色沉淀，即普鲁士蓝，测定吸光度时要摇匀，且普鲁士蓝耐热性在140℃，光照下较稳定，不用避光），混匀后用分光光度计在700nm下测定溶液吸光度。

抗氧化能力的测定的实验报告实验报告：抗氧化能力的测定引言：抗氧化能力是指物质对抗氧化剂的抵抗能力，其重要性在于帮助人体抵御自由基的损害。

本实验旨在通过测定不同样品的抗氧化能力，评估其对人体健康的潜在益处。

材料与方法：1. 样品准备：从市场购买五种常见的食材作为实验样品，包括苹果、橙子、胡萝卜、菠菜和绿茶。

2. 样品提取：将每种食材分别切碎，并用乙醇提取其抗氧化物质。

将每种样品放入研钵中，加入适量的乙醇，搅拌均匀，然后用滤纸过滤提取液。

3. 抗氧化能力测定：采用DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼）自由基清除法测定样品的抗氧化能力。

将每种样品提取液和已知浓度的抗氧化剂（例如维生素C）混合，反应一段时间后，测定混合溶液的吸光度。

4. 对照组设置：同时设置维生素C的对照组，以验证实验方法的准确性。

5. 数据处理：计算每种样品的抗氧化能力，以吸光度测定值的降低程度表示。

使用统计学方法进行数据分析。

结果：根据实验数据统计与分析，不同样品的抗氧化能力有所差异。

其中，绿茶和菠菜表现出较高的抗氧化能力，吸光度的降低程度较大，显示出较强的自由基清除能力。

苹果、橙子和胡萝卜的抗氧化能力较低，吸光度的降低程度较小。

讨论：本实验结果表明，绿茶和菠菜具有较强的抗氧化能力，可能对人体健康具有积极的影响。

然而，需要进一步研究以验证这些食材中的具体抗氧化成分，并了解其作用机制。

此外，实验中使用的DPPH自由基清除法仅是众多测定方法之一，其他方法也可以用于评估样品的抗氧化能力。

结论：本实验通过测定不同样品的抗氧化能力，发现绿茶和菠菜具有较强的抗氧化能力，苹果、橙子和胡萝卜的抗氧化能力较低。

这些结果为人们选择健康食材提供了一定的参考依据，但仍需进一步研究来确认这些食材对人体健康的确切益处。

实验一超氧阴离子自由基清除能力的测定——抗氧化实验之一一、目的要求通过本实验掌握利用利用植物（或微生物发酵生产的原料）提取物进行超氧阴离子自由基清除能力测定的方法。

二、实验原理超氧阴离子自由基是生命活动代谢过程中产生的一种重要的自由基，超氧阴离子自由基具有很强的氧化能力，因此在抗氧化物性能的测定时，经常把清除超氧阴离子自由基作为其中一个重要的指标，产生超氧阴离子自由基的体系有多种，邻苯三酚自氧化法由于操作简单、反应灵敏等特点而被广泛采用。

邻苯三酚在碱性条件下迅速自氧化，在自氧化过程中会产生02﹣∙，02﹣∙能加速邻苯三酚自氧化速率，同时生成有色中间产物，中间产物的积累在滞后30s~45s 与时间呈良好的线性关系，一般维持4min左右，随后减慢.，有色产物在325nm 有强烈的光吸收，由于自氧化速率依赖于02﹣∙的浓度，清除02﹣∙就可以抑制自氧化反应，阻止中间产物的积累，从而达到清除超氧阴离子的目的。

三、器材及试剂（一）器材恒温水浴锅、控温电动搅拌器、电子天平、超滤器、电加热套、紫外分光光度计、旋转蒸发仪、超声波清洗仪等。

10ml比色管、秒表、比色皿、100ml容量瓶、温度计、微量取样器、移液管等。

（二）试剂邻苯三酚、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、HCl、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、抗坏血酸、BHT等。

（1）pH8.2的Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，25℃）：50ml 0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液与22.9ml 0.1mol/L盐酸混匀后，加水稀释至100ml。

（2）0.2mmol/L邻苯三酚溶液（邻苯三酚用0.05mol/L的盐酸配制）四、操作步骤（一）样品的测定（1）先将提取物用双蒸水配制成不同浓度梯度，在10mL的比色管中分别加入4mL（0.05mol/L）pH8.2的Tris-HCl缓冲液，置于25℃水浴中预热20min，然后加入25℃水浴中预热20min不同浓度样品液1mL，再加入在25℃水浴中预热20min的0.2mmol/L邻苯三酚溶液1mL（邻苯三酚用0.05mol/L的盐酸配制），混匀后在25℃水浴中反应4min，立即用浓HCl两滴终止反应，并在325nm处测定吸光度（A样）。

常见体外抗氧化实验方法(含原理、试剂配制、操作流程、实例分析、英文表述)- 2023-3①DPPH·自由基清除法 2 Array②ABTS·+自由基清除法 5③ FRAP法(铁还原法) 811④过氧自由基(超氧自由基，·O2-)清除法(连苯三酚自氧化法)⑤羟基自由基(·OH)清除法(脱氧核糖法) 14⑥PTIO·自由基清除法(水溶液中) 16⑦ CUPRAC法(铜还原法) 18⑧铁络合能力(Ferrozin法) 20⑨脂质过氧化清除法(亚油酸为底物) 23⑩抗氧化产物的预测26①DPPH·自由基清除法/DPPH法原理：DPPH·（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即α, α-二苯基-β-苦基肼基游离基，由于p-π共轭，所以，氮自由基能稳定存在[1]。

当DPPH自由基被某物质清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小；相应地，某物质自由基清除活性增加，其体外抗氧化活性也增加。

实验操作[1]:1.1 DPPH测试液的配置（适用于酶标仪测量，总体积为100μL）取DPPH 2毫克溶于约40mL溶剂（乙醇、95乙醇或甲醇）中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。

取DPPH溶液80μL加入到96孔板中，加95乙醇（或无水乙醇）20μL，稀释混合，测A值，使A＝0.20±0.01。

该DPPH溶液避光保存，4h内用完。

（注意：如果是用分光光度计．．．．．，则A＝0.6±0.02比较合适）1.2 样品液的配置样品用合适的溶剂溶解，为便于计算，可配成1mg/mL浓度。

溶剂根据样品的极性进行选择，首选95乙醇或无水乙醇，如不溶可用DMSO。

1.3 预试取DPPH溶液80μL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。

体外抗氧化实验操作步骤实验前准备：1.准备所需试剂和设备，包括各种化学试剂、实验室常规设备和仪器。

2.清洗实验器具，保持实验环境干净。

3.为各个试验条件设置对照组，以进行对比分析。

实验步骤：1.提取样品：根据实验要求，选择需要评估抗氧化作用的样品。

将样品加入适当的溶剂（如甲醇、乙醇等），用摇床搅拌混合，待溶解半小时左右，然后离心离心管，离心后取上层液体。

2.总抗氧化能力的评估（TAC）：2.1. 准备1.0mol/L的硫酸和5mmol/L的FeSO4溶液。

2.2. 将150μl的提取液加入试管中，加入1ml的硫酸和1ml的FeSO4溶液。

2.3.在37℃恒温水浴中孵育30分钟，形成有色沉淀。

2.4.将试管放入离心机中，离心5分钟，弃去上清液。

2.5. 加入5ml去离子水彻底洗涤沉淀，重复离心和弃去上清液。

2.6. 加入2ml去离子水悬浮沉淀，加入2ml的硫酸和0.2ml的蒸馏水。

2.7.读取吸光度，计算出抗氧化能力。

3.单电子转移能力的评估（SET）：3.1. 准备0.1mol/L的DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼）溶液。

3.2. 向试管中加入100μl的提取液和2ml的DPPH溶液。

3.3.避光孵育30分钟，观察颜色变化。

3.4.分光光度计读取吸收值，计算样品的单电子转移能力。

4.过氧化氢清除能力的评估（CAT）：4.1. 准备0.1mol/L过氧化氢溶液。

4.2. 加入100μl的提取液和2ml的过氧化氢溶液。

4.3.在室温下孵育10分钟，读取吸光度。

4.4.通过对照组计算样品的过氧化氢清除能力。

5.还原力的评估（FRAP）：5.1. 准备FRAP试剂：将3mmol/L的2,4,6-三（2-吡啶基）-1,3,5-三嗪酸和10mmol/L的FeCl3混合，配制成10mmol/L的FRAP试剂。

5.2.加入提取液和FRAP试剂，置于37℃恒温水浴中孵育。

5.3.在室温下读取吸光度，计算出还原力。

二．查阅文献以确定多肽浓度
1．多肽浓度与吸光度完全成直线关系的
①
②
③
④
2.多肽浓度与吸光度关系不是成直线的（有一点弧度的）
① 此试验浓度太小，担心结果出 不来
② 因 此实验浓度梯度太大，槲 皮素出现了抛物线式图形， 建议在设置我们的实验时浓 度梯度大点，可能有助于得 到结果
③Leabharlann 此实验浓度小，且子实体多肽变化不明显，即在0.3与0.2相同后有 出现上升
3.自认为有点靠谱的
综上所述，自认为多肽浓度暂时设置成0、1、2、4、8、20、40mg/ml 但pH 值对多肽总还原力的影响，酶与底物比对多肽总还原力的影响， 温度对多肽总还原力的影响。以及参考文献中多肽结构含量等与蝇蛆 多肽不一致等因素的影响，此浓度设置肯定存在不足。
三.试剂的配置
四.实验步骤
多肽体外抗氧化——铁氰化钾还原法 一．实验原理： 样品（蝇蛆多肽提取物）将铁氰化钾（K3Fe(CN)6）还 原成亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6)，亚铁氰化钾再与三氯化铁 反应生成普鲁士蓝（亚铁氰化铁Fe4[Fe(CN)6]3），在 700nm测吸光度值，通过测定吸光度来判断受试物还原 力的强弱。 铁氰化钾溶液为黄色，猜测用三氯乙酸（CCL3COOH） 与反应剩余的铁氰化钾生成沉淀，离心除去，排除对吸 光度数值的影响。
50不能过高不然会使物质失活适当加热可以保证反应程度和时间恒温水浴放置一定时间如20min以反应充分为宜取出加入三氯乙酸溶液混匀置于离心机内3000转离心10min离心机使用时一定保证对侧样品等重取一定量上清液于另一试管中加入蒸馏水和三氯化铁溶液3k4fecn64fecl3fe4fecn6312kcl黄色晶体亚铁氰化钾放进三氯化铁的溶液中产生颜色很鲜艳的蓝色沉淀即普鲁士蓝测定吸光度时要摇匀且普鲁士蓝耐热性在140光照下较稳定不用避光混匀后用分光光度计在700nm下测定溶液吸光度

一、DPPH自由基清除法[原理] DPPH（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical）即1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基。

分子中，由于存在多个吸电子的-NO2和苯环的大π键，所以，氮自由基能稳定存在。

N22当DPPH自由基被清除，其最大吸收波长519nm处的吸光度A值随之减小。

DPPH这种稳定的自由基为清除自由基活性的检测提供了一个理想而又简单的药理模型。

[实验步骤]1.1 DPPH测试液的配制 6.25ｘ10ˉ5M取DPPH 0.0246g溶于约100mL溶剂甲醇中，超声5min，充分振摇，务使上下各部分均匀。

取1mL 该DPPH溶液，在519nm处测A值，使A＝1.2-1.3之间最佳。

该DPPH溶液最好避光保存，3.5小时内用完。

1.2 样品液的配制Vc溶液（0.25mg/ml）称取Vc 0.01125g 溶于45mL乙醇溶液1.3 预试取DPPH溶液2mL，往其中加少量样品液，加样时，先少后多渐加，边加边混合，并观察溶液的褪色m情况，当溶液颜色基本褪去时，记下样品的加样量。

此加样量即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置5个用量，使之成等差数列。

【如】在预试过程中，发现加样到200μL时，DPPH溶液颜色基本褪去，则200μL为该样品液的最大用量。

其用量梯度宜设为40、80、120 、160、200μL。

浓度梯度mg/ml为0.0025、0.0050、0.0100、0.0200、0.0400μg/ml 2.5、5、10、20、401.4测量A0值的测量：取DPPH溶液2 mL加入到小试管（或玻璃瓶）中，加95甲醇1mL，充分混合，测A 值（517nm），此A值为A0（A0多在0.7-0.9之间）。

A值的测量：取DPPH溶液2mL加入到小试管（或玻璃瓶）中，加样品液xμL （x是根据1.3 预试结果确定样品液的用量），再加（1000 -x）μL 甲醇，混合，静置30分钟后，测A值（517nm）。

抗氧化能力的体外测定方法研究进展一、本文概述随着现代生活节奏的加快和环境污染的日益严重，人体面临的氧化应激压力不断增大，抗氧化能力的重要性日益凸显。

因此，抗氧化能力的体外测定方法研究进展成为了生物医学、营养学、食品科学等领域的研究热点。

本文旨在综述近年来抗氧化能力体外测定方法的研究进展，以期为相关领域的研究人员提供全面的信息参考和技术指导。

本文将首先对抗氧化能力的概念进行界定，明确其生理意义和重要性。

随后，将重点介绍几种常用的抗氧化能力体外测定方法，包括总抗氧化能力（TAC）测定、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定、过氧化氢酶（CAT）活性测定、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性测定等。

还将探讨这些方法的优缺点、适用范围以及在实际研究中的应用情况。

通过本文的综述，我们希望能够为相关领域的研究人员提供全面的抗氧化能力体外测定方法的知识体系和技术指导，为推动抗氧化能力研究的发展和应用提供有益的参考。

二、抗氧化能力的概念和机制抗氧化能力是指生物体系在面临氧化压力时，通过一系列复杂的生化反应来消除或抵抗活性氧（ROS）和活性氮（RNS）的能力。

这些活性物质是由正常细胞代谢或环境应激产生的，它们具有高度反应性，能够破坏细胞内的关键分子，如DNA、蛋白质和脂质，从而引发各种疾病，如癌症、心血管疾病和神经退行性疾病等。

抗氧化机制主要包括酶促和非酶促两大类。

酶促抗氧化系统包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等，它们能够催化ROS和RNS的分解，从而防止其对细胞的损害。

非酶促抗氧化系统则主要包括各种抗氧化剂，如维生素C、维生素E、谷胱甘肽、尿酸、胆红素等，它们可以直接与ROS和RNS反应，从而消除其活性。

近年来，对抗氧化能力的研究已经从简单的抗氧化剂筛选发展到了对抗氧化机制的深入研究。

研究者们开始关注抗氧化剂之间的协同作用，以及抗氧化剂与细胞信号通路之间的关系。

对抗氧化能力的评估方法也从单一的化学测定发展到了细胞模型和动物模型的评估，使得对抗氧化能力的理解更加全面和深入。

辣木果胚油的体外抗氧化活性研究
辣木果胚油由于其丰富的营养成分和生物活性物质已经引起了许多研究者的关注。

其中，其抗氧化活性被认为是其最突出的特点之一。

本文通过体外实验对辣木果胚油的抗氧化活性进行研究，旨在探讨其作为天然保健品的可能性。

实验方法：
1. 制备辣木果胚油溶液，浓度为2mg/ml。

2. 采用五种常用的体外抗氧化活性评价方法，包括DPPH自由基清除法、还原力能力法、抑制过氧化物形成法、铁离子还原能力法和总多酚含量测定法。

3. 分别测定辣木果胚油溶液的抗氧化活性，并与维生素C作为正对照组进行比较。

实验结果：
1. DPPH自由基清除法：辣木果胚油溶液对DPPH自由基的清除率为51.6%，而维生素C的清除率为56.3%。

2. 还原力能力法：辣木果胚油溶液的还原力比维生素C高出19.4%。

3. 抑制过氧化物形成法：辣木果胚油溶液的抑制过氧化物形成作用比维生素C高出22.2%。

5. 总多酚含量测定法：辣木果胚油的总多酚含量为27.2 mg/g，比维生素C高出3.4倍。

综合上述结果，辣木果胚油表现出了良好的抗氧化活性，并且在多个评价指标中均优于维生素C。

其中，DPPH自由基清除法和抑制过氧化物形成法的结果表明，辣木果胚油对脂质过氧化反应具有特别好的抑制作用。

而总多酚含量测定法的结果则提示辣木果胚油中的多酚类化合物，如儿茶素等，可能是其抗氧化活性的主要贡献成分。

结论：
以上结果表明，辣木果胚油具有出色的抗氧化活性，在未来可能成为一种天然的保健品，具有抗氧化应激、防癌、延缓衰老等多种功效。

但需要指出的是，本实验是在体外条件下进行的，真实的体内有效性还需进一步研究验证。

柿子醇提取物的体外抗氧化研究徐胜龙1，杨建雄1,2,*(1.陕西师范大学物理学与信息技术学院，陕西 西安 710062；2.陕西师范大学生命科学学院，陕西 西安 710062)摘 要：目的：研究柿子(甜柿)醇提取物(extracts of non-astringent persimmons，EP)体外抗氧化作用。

方法：用70%乙醇制备柿子提取物，并对其主要活性成分的含量进行测定；以B H T 、V C 、D -甘露醇为阳性对照，测定了E P 的总抗氧化活性、还原力、脂质过氧化以及清除D P P H 自由基、羟基自由基、超氧阴离子的能力。

结果：EP 的总糖、多酚及黄酮类含量分别为62.03%、0.33%、0.725%。

EP 具有较好的总抗氧化活性和总还原性，能抑制脂质过氧化和清除自由基。

其对DPPH 自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基、脂质过氧化的IC 50分别为0.8、4.1、2.1、4.2mg/ml。

结论：EP 具有明显的抗氧化活性。

关键词：柿子；抗氧化活性；清除自由基；体外In vitro Antioxidant Properties of Extract of Non-astringent PersimmonsXU Sheng-long 1，YANG Jian-xiong 1,2,*(1.College of Physics and Information Technology, Shaanxi Normal University, Xi'an 710062, China；2.College of Life Sciences, Shaanxi Normal University, Xi'an 710062, China)Abstract ：Objective ：To study the antioxidant properties of extract of non-astringent persimmons(Diospyos kaki )(EP) in vitro .Method: The extract of non-astringent persimmons were preparated by 70 % alcoholic refluence. The content of the active components of EP was mensurated. The antioxidant activity of the EP has been analyzed by using different assays, such as total antioxidant activity, reducing power, hydroxyl radical scavenging assay, superoxide radical scavenging assay, DPPH radical scavenging assay and lipid peroxidation assay. Antioxidant activities of BHT, VC, and D-mannitol were as a positive control.Result: The contents of total saccharides, total phenolic, and total flavonoid in EP were 62.03 %, 0.33 %, 0.725 %, respectively.EP was proved with total antioxidant activity in evidence, effective reducing power, inhibition of lipid peoxidation and free radical, scavenging activity. The IC 50values of inhibition for DPPH radical, hydroxyl radical, superoxide anion radical and lipid peroxidation assay were 0.8, 4.1, 2.1 and 4.2 mg/ml, respectively. Conclusion: EP has obvious antioxidant activities in vitro .Key words ：persimmons ；antioxidant ；free radical scavenging ；in vitro 中图分类号：R151.2 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2008)04-0131-04收稿日期：2007-04-29基金项目：国家自然科学基金资助项目(20175012)作者简介：徐胜龙(1981-)，男，硕士研究生，研究方向为膜与细胞生物物理。

辣木果胚油的体外抗氧化活性研究1. 引言1.1 研究背景随着人们生活水平的提高和环境污染的加剧，自由基对人体健康的危害越来越受到关注。

自由基是一种带有未成对电子的分子或原子，其对细胞膜、蛋白质、核酸等重要生物分子造成氧化损伤，导致机体老化和各种疾病的发生。

抗氧化剂的研究变得尤为重要。

本研究旨在通过体外实验方法评价辣木果胚油的抗氧化活性，探讨其在抗氧化领域的开发利用潜力，为辣木果胚油的进一步应用提供参考依据。

希望通过本研究能够为推动天然植物油在保健食品和药物领域的开发提供有力支持。

1.2 研究目的研究目的是探究辣木果胚油的体外抗氧化活性，明确其在抗氧化领域的应用潜力。

具体目的包括：1. 确定辣木果胚油的提取方法，以获得高质量的提取物；2. 使用合适的体外抗氧化活性评价方法，检测辣木果胚油的抗氧化性能；3. 分析辣木果胚油在不同实验条件下的抗氧化活性变化，探讨其影响因素；4. 将辣木果胚油的抗氧化活性与其他常用植物油进行比较，揭示其在抗氧化领域的优势；5. 最终目的是为未来进一步开发利用辣木果胚油提供科学依据和实践指导，推动其在医药、保健品、食品等领域的应用，为人类健康和生活质量提供技术支撑。

通过本研究，旨在全面了解辣木果胚油的抗氧化特性，发掘其抗氧化活性及应用潜力，为辣木果胚油的开发和利用提供科学依据和理论支持。

2. 正文2.1 辣木果胚油的提取方法提取方法是研究中的重要环节，直接影响到辣木果胚油的质量和产量。

目前常用的提取方法包括溶剂浸提法、超临界流体萃取法和机械压榨法等。

溶剂浸提法是目前应用较广泛的提取方法之一。

通常使用的溶剂包括乙醇、正己烷等。

首先将辣木果胚油与溶剂进行混合，然后通过浸提、过滤、蒸发溶剂等步骤来提取油脂。

这种方法提取效率高，但存在着残留溶剂的问题。

超临界流体萃取法是一种无溶剂的提取方法，利用超临界流体（如二氧化碳）对辣木果胚油进行萃取。

该方法操作简便，提取速度快，且不会使植物油脂受到高温或化学溶剂的污染。

1还原力的测定样品2ml加到2ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.6）和2ml 1%的铁氰化钾溶液的混合液中。

混合物在50℃保温20min，然后在反应混合物中加入2ml 10%的TCA，混合后以3000rpm 离心10min，取上清液2ml与2ml蒸馏水以及0.4ml 0.1%氯化铁在反应试管中反应，10min 后测定其在700nm处的吸光值。

吸光值越大表明还原力越强。

注意：建议蛋白浓度以5mg/ml左右变化，例如2.5，5之类变化。

但具体情况应根据吸光值大小而定。

0.2mol/L pH6.6的磷酸盐缓冲液的配制见附表。

铁氰化钾溶液应盛装在棕色瓶中。

比色皿的用法：可见光(>400nm)用玻璃比色皿（即没有标字母或者标G的比色皿），紫外光时（<400nm）用石英比色皿（即标Q字比色皿）。

2 DPPH自由基清除活性的测定将1.5ml样品液添加到1.5ml含0.1 mmol/L DPPH的95％乙醇中，混合，振荡，在室温下放置30min，然后在波长517nm处检测（Ai）。

清除率计算公式为：空白为1.5 ml 95%的乙醇加入1.5 ml蒸馏水调零。

式中：Ac——对照为1.5 ml DPPH溶液加上1.5 ml蒸馏水在517nm处的吸光值；Aj——1.5ml样品液加上1.5 ml 95%的乙醇在517nm处的吸光值；Ai——1.5ml样品液加上1.5 ml DPPH溶液在517nm处的吸光值；注意：建议酶解液蛋白浓度以2mg/ml 左右变化，如0.5,1,2,2.5之类变化，但是具体情况应视清除率而定，最终结果应有清除率大于50%和小于50%的情况。

DPPH样品有毒，需戴口罩和手套进行操作。

而且DPPH试剂很昂贵，用时注意节约。

0.1m mol/L DPPH 乙醇溶液的配制：准确称取0.00395gDPPH，用95%的乙醇溶液溶解并定容到100ml。

3 在卵黄磷脂体系中抗氧化能力的测定以卵黄脂蛋白为底物的LPO模型反应体系包括:体积比为1:25稀释的卵黄悬液(卵黄用等体积的pH7.45，0.lmol/LPBS配成，使用前磁力搅拌10min)0.2 mL、一定浓度的样品溶液0.lmL、25m moll/LFeSO4溶液0.2mL，用PBS缓冲液补足至2.0mL。