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实验二植物病原菌的组织分离实验二植物病原菌的组织分离、培养和纯化一、实验目的通过本次实验学习植物病原菌分离培养及纯化的原理和常用的方法。
二、材料和用具玉米大斑病叶、灰斑病叶、苹果果实轮纹病及霉心病、甘薯黑斑病等材料，5%次氯酸钠溶液（有效氯为5%，见光分解，尤其紫外光，现用现配），75%酒精，剪刀，镊子，无菌水，灭菌培养皿，保鲜膜封口膜，记号笔、解剖刀，75%酒精小喷壶、酒精灯，打火机、、无菌滤纸、酒精棉、培养皿三、分离材料的选择为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且最好在病、健交接处选材取样。
病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。
四、植物病原菌的分离方法病原菌分离的方法因材料不同而异，植病实验室最常见的方法有组织分离法和稀释分离法两种。
（一）.组织分离法：这种方法适用于大部分病菌的分离，此法又分为小块组织分离和大块组织分离两种方法。
1、病斑类病原菌的分离（玉米大斑病病、灰斑病及苹果果实轮纹病的分离、甘薯黑斑病）（1）将无菌培养皿、镊子、无菌水、无菌滤纸、75%酒精小喷壶等放入无菌操作台，开紫外灯15分钟。
期间融化培养基备用。
（2）在操作台外，用酒精消毒双手，晾干。
在操作台内再次消毒双手，晾干，将融化并冷却到50℃左右的PDA以无菌操作倒入培养皿8—10ml，在桌面上轻轻摇动，敞开盖，制成平，凝固后待用。
（3）在操作台外，取分离材料，在病、健交界处剪取2—3毫米长的病组织。
（4）在无菌条件下，用5%的次氯酸钠溶液消毒3-5min，（时间长短依病组织不同而异，处理种子约5—10分钟）。
（5）用经过三次火焰灭菌的镊子将消毒的病叶移至无菌水中，漂洗3次，在滤纸上吸干水分，移至PDA平板培养基上，每皿可放均匀放3~4片，使材料与培养基紧密接触。
倒置于25—28℃恒温箱内培养。
（6）3~4天后，待菌落长出后挑取前缘菌丝，回接于PDA培养基上，在25℃温箱中培养，待菌落颜色变深后，在无菌条件下镜检是否是玉米大斑病菌、灰斑病菌、黑斑病菌、轮纹病菌，若仅有这几种病原菌的分生孢子，则说明已获得了纯培养，否则，则需要继续转至斜面培养基上进行纯化，直至获得纯培养。
毛竹菱斑病病原菌的分离与鉴定王海霞，彭九生，刘易鑫（江西省林业科学院，江西南昌 330032）摘要：采用致病性测定、形态学观察和ITS-rDNA序列分析方法对井冈山毛竹菱斑病病原进行了研究。
从108块毛竹病斑组织中分离获得30株真菌，选择分离频率高的菌株为研究对象，结合ITS-rDNA序列分析鉴定，将其归属于Fusarium oxysporum、Alternaria alternate、Arthrinium sp.、Gibberella zeae和Xylaria sp. 5个属。
经过室内和田间有伤接种致病性测试证实，尖孢镰刀菌、链格孢菌、节菱孢属菌、赤霉病菌和炭角菌属均具有致病性，其中尖孢镰刀菌的致病性最强，分离相对频率最高，初步推断其主要致病菌类群。
关键词：毛竹；尖孢镰刀菌；病原菌；ITSIsolation and identification on pathogen of Moso BambooW ang Haixia1，Peng Jiusheng1,Liu Yixing1,Zhang Zhibin2(1. Jiangxi Academy of Forestry, Nanchang 330032, Jiangxi, China；2. Jiangxi Normal University,Nanchang330022)Abstract: The pathogens of bamboo disease were identified on the basis of pathogenicity testing, as well as morphological characters and internal transcribed spacer of ribosomal DNA (rDNA) sequence analysis. A total of 30 possible pathogenic fungal isolates were isolated from 108 pieces of diseased bamboo tissues. Based on pathogenicity experiments, the results showed that Fusarium oxysporum, Alternaria alternate, Arthrinium sp., Gibberella zeae, and Xylaria sp. were the major pathogenicity strains. Especially the Fusarium oxysporum which was preliminary identified as pathogen, with the highest isolation relative frequency and the same disease symptom compared with the diseased bamboo under nature conditions.Keywords:Phyllostachys heterocycla; Fusarium oxysporum; Pathogen; ITS近年来，江西省毛竹林有一种新的发病趋势，该病主要危害2年生以上立竹，病状特征为竹间密布菱状病斑，呈菱形斑块扩散于竹节间，病斑表面呈褐色丘状突起，周围密布粉状真菌孢子，根据病状特征确定为真菌感染病害，并初步定名为菱斑病。
养殖大菱鲆病原菌的分离鉴定、组织病理学及免疫组织化学的开题报告一、研究背景和意义随着人们对水产品需求的增加，养殖业得到了迅速发展。
然而，由于如地理位置、养殖条件、养殖密度等因素的影响，病害也成为了水产品养殖的一大难点。
同时，由于水产品的特殊性，很多传统的治疗手段并不适用，因此急需寻找新的治疗方案。
大菱鲆在水产养殖中占据重要地位，但其感染的病理菌种目前尚未得到深入研究。
因此，本研究旨在分离鉴定大菱鲆病原菌，探究其病理学及免疫组织化学特征，为该种水产品感染病害的防治提供科学依据，具有重要的理论和应用意义。
二、研究内容和方法本研究选取不同自然水域中的大菱鲆为研究对象，采用微生物分离培养技术，经鉴定得到大菱鲆病原菌菌株。
利用生物学、生化学等方法进行菌株鉴定，并评价其致病力及毒力。
在此基础之上，采用病理学方法对大菱鲆致病菌的组织病理学特征进行研究，结合组织化学方法观察其在宿主体内的分布和变化，并对其对病理反应的作用机制进行探究。
最后，运用免疫组织化学技术检测大菱鲆感染病原菌后免疫系统的变化，分析其免疫机制，并评价其免疫效果和安全性，为防治该病害提供了理论和实践依据。
三、预期研究结果1. 成功分离出大菱鲆致病菌并进行了鉴定；2. 对大菱鲆致病菌的组织病理学特征进行探究，并结合组织化学方法观察其在宿主体内的分布和变化；3. 对大菱鲆感染病原菌后免疫系统的变化进行检测，分析其免疫机制，并评价其免疫效果和安全性。
四、研究意义和应用本研究探究大菱鲆感染的病原菌的鉴定、组织病理学及免疫组织化学特征，为该种水产品感染病害的防治提供了科学和实际的依据。
其研究结果可为相关水产品养殖企业提供科学依据，有效防止由大菱鲆感染病害引起的经济损失，促进经济社会的可持续发展。
富贵竹采后病害种类调查及其病原菌鉴定简介富贵竹是一种常用的观赏植物，具有株形挺拔、叶片翠绿等优点，因此备受欢迎。
不过，在采摘之后，富贵竹的质量容易受到病害的影响。
为了保障富贵竹的品质和生命力，需要对其采后病害进行种类调查及病原菌鉴定。
调查方法我们选取了多个富贵竹采摘基地，并在采摘后进行了病害调查和采样。
具体调查方法如下：1.外观检查法：观察富贵竹的外观，包括叶片、竹杆、竹枝等部位。
对于有病害的样本进行照相或拍视频，记录下来。
2.镜下检查法：对于外观检查无法确定病害种类的样本，我们采用显微镜观察其细胞构造，以进一步鉴定病害种类。
3.拉孢法：对于疑似真菌感染的样本，我们进行拉孢实验，从感染部位采集一小块组织并在培养基上进行，以检测出可能的病原菌。
调查结果通过实地调查和采样，我们鉴定出了在采后富贵竹上出现的常见病害种类和病原菌。
以下是详细介绍：1. 白粉病白粉病是一种常见的真菌感染病害。
富贵竹的白粉病主要发生在叶片上，表现为叶片表面有白色粉末状的菌丝，很容易被发现。
我们通过拉孢实验和显微镜观察，鉴定了病原菌为白粉菌（Erysiphe pulchra）。
2. 枯萎病富贵竹的枯萎病通常由真菌感染引起，会导致富贵竹的叶片、竹杆枯萎和凋谢。
我们通过外观检查和镜下检查，发现了许多感染了枯萎病的样本，但由于病原菌种类繁多，拉孢实验并不能鉴定出具体病原菌种类。
3. 叶斑病叶斑病是由细菌、真菌和病毒等病原体引起的一种叶片病害。
我们通过拉孢实验和显微镜观察，发现了叶斑病的病原菌种类包括：青枯菌（Pseudomonassyringae）、红枯菌（Xanthomonas campestris pv. campestris）、灰霉菌（Botrytis cinerea）和各种病毒。
4. 炭疽病炭疽病是由炭疽菌感染引起的寄生真菌性病害，在富贵竹上表现为黑色小点。
我们通过拉孢实验和显微镜观察鉴定了炭疽病的病原菌为炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。
毛竹炭疽病的初步研究鲁春富1∗㊀郑梦兰2㊀李雪涛1㊀杨㊀振1㊀吴㊀佳1∗(1.安吉县林业局,浙江安吉313300;2.安吉县梅溪镇农办,浙江安吉313300)[摘㊀要]㊀1994年3-4月安吉县发现部分毛竹林区上年新竹发病死亡,面积达820hm2,涉及6个乡镇街道,死竹逾10万株㊂1994年7月安吉县林业局森防站对该病害开展了专题调查研究,经三年多的林区调查试验发现,该病害在林间表现为二种病状:一是当年初夏枯死类型;二是隔年枯死类型㊂经分离㊁接种,再分离,证实为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz)引起的毛竹炭疽病㊂[关键词]㊀毛竹炭疽病;胶孢炭疽菌;初步研究中图分类号:S763.7㊀㊀㊀㊀㊀㊀文献标识码:A㊀㊀㊀㊀㊀㊀文章编号:1009-3303(2023)01-0016-04 Preliminary Study on Anthracnose of Phyllostachys PubescensLu Chunfu1∗㊀Zheng Menglan2㊀Li Xuetao1㊀Yang Zhen1㊀Wu Jia1∗(1.Anji Forestry Breau,Anji313300,Zhejiang,China;2.Agricultural Officeof Meixi Town,Anji313300,Zhejiang,China)Abstract:From March to April1994,some young Moso bamboo in Anji County were found dead,covering an area of820hm2,involving six rural streets and more than100,000dead Phyllostachys pubescens.In July1994,the Forest Defense Station of the Forestry Bureau of Anji County conducted a special investigation and study on the dis-ease and after more than three years of forest investigation and experimentation,it was found that the disease mani-fested itself in the forest as two kinds of diseases:First,the type of death in the early summer of the year;The sec-ond is the type of death in the next year.It was confirmed to be Bamboo anthracnose caused by Colletotrichum gloeosporioides Penz.Key words:Bamboo anthracnose;colletotrichum gloeosporioides Penz.;preliminary study安吉县是全国著名的竹乡,毛竹(Phyllostachys heterocycla cv.Pubescens)林面积58426hm2,占林地面积的43.2%,毛竹生产在林业经济中占有重要的地位,是山区农民的主要经济来源㊂在1994年3 4月,安吉县部分毛竹林区上年度的新竹发生了新病害,新竹出现枯枝㊁枯梢,直至整株枯死;经县林业局森防站组织专题调查:全县发生范围涉及6个乡镇,面积达820hm2,枯死毛竹10万余株,以杭垓㊁溪龙㊁梅溪3个乡镇较为严重;新病害的发生为害,立即引起了林农㊁林业干部和各级领导的重视,于1994年7月由县林业局森防站负责,组织开展林区调查防治工作,并于1995年3月正式立题开展毛竹新病害的研究㊂1㊀材料与方法(1)在不同的发病林区采集发病枝条的细爪枝㊁中枝㊁大枝的节间处变色段或病斑枝㊂采用常规分离方法,表面灭菌后的组织块,置于PDA培养基上,25ħ温度下培养,然后进行鉴定㊂将培养分离纯化的病原菌,制成每160倍视野中含有50~60个孢子的孢子悬浮液,分二种方法接种,一种是将上述孢子悬浮液置于小型喷雾器中无伤喷洒枝条或将枝条基部刺伤,再喷洒孢子悬浮液,保湿17h㊂另一种方法是将枝条基部刺伤塞入上述病原菌的菌丝,外部用塑料条捆扎保湿15d[1-3]㊂(2)采集经病原菌接种后表现发病症状的细枝,中枝和大枝,进行再分离鉴别㊂(3)将培养15d的病原菌制成每160倍视野中含有50~60个孢子的孢子悬浮液,每载玻片上滴2滴,在室温下快速风干,放入相对湿度分别为100%㊁98%㊁93%㊁90%㊁86%㊁75%㊁65%㊁50%㊁35%㊁∗第一作者简介:鲁春富,农艺师,从事林业技术推广工作,E-mail:1605387127@㊂∗通信作者:吴佳,高级工程师,从事森林病虫害防治研究和林业技术推广工作,E-mail:wujia123666@㊂25%㊁10%㊁0%恒温保湿箱中,25ħ温度下,24h检查孢子萌发率,每个相对湿度重复3次[4-5]㊂(4)将上述同样方法制备的孢子悬浮液滴2滴于载玻片上,放入上㊁下铺有湿滤纸的培养皿中,置于0~40ħ8个梯度的温箱中,24h检查孢子萌发率,每温度重复3次㊂(5)采用50%多菌灵可湿性粉剂,70%甲基托布津可湿性粉剂,50%退菌特可湿性粉剂和75%百菌清可湿性粉剂,制成浓度为:1ʒ500,1ʒ1000, 1ʒ1500倍药液滴于载玻片上,再滴入上述制备的孢子悬浮液二滴,28ħ下保湿24h后检查孢子萌芽率,每浓度三重复,每重复观察二个视野,对照为蒸馏水滴㊂(6)取在PDA培养基上培养15d的病原菌配成每160倍视野50~60个孢子的悬浮液,滴入灭菌的9cm培养皿中,每皿2滴,倒入冷却至30ħ左右的PDA培养基,待凝固后,在培养皿中央放入一个直径为0.5cm,沾有上述四种药剂和各浓度的滤纸碟一个,设对照为沾无菌水,28ħ下培养5d后检查抑制圈的大小,2㊀结果与分析2.1㊀枝条分离培养结果由表1可见,经过多次多地采样,进行不同部位的分离培养,枝条上的病菌以胶孢炭疽菌(Colletotri-chum gloeosporioides Penz)为明显的优势菌,细枝节处的分离得率为91.7%,中枝上的分离得率为91. 6%,大枝上的分离得率为66.5%,细枝枯芽的分离得率为80%㊂表1㊀病竹枝条病原菌分离培养结果采样地点:安吉县㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀树种:毛竹采样地点分离日期分离类型块数长菌情况长菌数其中;胶孢炭病菌交链孢菌节棱孢菌镰刀菌其它无菌缫舍村95.10.16竹梢细枝节1001009343杭垓镇新塘村96.2.5枯死竹细枝节1212822 96.5.17竹梢细枯枝57565061 96.5.17竹梢细枝枯芽2626206递铺街道南北庄村97.7.25嫩病竹细枝节17171797.8.19嫩病竹细枝节139139122143 97.7.25嫩病竹中枝褐斑222221197.8.19嫩病竹中枝褐斑1061069221297.7.25嫩病竹大枝凹陷斑48473891 97.8.19嫩病竹大枝凹陷斑413524926竹种园97.8.20嫩病竹 大枝全部细枝节929292天荒坪镇港口村96.6.2枯竹梢细枝节535352196.6.2枯竹梢中枝节32302912 96.6.2枯大枝636338141196.6.2枯大枝基部与秆交界处262514921 96.6.12枯竹梢中枝节575755296.6.12枯大枝454529133㊀㊀将分离所得的胶孢炭疽菌进行人工接种,经过2年多地的接种显示,胶孢炭疽菌可以侵染竹枝,造成细枝节间发黑,小枝,中枝紫褐色;大枝病斑及整枝枯死,产生与自然界相同的症状㊂特别是在每年5月到6月初用孢子悬浮液无伤接种的症状表现更为明显㊂说明病菌产生附着孢能直接穿透寄主表皮侵入为害,详见表2㊂2.2㊀枝条接种病原菌再分离结果由表3可见,胶孢炭疽菌接种后表现症状的细枝㊁中枝和大枝,经再分离,长出胶孢炭疽菌的比例均很高,在64.7%~100%,平均为88.3%,而对照的健康细枝分离长出的多为其它菌或无菌,胶孢炭疽菌的比例仅为4.3%,证实了胶孢炭疽菌能侵染毛竹枝条,造成毛竹枝条枯死的病原菌㊂表2㊀毛竹枝条人工接种试验结果接种日期接种地点接种方法检查日期胶孢炭疽菌接种枝条发病枝条病情ⅠⅡⅢ对照(无菌水)感染指数接种枝条发病枝条病情ⅠⅡⅢ感染指数96.5.28港口刺伤塞入菌丝96.7.499966.630096.6.6高坞岭刺伤喷孢子悬浮液96.7.2263337.030096.6.6高坞岭无伤喷孢子悬浮液96.7.22431250.030096.8.20高坞岭摘叶喷孢子悬浮液97.3.1212511418653164.33033397.6.3杭垓高家冲无伤喷孢子悬浮液97.7.151********.5500备注刺伤接种病情:Ⅰ仅伤口周围黑褐色,Ⅱ伤口周围黑褐色达1/2枝条以上,Ⅲ枝条枯死无伤接种病情:Ⅰ仅部分细枝节黑褐色,Ⅱ部分细枝枯死,细枝节黑褐色,Ⅲ中枝以上的枝条枯死表3㊀毛竹枝条人工接种病原菌再分离培养结果接种日期接种病原再分离日期分离类型块数长菌情况长菌数其中胶孢炭疽菌占%交链孢菌占%其它菌占%无菌占%96.5.28胶孢炭疽菌96.7.5中枝基部褐变11111110096.6.6胶孢炭疽菌96.7.26枯细枝节32322887.5412.5枯中枝节202020100枯大枝基部褐斑18181794.41 5.596.8.20胶孢炭疽菌96.9.12枯细枝节139********.93 2.2128.65 3.6枯中枝节34342264.7720.6514.797.6.3胶孢炭疽菌97.10.17细枝节11211110493.77 6.3大枝病斑18181810097.6.3CK无菌水97.10.17健康对照细枝46352 4.3817.42554.311242.3㊀湿度对胶孢炭疽菌孢子萌发的影响表4㊀湿度对胶孢炭疽菌孢子萌发的影响相对湿度/%孢子萌发率/%相对湿度/%孢子萌发率/%相对湿度/%孢子萌发率/%10052.6860350 9846750250 938.9650100 90050000㊀㊀由表4显示,胶孢炭疽菌在100%㊁98%和93%的相对湿度中可萌发,但在93%相对湿度时萌发率比较低,仅为8.9%,而在90%以下的相对湿度中就不能萌发,说明胶孢炭疽菌孢子萌发需要较高的湿度㊂2.4㊀温度对胶孢炭疽菌孢子萌发的影响由表5显示,胶孢炭疽菌孢子在10~35ħ均可以萌发,15~25ħ区间萌发得比较好,尤以25ħ时的萌发情况最好,孢子萌发率最高㊂表5㊀温度对胶孢炭疽菌孢子萌发的影响温度/ħ孢子萌发率/%温度/ħ孢子萌发率/%温度/ħ孢子萌发率/%402079.43540 1028.22582.0400 1572.93055.72.5㊀四种药剂对胶孢炭疽菌分生孢子萌芽的抑制试验结果由表6可见,除多菌灵1ʒ1500倍液有2%的少量孢子萌芽外,其余三种药剂均能完全抑制孢子的萌芽㊂2.6㊀四种药剂对胶孢炭疽菌菌丝生长的抑制试验结果由表7可见,退菌特与百菌清的抑菌效果比甲基托布津和多菌灵好,退菌特又优于百菌清㊂3㊀胶孢炭疽菌的形态胶孢炭疽菌(Colletotrichun gloeosporioides Penz),分生孢子单细胞,无色,园柱形,两端钝园,并各有一个油球,长12.5~20um,宽3.8~6.0um,萌发时产生近似菱形的附着孢,边缘整齐,分生孢子盘生于寄主表皮下,后外露,单生,直径160~220um,无刚毛,在潮湿条件下,可产生淡粉红色胶质的分生孢子堆㊂表6㊀四种药剂对胶孢炭疽菌孢子萌芽的抑制试验结果孢萌㊀㊀药剂率/%㊀浓度㊀㊀㊀多菌灵甲基托布津百菌清退菌特1ʒ50000001ʒ100000001ʒ15002000CK45.345.345.345.3表7㊀四种药剂对胶孢炭疽菌菌丝生长的抑制试验结果㊀㊀㊀药剂抑制㊀㊀㊀㊀圈直㊀㊀径㊀(cm)浓度㊀㊀㊀多菌灵退菌特甲基托布津百菌清1ʒ500 6.57.0 4.0 5.0 1ʒ1000 4.0 6.5 4.0 5.0 1ʒ1500 3.0 6.5 2.0 4.5CK00004㊀结论与讨论(1)经过三年多的研究认为,胶孢炭疽菌(Col-letotrichun gloeosporioides Penz)在无伤情况下,可以侵染幼嫩枝梢造成嫩枝发病,引起局部病斑或枝条枯死㊂从自然界采集的病枝分离培养结果来看,该菌所占比例平均在80%左右,为明显的优势菌,说明胶孢炭疽菌在自然界的病竹枝条上普遍存在,该菌如在适宜的温湿度条件下,可以直接侵染当年嫩毛竹的枝条,造成枝条发病枯死,形成在林间常见的枝枯㊁梢枯㊁半边枯和整株枯死[6-8]㊂(2)由胶孢炭疽菌引起的毛竹炭疽病,是自然界毛竹病害中的又一新病害,它萌发时产生近似菱形的附着孢,直接穿透寄主表皮侵入为害[9-10]㊂(3)该文初步报道了毛竹炭疽病的研究结果,描述了胶孢炭疽菌的形态,该菌的生物特性和室内药剂筛选结果,对该菌在毛竹上的发病规律,侵染循环㊁寄主范围㊁林间防治试验㊁分类地位尚待进一步的研究㊂(4)该菌与林间的竹螟㊁竹象虫㊁竹舟蛾等害虫为害,其相互之间关系尚待进一步的调查与研究㊂参考文献[1]Boa㊁E㊁R.1985.Fungal.Disease of Bamboo A Pro-liminary and ptovisional1ist Recent Research on Bamboo.CAF china and IDRC Canada:271-279.[2]Mohanan.C.1988.Disease of Bamboos in Kera-la.Proceedinss of the Int l Bamboo Workshop. NOV.14-18:173-183.[3]Rahman.M.A.1985.Bamboo blight in the Village groves of Bangladesh.Recent Research on Bamboo. CAF.china and IDTC Canada:266-270.[4]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海科技出版社,上海,1979.[5]邵力平.真菌分类学[M].东北林学院,1981.[6]张素轩,章卫良,曹越,等.毛竹基腐病病原的研究[J].南京林业大学学报,1995(1):1-7. [7]王晓鸣,李建义.陕西省炭疽菌的研究[J].真菌学报,1987(4):211-218.[8]陈继团.毛竹(笋)秆基腐病林业病虫防治手册[M].北京:中国林业出版社,1987.[9]王彤彤,高粉,刘丹,等.四川成都南天竹炭疽病病原菌的初步鉴定[J].园艺学报,2019,46(8): 1576-1584.[10]樊改丽.棕竹炭疽病病原菌的分离鉴定[J].亚热带农业研究,2019,15(2):127-131.来稿日期:2023-01-29。
毛竹菱斑病病原菌的分离与鉴定王海霞，彭九生，刘易鑫（江西省林业科学院，江西南昌 330032）摘要：采用致病性测定、形态学观察和ITS-rDNA序列分析方法对井冈山毛竹菱斑病病原进行了研究。
从108块毛竹病斑组织中分离获得30株真菌，选择分离频率高的菌株为研究对象，结合ITS-rDNA序列分析鉴定，将其归属于Fusarium oxysporum、Alternaria alternate、Arthrinium sp.、Gibberella zeae和Xylaria sp. 5个属。
经过室内和田间有伤接种致病性测试证实，尖孢镰刀菌、链格孢菌、节菱孢属菌、赤霉病菌和炭角菌属均具有致病性，其中尖孢镰刀菌的致病性最强，分离相对频率最高，初步推断其主要致病菌类群。
关键词：毛竹；尖孢镰刀菌；病原菌；ITSIsolation and identification on pathogen of Moso BambooW ang Haixia1，Peng Jiusheng1,Liu Yixing1,Zhang Zhibin2(1. Jiangxi Academy of Forestry, Nanchang 330032, Jiangxi, China；2. Jiangxi Normal University,Nanchang330022)Abstract: The pathogens of bamboo disease were identified on the basis of pathogenicity testing, as well as morphological characters and internal transcribed spacer of ribosomal DNA (rDNA) sequence analysis. A total of 30 possible pathogenic fungal isolates were isolated from 108 pieces of diseased bamboo tissues. Based on pathogenicity experiments, the results showed that Fusarium oxysporum, Alternaria alternate, Arthrinium sp., Gibberella zeae, and Xylaria sp. were the major pathogenicity strains. Especially the Fusarium oxysporum which was preliminary identified as pathogen, with the highest isolation relative frequency and the same disease symptom compared with the diseased bamboo under nature conditions.Keywords:Phyllostachys heterocycla; Fusarium oxysporum; Pathogen; ITS近年来，江西省毛竹林有一种新的发病趋势，该病主要危害2年生以上立竹，病状特征为竹间密布菱状病斑，呈菱形斑块扩散于竹节间，病斑表面呈褐色丘状突起，周围密布粉状真菌孢子，根据病状特征确定为真菌感染病害，并初步定名为菱斑病。
病菌由外而内逐渐深入竹腔，导致竹杆腐烂甚至整株枯死（见图1）。
这不仅破坏了毛竹林的景观效果，也严重影响毛竹林的丰产经营，降低了毛竹林的经济效益[1-4]。
该病首次在江西井冈山发现，目前井冈山、鹰潭、靖安等地面临大规模爆发迹象。
为了有效地控制该病的发生和蔓延，笔者自2008年 6月起在井冈山设置了试验林分，设立了固定样地，开展了调查、取样、病原菌分离、鉴定等一系列的研究，初步确定该病为5种真菌所致，而多菌灵、甲基立枯灵及噁霉灵等药剂对其具有不同程度的抑制作用，为今后的进一步研究奠定了基础。
图1 健康毛竹与毛竹菱斑病病变图Fig. 1 Healthy bamboo and symptoms on bamboo with spot pathogen1.材料与方法1.1 试样采集从试验林分内采集年龄相近的发病植株病症组织，用无菌袋分装带回实验室， 24 h 内对样品进行病原菌的分离。
1.2病原菌的分离与纯化取染病毛竹的竹竿病健交界处组织，灭菌后，切成0.2 cm ×0.2 cm 小块，置于PDA 培养基上，于28°C 培养箱中倒置保湿培养10～14d ，每日定时观察并挑取新生菌丝尖端部分转接，纯化培养直至获得纯菌株，于4°C 斜面保藏待用。
1.3病原菌致病性测定用无菌水配制108个/mL 的孢子悬浮液，待用。
1.3.1 室内离体组织接种接种到经75%酒精表面消毒的健康毛竹竹杆表面，设刺伤和无伤接种2个处理，每处理重复9次，以无菌水作对照，在28°C 培养箱中，光照和黑暗各12h 连续保湿5d ，定期观察病害发生和发展情况。
1.3.2 田间接种2010年6月下旬在试验林分内随机选取年龄相近的健康毛竹进行接种，设刺伤和无伤接种2个处理，每个处理重复9次，以无菌水作对照。
按室内接种方法接种后覆盖灭菌湿脱脂棉，套硫酸纸袋保湿5d，定期观察，并对接种后发病的组织进行病菌再分离。
1.4 病原菌的形态学鉴定依照真菌的经典分类鉴定方法，从纯化后培养数日的菌落上挑取菌体制成切片，置于光学显微镜下观察菌丝、孢子梗、孢子或其他繁殖体形态以及它们之间的着生关系，同时结合菌株菌落形态特征，包括形状、质地、颜色、边缘特征等情况，参考相关菌物分类学专著初步确定菌株的分类学地位[6]。
1.5 病原菌rDNA ITS区扩增、测序和序列分析将分离得到的菌株纯化培养后用CTAB方法提取DNA[7]。
通用引物ITS1和ITS4扩增ITS 序列[8]。
PCR 反应体系为：模板DNA 2 μL、10 ×PCR buffer 5 μL、Taq DNA 聚合酶2.5 Unit、dNTP(2.5 mmol·L-1) 4 μL、引物各3 μL, 补充去离子水至50 μL。
反应条件：94°C 5 min；94°C 40 s，60°C 40 s，72°C 40 s，34 个循环；72°C 5 min。
PCR 产物用1%凝胶电泳进行检测，在紫外灯照射下从凝胶中切取目的条带，经琼脂糖凝胶回收试剂盒(北京天根生物技术有限公司)纯化，连接到pGM-T载体并转化大肠杆菌DH5α后，用含X-gal和IPTG的Amp+(氨苄青霉素)抗性平板筛选后，挑取白色菌落培养经PCR初步筛选和双酶切测后，送交上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
序列提交到GenBank核酸序列数据库并得到登号，应用Blast 程序对所测得的内生真菌ITS-rDNA序列进行相似性比对。
采用软件ClustalX 1.81 进行多序列的比较，比对结果采用MEGA 4.0 软件进行系统进化树的构建。
2.结果与分析2.1菌株的分离和多样性在总共108块毛竹病斑组织中有103块被真菌侵染，分离获得真菌30株。
选择分离频率高的菌株用于分子鉴定，将形态种ITS-rDNA测序后经BLAST比对，MEGA4.0构建Neighbor-joining系统进化树(图2)，将其归属为Gibberella、Fusarium、Arthrinium、Xylaria和Alternaria 5个属6个种。
其中，来自于Fusarium oxysporum、Alternaria alternate和Gibberella zeae的菌株分离的相对频率较高，分别为20%、13.33%和10%。
表1真菌的种群、数量和相对频率Table1 Population quantity, No.of isolates, and relative frequency of the fungal strain sX ylaria sp. YS-13 (GQ414524)X ylaria sp. A213 (HM222948) L10 (HQ647342)X ylaria sp. M20 (GQ461725) L17 (HQ647344)X ylaria sp. TI070901 (AB449101)X ylaria sp. TI070916 (AB495008) 5 (HQ647334)L1.1 (HQ647336)Arthrinium arundinis (FJ914693)Arthrinium sacchari (AB470880)Arthrinium sp. TS08-8-1-1 (AB470892) 7 (HQ647335)Gibberella zeae (GU327636)Gibberella sp. CBS 122679 (EU552131) L6 (HQ647340)Fusarium sp. HLS110 (FJ770065)Fusarium oxysporum strain ZJ-05 (HM179533) 2-X (HQ647333)Fusarium oxysporum strain ZJ-03 (HM179531)Alternaria alternata strain Y18-23 (GU325663)L7 (HQ647341)Alternaria alternata strain EN24 (FJ809940)Rhizopus oryzae strain R-69 (DQ990330)781006410063100989998100701001001000.02图 2 基于 ITS 序列的系统进化树Fig. 2 Phylogenetic tree of fungus based on the sequence of ITSNote: Data in parentheses are the GenBank accession numbers. The numbers at the nodes indicate the levels of bootstrap support (%) based on 1000 resampled data sets. The scale bar represents 0.02 substitutions per nucleotideposition2.2 菌株的致病性室内离体组织接种实验显示来自于尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、链格孢菌(Alternaria alternate )、节菱孢属菌(Arthrinium sp.)、赤霉病菌(Gibberella zeae ) 和炭角菌属(Xylaria sp.)的菌株有伤接种毛竹都具有致病性(表2)。
