冷球蛋白血症的肾脏损害陈樱花综述胡伟新审校冷球蛋白是一种含有类风湿因子（RF）和单克隆或多克隆的免疫球蛋白，由B淋巴细胞增殖所致，在低温时沉淀的免疫复合物，冷球蛋白血症是由于冷球蛋白沉积于血管内皮，导致皮肤、肾脏、周围神经等病变，产生皮肤血管炎、肾小球肾炎和神经系统症状等主要累及中小动脉的系统性血管炎。
冷球蛋白血症导致的肾脏损害常见的是膜增生性肾小球肾炎（MPGN）［1］.多种疾病如淋巴组织增生性疾病、感染和自身免疫疾病等可以出现冷球蛋白血症，丙型肝炎病毒（HCV）感染是导致混合性冷球蛋白血症（mixed cryoglobulinemia,MC）的常见原因，既往对HCV感染相关的MC主要是清除病毒血症，近年的研究表明针对B细胞的治疗也是有效手段之一。
尽管HCV感染导致冷球蛋白形成和肾脏损害的机制仍然不明确，但近年来的研究有了长足的进步，本文着重综述HCV感染相关冷球蛋白血症及其肾脏损害的发生机制及治疗的研究进展。
冷球蛋白的性质及分类冷球蛋白是在低温（0~4℃）沉淀，复温至37℃时再溶解的免疫球蛋白或免疫复合物，检测时在37℃取20ml血样在4℃低温放置7d，通过冷沉比容方法测定离心沉淀物量，通过免疫固定电泳分型，根据免疫化学成分冷球蛋白分为三型：Ⅰ型是单克隆冷球蛋白，Ⅱ型和Ⅲ型是混合性冷球蛋白（表1）.血清中Ⅰ型和Ⅱ型冷球蛋白的含量高，常大于5mg∕ml, Ⅲ型冷球蛋白的含量较低，常小于1mg∕ml.应用敏感的免疫印迹或聚丙烯酰胺凝胶电泳法，可以检测出部分Ⅱ型冷球蛋白含有特殊的寡克隆IgM或多克隆和单克隆混合IgM［2］，称为Ⅰ-Ⅲ型混合性冷球蛋白，为Ⅲ型与Ⅱ型冷球蛋白的中间状态。
MC患者的肝脏和骨髓中增殖的寡克隆B细胞中可检测出这型冷球蛋白［2］。
其中2∕3的Ⅱ型或Ⅱ-Ⅲ或MC的RF为单克隆IgM-RF。
小鼠的冷球蛋白主要是IgC3型［3］，部分原因是由于可变区存在阳离子残基，IgC3的清除，抑制其产生冷沉淀［4、5］.虽然人类Ⅰ型冷球蛋白血症和HCV相关MC也以IgC3型占相对优势［6］，但影响人类冷球蛋白形成的结构特征仍不清楚。
表1冷球蛋白血症的分类及病因类型组成发病率病因Ⅰ型单克隆IgG、IgA,IgM 10%~15% 多发性骨髓瘤、华氏巨球白血病（慢淋）、非何杰金淋巴瘤等淋巴增生性疾病Ⅱ型单克隆IgM-RF （或IgG,IgA） 50%~60% 感染（主要是HCV感染），与多克隆Ig（主要是IgG）结合自身免疫或淋巴增生性疾病（混合性）(或IgC、IgA) ，“原发性”少见Ⅱ-Ⅲ型寡克隆IgM-RF或多克隆（混合性）和单克隆混合的IgMⅢ型多克隆Ig与多克隆Ig-RF 30%~40% 感染（主要是HCV感染）（混合性）（主要是IgM）结合自身免疫性疾病多见，“原发性”少见冷球蛋白血症的病因及发生机制冷球蛋白血症主要见于三类疾病（表1）：（1）肿瘤，如多发性骨髓瘤，华氏巨球蛋白血症、慢性淋巴细胞白血病、非何杰金淋巴瘤，产生单克隆冷球蛋白：（2）自身免疫性疾病：如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、干澡综合征和其它自身免疫性疾病：（3）包括病毒（如HBV、HCV 、EB病毒，柯萨奇B病毒和HIV）、细菌（如链球菌、梅毒螺旋体、结核分枝杆菌）和寄生虫（如克氏锥虫、疟原虫）［7、8］，以HCV感染多见，大多数感染产生是一过性的RF，可以促进免疫复合物的清除和抗原的呈递。
HCV感染、HCV相关肾损害与冷球蛋白血症MC与HCV感染密切相关，流行病学研究证实，20%~56%的HCV感染者存在Ⅱ型冷球蛋白血症，约86%的意大利冷球蛋白血症患者体内可检测出HCV-RNA。
影响HCV感染者产生冷球蛋白血症的因素包括地理位置［9］（欧洲南部60%的HCV感染者存在冷球蛋白血症），病程（冷球蛋白血症是HCV感染的后期表现。
其感染HCV的病程是不伴冷球蛋白血症的2倍）、肝病严重程度（MC者进展至肝硬化的风险是不伴冷球蛋白血症的4.87倍）和冷球蛋白的检测方法。
在HCV和HBV感染较低的地区，非HCV或HBV相关的Ⅱ型冷球蛋白血症（即“原发性”冷球蛋白血症）相对多见［10］.HCV相对肾脏损害最常见的是伴MC的MPGN，占80%，其次是不冷球蛋白血症的MPGN。
70%~90%伴Ⅱ型MC的NPGN存在HCV感染。
约10%~27%冷球蛋白血症者有肾脏损害的临床症状［11］，但近来的研究提示HCV相关肾级织有免疫复合物沉积或肾小球肾炎无临床症状的更多，HCV相关肝衰竭患者接受肝移植同时肾活检发现，25%~30%患者虽然临床无症状，但存在免疫复合物介导的肾小球肾炎，最常见的病理类型是MPGN［12］.日本也曾报道在188例HCV肝硬化尸检者中发现54.8%存在肾小球内免疫复合物沉积，但死前仅12.2%有肾小球肾炎的临床症状。
HCV感染冷球蛋白血症产生的机制 HCV相关的MC的形成经历三个重要的阶段：（1）慢性HCV感染;(2)B淋巴细胞克隆增殖：（3）免疫复合物介导的血管炎，慢性HCV感染通过多种病毒蛋白与B淋巴细胞表面抗体结合持续刺激，导致B淋巴细胞的克隆增殖，产生IgM-RF 是形成MC的关键。
RF产生的固有性免疫（innate immunity）模型最近建立的RF产生的固有性免疫小鼠模型见图1.固有性免疫既产生抗体形成免疫复合物或冷球蛋白沉积，又促进沉积局部的炎症反应。
Toll样受体（Toll like receptors ,TLRs）是固有性免疫受体家族中和重要成员，具有诱导免疫应答和调节炎症反应的作用，在感染和自身免疫疾病时，B细胞与包含外源性（如HCV）或内源性（如染色质或RNA）核苷酸的IgG抗原免疫复合物结合，在表面IgM、TLR9和下游衔接TLRS的信号分子如骨髓分化因子88参与下，这些免疫复合物刺激B细胞抗原受体和TLRs,促进浆细胞增殖分化产生RF［13、14］.研究显示，糖基化终末产物的受体可与TLR9协同识别坏死细胞释放的高迁移率族（high mobility group box ）染色体蛋白1-DNA复合物［15］.在感染时，IgG免疫复合物包含有微生物核苷酸，其已在HCV 感染中得到证实，在热杀灭细菌超免疫的兔模型证实微生物能诱导RF产生［16］.因此，在感染和自身免疫疾病过程中产生的某些抗原包含内源性或外源性（如病毒）核苷酸，或其它TLRs激动剂的免疫复合物，促进自体反应B细胞增殖［13、14、17］，产生RF和冷球蛋白血症，但仍需进一步的研究明确固有性免疫在RF产生和冷球蛋白血症发病机制中的作用，及针对这类疾病治疗的新靶点和措施。
HCV为TLLs激动剂，HCV是单链RNA病毒，其一个基因组可能是TLR7或TLR8的配体，TLR7多态性与进展性肝纤维化和慢性HCV感染有关已被证实，提示TLR7是人类对HCV感染的固有性免疫反应的成分［19］.除了TLR7外，HCV核心和NS3蛋白可通过TLR2激活巨噬细胞［20］因此，在人类HCV慢性持续性感染过程中，通过协同刺激抗原受体和TLRs，包含HCV的免疫复合物可以促进RF产生.HCV活化B细胞产生RF HCV感染肝细胞表达CD81，包膜蛋白E2可与CD81相互作用，CD81A也表达于B淋巴细胞，F2-CD81相互作用促进淋巴细胞增殖［21］.除了与CD81结合外，HCVE2蛋白也是抗体应答反应的靶点。
有研究显示，HCVE2蛋白并发淋巴瘤的患者产生的单克隆免疫球蛋白可与E2结合，提示E2蛋白可能也刺激B细胞抗原受体［22］，某些HCV感染并发非Hodgkin淋巴瘤患者样，抗HCV-NS3抗体也被证实具有RF活性［23］，因此持续HCV感染可通过抗原受体，CD81刺激B淋巴细胞增殖和分化，促进RF产生。
冷球蛋白血症性肾小球肾炎冷球蛋白血症肾脏损害的临床表现及病理特征Ⅱ型冷球蛋白血症并发肾脏损害者多见，约1∕3的冷球蛋白血症并发肾脏损害（表2）肾脏损害的临床表现多样，可表现为尿检异常，肾病范围的蛋白尿（约20%）、镜下血尿或肉眼血尿，20%~30%的患者伴有不同程度的肾功能减退，甚至表现为急进性肾炎综合征，约半数的患者会出现较严重的高血压，病理改变以Ⅰ型膜增生性病变最常见，MC典型的肾脏组织学特征为肾小球毛细血管袢内见冷球蛋白组成的“栓子”，常伴单核细胞和中性粒细胞浸润，内皮下见大量沉积物，可占据整个肾小球毛细血管袢，HE染色时为嗜伊红性，PAS呈阳性，Masson三色染色为红色，非嗜银，刚果红染色阴性［24］.约30%可伴中小动脉病变，包括坏死性血管炎。
内皮下沉积物等，免疫荧光可见肾小球毛贼细血管袢沉积物的成分与冷球蛋白的组成相一致，通常是IgM、IgG,可伴补体C3、C4、C1q及纤维素，IgM较少沉积于肾小球毛细血管袢，且IgM常伴k轻链的沉积，电镜观观察内皮下可见大量电子致密物，有时凸向管腔，形成毛细血管袢腔内栓子，常呈直径约30nm的管状结构，或呈束状曲线样，横切面则呈轮状改变，毛细血管内出现含有大吞噬性溶酶体的单核细胞。
冷球蛋白血症是一种系统性小血管炎，常合并肾外多系统的损害，典型的三联症为皮肤紫癜，乏力，关节炎，还可导致慢性肝损害，周围神经病变、间质性肺炎，内分泌紊乱和弥漫性血管炎，淋巴组织和肝组织的恶性肿瘤少见，对250例MC的临床特征分析见表2［2］.实验室检查可以现HCV抗体、HCV-RNA阴性，约70%的患者谷丙转氨酶升高，16%~70%的RF阳性，血清补体C4、C1q明显降低，或伴有C3下降及冷球蛋白不同水平的升高，冷球蛋白血症患者的预后差，肾脏损害是冷球蛋白血症严重的并发症，约10%的患者最终需透析治疗，但影响预后的主要是心血管疾病和感染［25、26］，约29%~62%的患者死于心血管事件，其次是感染（10%~21%）、肝功能衰竭（19%）、肿瘤（3%）表2 混合性冷球蛋白血症的临床特征临床特征发生率皮肤紫癜 98%乏力 98%关节痛 91%周围神经病变 81%肝脏损害 73%雷诺现象 32%干燥综合征 51%肾脏损害 31%非何杰金B细胞淋巴瘤 11%非侵蚀性关节炎 8%肝细胞癌 3%Ⅱ/Ⅲ冷球蛋白血症 2/1补体C3（mg/dl）（参考值60~130 mg/dl） 93±30补体C3（mg/dl）（参考值20~55 mg/dl） 10±12抗核抗体 30%抗线粒体抗体 9%抗平滑肌抗体 18%HCV-Ab或HCV-RNA 92%HBsb 32%HBsb 1%冷球蛋白血症性肾脏损害的机制TLRs的作用，固有性免疫的激活促进肾脏损伤的进展，TLRs其中具有重要的作用，包含RF、免疫球蛋白，抗原、TLRs激动剂和补体复合物的冷球蛋白可促进沉积部位的炎症反应［27］.白细胞和肾内固有细胞通过受体识别这些成分，从而影响冷球蛋白血症性肾脏损害的进展，TLRs表达于免疫细胞及部分非免疫细胞，识别病原体，诱导免疫应答，TLR3表达人类树突状细胞，成纤维细胞和间质上皮细胞，发挥抗病毒的固有性免疫作用，TLR3还表达于非免疫器官包括肾组织细胞，尤其是系膜细胞，生理情况下，TLR3在清除肾小球系膜区的病毒RNA具有重要的作用，最近一项研究显示，HCV相关肾小球肾炎患者的肾小球系膜细胞表达TLR3增加，提示包含病毒RNA的免疫复合物可激活系膜细胞表达TLR3，促进肾小球炎症反应，导致系膜细胞凋亡［28］.在冷球蛋白血症性肾小球肾炎小鼠模型，肾小球表达的TLR4及其内源性配体，纤维连接蛋白均上凋，形成内部正反馈，放大炎症反应［29］.基于冷球蛋白血症性MPGN、TLR4表达水平上调，对胸腺间质淋巴细胞生成素（thymic stromal lymphopoietin ,TSLP）转基因小鼠模型的研究显示足细胞也表达TLR4进一步体外培养显示足细胞表达TLR4上调，募集和活化单核白细胞，释放细胞因子，这可能在冷球蛋白血症性MPGN特征性的肾小球损伤起重要作用。
