玻璃化、褐化现象的防治技术

褐化原因及防止措施褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡的现象。

在组织培养中，褐变是普遍存在的，这种现象与菌类污染和玻璃化并称为植物组织培养的三大难题。

而控制褐变比控制污染和玻璃化更加困难。

因此，能否有效地控制褐变是某些植物能否组培成功的关键。

(一)褐变的原因影响褐变的因素极其复杂，随着植物种类、基因型、外植体的部位及生理状况等的不同，褐变的程度也有所不同。

1.与基因型有关不同植物与品种之间褐变现象是不同的，有人把此归结为基因型的不同。

一般来说植物材料中单宁类和多种羟酚类化合物的含量高，易引起外植体材料的严重褐化。

多数木本植物比草本植物易引起褐化，多年生草本植物比一年生草本植物易引起褐化。

2.与取样外植体的年龄有关通常幼龄部位产生褐化较轻，随着组织的老龄化含醌类物质增多而褐化加重。

因此，在外植体接种时常需要剥去鳞片和大叶片，尤其是以切取幼嫩的芽尖或切取顶芽分生组织(或带少量叶原基)接种更为理想。

3.与外植体取材时间有关一般在春夏季，尤其是春季采取生长旺盛的外植体产生褐化较轻，已木栓化或木质化的枝条和处于休眠状态的芽作为外植体时褐化严重。

即分生部位接种后形成醌类物质少，而分化的部位则形成醌类物质较多。

4.与培养基有关过高的无机盐浓度会引起棕榈科植物外植体酚的氧化，低盐培养基，尤其是Mn2+和 Cu2+离子浓度较低时，外植体的褐化程度较轻。

例如油棕用MS无机盐培养容易引起外植体的褐变，而用降低了无机盐浓度的改良MS培养基时则可减轻褐变，而且获得愈伤组织和胚状体。

植物生长调节物质使用不当时，材料也容易褐变，细胞分裂素BA有刺激多酚氧化酶活性提高的作用，这一现象在甘蔗的组织培养中十分明显。

培养基的PH值较低时常有利于减轻外植体的褐化。

植物组织培养中的褐变现象及其防止措施摘要：细胞受损后，由于细胞区隔作用被破坏，毒性酚类或其氧化物醌类物质毒害细胞，导致组织褐变，植物组织培养过程中培养低效或失败。

目前认为组织培养中褐变程度主要受外植体材料的基因型、生理状态、种类、大小、预处理、培养条件、培养基及培养方式的影响。

在目前的研究中控制褐变的有效方法主要有低温培养、暗培养、勤转种、添加抗氧化剂、增效剂或吸附剂于培养基中等。

关键词:植物;组织培养;褐变;防治方法褐变是植物组织培养中一种普遍存在的现象，是由于组织中多酚氧化酶被激活，使细胞酚类物质被氧化而产生棕褐色醌类物质，这种褐变现象又被称为酚污染。

多酚类物质及其氧化物醌类物质会抑制其它酶的活性，从而毒害整个外植体，严重影响外植体的脱分化、再分化和生长。

褐变这种现象与菌类污染和过度含水化(即玻璃化)并称植物组织培养的3 大难题。

目前褐变已成为植物组织培养发展的一大障碍[1]。

1 褐变现象的原因1.1 非酶促褐变非酶促褐变是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响所造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡，即坏死形成的褐变现象，并不涉及酚类物质的产生。

诸多不利条件都可以造成细胞的程序化死亡，但这种褐变若采取适当措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生。

1.2 酶促褐变多数认为，植物组织培养中的褐化现象主要是由酶促褐变引起的，即由多酚氧化酶( P PO ，Polyphenol Oxidase) 作用于天然底物酚类物质而引起的。

在正常条件下,细胞中的酚和醌之间保持一种动态平衡,醌类物质水平较低;而酚氧化酶及其底物分布在正常组织的不同部位，酚类物质分布在细胞的液泡内，酶则分布在各种质体或细胞质内，这种区域性分布致使底物与酶被质膜分隔开来；但当外植体或培养材料处于机械损伤等逆境，或细胞受伤或衰老时，细胞膜结构或细胞中物质区域化分布的破坏会导致酚氧化酶释放或合成，如果此时在合适的pH 和温度等条件下，酚氧化酶、酚类（底物）和氧发生酶促氧化反应，形成有毒的棕褐色醌类物质,从而使组织发生褐变。

组培苗在培养过程中常见问题分析一、植物褐化A、原因可能有：1、植物本身含有较多的酚类物质，在切割外植体时，从伤口渗透出来，直接渗入培养基中，或在继代培养时不断形成并渗出。

2、（1）外植体的取材部位及季节（2）培养基成分，浓度过高的无机盐和高浓度6-BA、KT 等容易加重褐化。

（3）培养条件不当，温度过高培养时间过长、光照过强，均可以提高多酚氧化酶的活性。

B、防止措施：1、选择合适的外植体：选取幼龄材料，选合适部位，时间一般在初冬或初春2、暗培养或勤转瓶3、弱光培养、低温培养4、添加活性炭或抗氧化剂等5、可以降低无机盐含量，由全量降为半量，减少铵态氮的含量。

二、玻璃化现象A、原因可能有：1、培养温度高2、生长素种类及其配制比例不合适。

铵态氮及碳源对某些植物培养不适宜。

B、防止措施：1、降低培养瓶内的湿度，增加琼脂量，每瓶接种量减少三分之一2、降低培养温度3、增加光照4、降低培养温度5、降低培养基中细胞分裂素含量，可以考虑加入适量脱落酸。

也可以降低或去除铵态氮。

6、在培养基中加入1.0~5.0g/L活性炭。

三、黄化现象A、原因可能有：1、培养基中铁元素含量不足，激素配比不当，糖用量不足。

2、培养瓶温度不适，光照不足。

3、pH值有问题。

（培养基配置不正确）B、防止措施：1、检查培养基配置过程，保证培养基成分正确添加2、调节培养基的成分和pH值3、控制培养室温度，增加光照，用透气盖改善瓶内通气情况四、污染现象A、原因可能有：1、原瓶苗有污染2、接种工具灭菌不彻底3、操作时认为带入菌4、接种环境不干净5、原瓶苗细菌性污染（浑浊水渍状、或泡沫发酵状）常由于灭菌锅未排尽冷空气、灭菌锅压力温度不够，计时不准确造成。

6、原瓶苗真菌性污染（出现各种颜色的孢子），可能是由于空气、瓶口及瓶盖真菌孢子引起。

B、防止措施：1、正确使用灭菌锅2、接种工具每次使用完后要消毒灭菌，接种时，手不要碰盘子的任何地方，用镊子夹盘子。

3、污染的原瓶苗要及时淘汰，如果原瓶苗数量少要进行灭菌4、接种时，要保证接种环境的干净卫生，台内工具不宜放太多。

植物组织培养的三大难题及解决方法摘要：植物组织培养是以细胞全能性为理论基础建立的一种离体培养技术，阐述了植物组织培养快繁中褐变、玻璃化、污染和移栽成活率低等问题出现的原因，提出预防和控制措施。

关键词：植物组织培养；污染；玻璃化；褐化中图分类号：q813.1+2 文献标识码：a 文章编号：1674-0432（2012）-11-0142-2植物组织培养是利用植物体的一部分进行无性繁殖，而产生大量同源母本基因幼苗的生物技术。

植物的组织培养到如今以和农业、园艺、林业、医药等多个方面有了密不可分的关系，为其提供了理论基础和研究方法。

利用自然条件在获得珍稀植物和经济价值较高的植物时，由于受地域及季节的限制，很难达到高效、快速的目的。

通过组织培养这一技术手段则能满足这一要求。

组织培养在挽救珍稀植物、创造新物种等方面做出了重要的贡献[1]。

但是在植物的组培技术上面临的三个难题却经常困扰大家。

它们分别是污染，植物玻璃化和植物褐化。

1 污染污染是在组培过程中所面临的首要难题，该问题经常遇到并且难以解决。

不能把污染率降低到可行的范围内植物组培就很难进行下去，这是该问题所要面对的第一个难题。

在进行植物的组织培养时，通常存在两种污染方式：一种是外植体消毒不彻底以及无菌操作过程中引起的污染；另一种是引起内源菌污染的主要原因的真菌和细菌[2]。

大多数的研究结果表明引起污染的主要原因为外植体的生长状况、环境条件和操作过程[3]。

外植体污染是最难解决的污染之一。

污染来源主要为外植体处理不当或培养基的灭菌不彻底，或对接种工具的消毒不够，或操作人员的操作不慎，或环境不洁等所致。

选取外植体的原则是污染少易启动[4-5]。

选择有最大分化潜能的外植体是确保组织培养成功的关键[6]。

常规试验一般选用0.1%hgcl2溶液浸泡，再用无菌水对外植体进行反复冲洗，灭菌效果最好且污染率低。

胡重怡等在烟草无菌苗培养前种子消毒技术的研究中使用先用70%c2h5oh溶液进行消毒，再用30%h2o2的浸泡，再用无菌水反复冲洗外植体，所得烟草种子污染率底[7]，h2o2分解后生成有杀菌作用的氧气而成为无毒害的化合物[8-9]对外植体的损害小。

蓝莓组织培养中污染褐变玻璃化的防止措施作者：于永梅王冰余海英来源：《现代农业科技》2018年第10期摘要在蓝莓组培过程中很容易产生污染、褐变、玻璃化等现象，这些都直接限制了蓝莓规模化生产。

本文总结了蓝莓组织培养过程中污染、褐变、玻璃化现象的主要防止措施，以期为蓝莓组织培养提供参考。

关键词蓝莓；组织培养；污染；褐变；玻璃化；防止措施中图分类号 S633.9 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）10-0105-02蓝莓为多年生小灌木树种，春季早花，夏季果熟，入秋叶呈红色，观赏效果极佳，可作为观光果园栽培树种，也可制作盆景；其果实中含有花青素、黄酮等多种多酚类生理活性成分，具有明目、防止脑神经衰老、抗癌、抗氧化等多种生理活性功能，越来越受到消费者的青睐，经济价值较高，市场潜力巨大，开发前景广阔。

蓝莓组培育苗技术的研究，采用蓝莓组培快繁技术，短期内获得大量的无病毒苗木。

探讨蓝莓苗木的工厂化技术育苗体系，有助于我国蓝莓产业化发展，满足社会需求[1-2]。

但在蓝莓组培过程中，很容易产生污染、褐变、玻璃化等现象，限制了蓝莓的组培快繁和大规模生产，是目前急需解决的关键问题。

笔者总结了蓝莓组织培养繁育中常出现的污染、褐变、玻璃化的防止措施，对蓝莓苗木的快速繁殖和推广具有重要意义。

1 污染1.1 操作人员注意卫生首先要注意工作人员卫生，工作人员进入无菌室不能吃东西、吸烟等，应常剪指甲。

工作服要每周清洗消毒1次，夏季要每3 d清洗消毒1次，工作服灭菌后在缓冲室更换；一次性用品要及时更换，口罩、帽子要经常清洗。

进入无菌室前要用肥皂洗手，进入培养室后再用75%酒精对双手进行消毒[3]。

1.2 改善接种室环境条件接种室应保持密闭、洁净；培养室应控制空气相对湿度在70%左右，湿度太高时可用抽湿机除湿。

每次接种前均应清洁接种室的地面，并喷75%酒精沉降灰尘，然后打开紫外灯灭菌20～30 min，紫外灯灭菌结束后，用75%酒精擦洗工作台面。

草莓茎尖组织培养防褐化及玻璃化研究付崇毅;姜伟;王建国;杜金伟【摘要】以草莓茎尖和分化形成的不定芽为试验材料，研究了不同防褐化措施对草莓茎尖愈伤诱导及抗褐化效果的影响，继代培养中逐代降低6-BA浓度对不定芽增殖及玻璃化的影响。

结果表明：草莓茎尖诱导培养基6-BA最适宜浓度为1．5mg／L，在诱导培养基中添加50mg／L Vc可显著降低茎尖褐化率，黑暗预处理对防止草莓茎尖褐化效果不显著。

在草莓组培苗继代培养基质中逐代降低6-BA浓度，可抑制草莓组培苗玻璃化。

【期刊名称】《北方农业学报》【年(卷),期】2016(044)001【总页数】6页(P46-51)【关键词】草莓;组织培养;褐化;玻璃化【作者】付崇毅;姜伟;王建国;杜金伟【作者单位】内蒙古农牧业科学院,内蒙古呼和浩特010031;;;;【正文语种】中文【中图分类】S668.4草莓属于蔷薇科草莓属多年生常绿草本植物，其生长周期短、果实成熟早,经济效益好，是我国栽培最早、面积最大的设施果品种类之一。

目前，内蒙古自治区日光温室草莓种植面积已超过667 hm2，并呈迅速发展态势。

近年来随着草莓组培脱毒苗的推广普及，草莓组培脱毒苗需求量增加。

但因内蒙古自治区当地缺少专业的草莓育苗企业，加之内蒙古自治区科研单位对草莓组培脱毒苗繁育技术缺乏系统、连续性的研究，生产上所需草莓苗大部分由自治区外调入，草莓组培脱毒苗供应不足的问题日益严重。

目前，草莓茎尖组织培养是生产上获得脱毒苗的主要途径之一。

有关草莓组培脱毒的研究报道很多，主要集中在脱毒方法及检测[1~3]，组培环境、营养及激素条件[4-5]，组培过程中细胞发育及生理[6]等方面的研究。

本试验在国内现有研究基础上，对草莓茎尖组培快繁的生长条件进行了研究，尤其针对草莓组培过程中出现的褐化、玻璃化等问题，开展了大量研究，以期建立草莓组培脱毒苗的快繁体系，为内蒙古自治区草莓组培脱毒苗规模化快速培育种苗提供技术支持。

植物组织培养中的常见问题与对策摘要: 探讨了影响植物组织培养的主要因素, 分析了污染、畸形胚、玻璃苗、褐变、黄化等产生的原因, 并提出了解决措施。

认为: 污染主要是由灭菌不彻底和环境不洁造成的, 加强外植体和培养基的灭菌, 对培养环境及用具彻底消毒, 可大大降低污染率。

培养时间和培养基的组成影响畸形胚的发生, 缩短培养时间, 调整培养基中激素含量, 可使畸形胚转化为正常苗。

培养基的种类、温度、通气状况等会影响玻璃苗的发生, 选择适当培养基, 降低温度, 增强光照, 改善通风等可使玻璃化率降低。

植物品种、取材部位及环境条件与褐变的发生密切相关, 选择适宜的外植体, 进行暗处理, 添加抗氧化剂和吸附剂等可有效控制褐变。

培养基中铁含量不足, 激素配比不当等会导致黄化,正确添加培养基的各种成分, 增强光照, 及时转接可减少黄化。

关键词: 组织培养; 污染; 褐化; 畸形胚; 玻璃苗中图分类号: Q945. 4文献标识码: A文章编号: 1673- 2006( 2010) 11- 0054- 04 收稿日期: 2010- 04- 10作者简介: 王桂荣( 1972- ), 女, 安徽宿州人, 实验师, 主要从事植物及植物生理实践教学与实验室管理。

植物组织培养技术广泛应用于植物脱毒快繁、育种、种质保存、获得次生代谢产物、突变诱发、细胞工程和基因工程等方面, 而且在医药、食品工业、能源工业、环境保护各个领域显示出极大的生产潜力,产生了巨大的经济效益和社会效益, 已成为当代生物科学中最有生命力的一门学科。

但在植物初代培养和继代培养过程中经常会遇到一些问题, 如污染、畸形胚、玻璃苗、褐变、黄化等, 影响实验结果, 甚至导致实验失败, 给科研和生产造成损失。

本文根据近年的研究文献及本人的工作实践, 对这几个问题产生的原因及解决措施进行了论述, 以供参考。

1. 1污染产生的原因污染是在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌, 导致培养失败。

任务四植物组培过程中异常现象诊断与防治（4学时）【任务提出】：植物组织快繁过程（初代、继代、生根及驯化）中，观察可能出现的异常情况，请详细记录并研究解决方案。

【任务解析】：植物组织培养过程中，难免会出现一些异常情况，常见的现象主要是污染、褐化和玻璃化，如污染主要以细菌与真菌污染为主，在培养基的表面滋生大量菌斑，造成培养材料不能生长和发育的现象；褐变是指外植体在接种后，其表面开始变褐，有时甚至会使整个培养基变褐；玻璃化是指当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明状，呈水迹状，这些现象一直困扰工作人员。

【相关知识】：一、污染（一）污染的含义污染是组织培养最常见和首要解决的问题。

所谓污染是指在组织培养过程中，由于细菌、真菌等微生物的侵染，在培养基的表面滋生大量菌斑，造成培养材料不能生长和发育的现象。

（二）污染的类型与症状引起污染的微生物主要有芽胞杆菌、大肠杆菌等细菌和毛霉、根霉、青霉等真菌，与此相对应的污染类型就分为细菌性污染和真菌性污染。

细菌性污染的症状是菌落呈黏液状，颜色多为白色，与培养基表面界限清楚，一般接种后1～2d就能发现；而真菌性污染的症状是菌落多为黑色、绿色、白色的绒毛状、棉絮状，与培养基和培养物的界限不清，一般接种后3～10d后才能发现。

实际培养中要明确辨认出是哪种污染，以便有针对性地采取防治措施，从而提高组培成功率。

（三）组织培养过程中的污染源（1）户外风大菌类进屋机会多（2）屋内太潮菌类繁衍多（3）物品带菌多（4）屋内不干净（5）屋内清理带菌组培苗（6）接种不正确（四）预防措施（1）通风：经常开窗，保持室内空气流通可以使室内真菌数量减少。

通风方法简便易行，应多使用。

（2）去湿：保持室内空气干燥，如使用空调“除湿”功能，也可减少真菌生长繁殖。

（3）光照：紫外线能杀灭或抑制真菌生长，对减少室内真菌污染大有好处。

（4）防霉：污染物品和污染培养基不要在培养室近距离开瓶洗刷。