荧光细胞化学样品制备和检测技术50页PPT

当分子从激发态返回到基态时，会以释放光子的形式释放出多余的能 量，这种释放的光子就是荧光。
荧光分析法的化学基础
荧光物质的化学结构
荧光物质的化学结构决定了其荧光性质，如荧光量子产率、荧光 波长等。
荧光物质的激发态性质
荧光物质的激发态性质对其荧光性质也有重要影响，如激发态的 稳定性、激发态的能量转移等。
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详细描述
荧光分析法可用于检测生物样品中的肿瘤标志物、药物浓度、DNA等物质。通过荧光探针、荧光免疫 分析等方法，可实现对肿瘤标志物、药物浓度的快速检测，为肿瘤诊断、药物治疗监测等提供依据。 此外，荧光分析法还可用于DNA检测，为遗传病诊断、亲子鉴定等提供技术支持。
荧光分析法在食品安全中的应用
总结词
荧光分析法的缺点
易受干扰
荧光分析法可能会受到其他物质的干扰，影响检测结果的准确 性。
不稳定性
荧光物质的荧光光谱可能会随着环境条件的变化而发生变化， 导致分析结果不稳定。
成本高
荧光分析法所需的仪器设备相对昂贵，而且需要专业人员操作 和维护。
荧光分析法的改进与发展趋势
优化荧光探针
通过改进荧光探针的设计和合成方法，提高荧光分析法的灵敏度 和特异性。
02
荧光分析法的原理
荧光分析法的物理基础
01
分子能级
荧光分析法涉及分子的能级跃迁，即分子从基态跃迁到激发态，再从
激发态返回到基态的过程。
02 03
激发态与基态的能量差
荧光分析法利用了激发态与基态之间存在的能量差，当分子吸收特定 波长的光能后，会从基态跃迁到激发态，之后释放出特定波长的荧光 。
荧光的产生
荧光物质的基态性质
荧光物质的基态性质同样影响其荧光性质，如基态的稳定性、基 态与激发态之间的跃迁能量等。

3.2.4 影响物质发光的因素>>1.内部因素
➢ 空间位阻使分子共平面性下降，荧光减弱。
SO3Na
H3C N
CH3
H3C SO3Na N CH3
①1-二甲胺基萘-7-磺酸盐 ②1-二甲胺基萘-8-磺酸盐
f＝0.75
f＝0.03
➢ 顺反异构体：反式分子有荧光，而顺式分子没有
荧光(位阻原因)。例如：1，2－二苯乙烯反式有强
⑶ 取代基的影响：给电子取代基使荧光强度增大；而 吸电子取代基则使荧光强度降低。
3.2 基本原理>>
3.2.4 影响物质发光的因素>>1.内部因素
➢ 长共轭结构示例 比较：λex (nm)/ λem (nm)/ f
苯 205/278/0.11
萘 286/321/0.29
蒽 356/404/0.36
2. 荧光和磷光的产生
➢ 辐射跃迁－发光失活 荧光：激发态分子从第一激发单线态S1的最低
振动能级回到基态S0所发出的辐射。 磷光：激发态分子从第一激发三重态T1的最低
振动能级回到基态S0所发出的辐射。 波长关系：激发光＜荧光＜磷光。
3.2 基本原理>>3.2.1分子荧光光谱的产生>>
2. 荧光和磷光的产生
3.2 基本原理>>
3.2.4 影响物质发光的因素>>2.外部因素
➢ 例如：硫酸奎宁在不同波长激发下的荧光光谱和
散射光谱
H
O H3C
H HO
N H
CH CH2
1/2H2SO4 H2O
N
3.2 基本原理>>
3.2.4 影响物质发光的因素>>2.外部因素

研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起 始拷贝数越多，Ct值越小。
;
13
实时荧光定量
Ct 18 and Ct 22, 2^(4 Ct shift) = 16 fold difference
;
14
实时荧光定量PCR原理
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数 的对数，纵坐标代Ct值。因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上 计算出该样品的起始拷贝数。
;
22
（一）选择靶基因
TaqMan技术主要用于检测，所以其扩增的基因必须是特异的，如： 某种病原微生物所共有的保守基因
（检测某种病原微生物）； 某个血清型所特有的基因序列
（区分检测某个血清型）； 选择决定毒力强弱的基因
（区分强毒和弱毒）等。
;
23
（二）选择探针
选择探针需要同时满足以下条件： 1、在靶基因的保守区域 2、G+C含量在40%以上； 3、相同碱基连续不超过4个； 4、Tm值在71±2℃;
以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号 （baseline），荧光域值 的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
threshold = 10 ´ SDcycle 6-15
;
9
实时荧光定量PCR原理
如果检测到荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值 循环数（Ct）。
;
24
（二）选择探针
5、内部自身配对较少； 6、5’端不为G； 7、G数目比C数目少；
如果6和7难以满足的时候，就要考虑用互补序列作探针。
;
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（三）选择引物

S*
体系间跨越
振动弛豫
T1*的最低振 动能级
S0的任一振动能级
发射hυ
特点：1. 不是单一的过程，借助了振 磷光
动弛豫和体系间的跨越
2. 波长大于荧光的波长 3. 持续过程为10-4～10s 4. 低温条件下才可见
区别荧光和磷光？ 21
二、 荧光的激发光谱和发射光谱
荧光物质分子具有两个特征光谱：
1. 激发光谱(excitation spectrum) 表示不同激发波长的辐射引起物质发射某一
ln
F0 Ft
t f
1 f
该公式可以表征荧光寿命。
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荧光效率(fluorescence efficiency)——指激发 态分子发射荧光的光量子数与基态分子吸收 激发光的光量子数之比。
发射荧光的光子数
ψf = 吸收激发光的光子数
如果荧光物质从激发态回到基态过程中没有其 他去极化过程与发射荧光相竞争，那么荧光分 子就可以将所吸收的辐射全部以荧光的形式发 射出来。此时其荧光效率为1。
400 有干扰 ×
Raman光谱有何特点？
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第二节 荧光定量的分析方法
1. 荧光强度与物质浓度的关系 溶液中物质的荧光强度与该物质吸收光量子的 程度以及荧光效率有关—成正相关关系
一般在垂直方向观
I0
I 察或测量荧光强度
F
荧光分光光度计的设计原理
溶液中荧光的测定
40
有关计算
设溶液中荧光物质浓度为C，液层厚度为L。
电子成对地填在能量的最低各轨道上。 根据Pauling不相容原理：一个给定轨道的两个 电子，自旋方向一定相反，自旋量子数为1/2 与 -1/2，总自旋量子数S=0。
↑↓

荧光和磷光产生的示意图
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二、基本原理
外部能量转换 （external conversion)：
如果分子在溶液中激发， 在激发总分子之间、分子 与溶剂分子之间或通过与 其他分子的碰撞而失去能 量，常以热能的方式放出， 这个过程称为外部能量转 换。
特点：发生分子与分 子的碰撞时；时间约10-
二、基本原理
（3）荧光光谱的特点
b.荧光发射光谱的形状与激发波长无关。
原因：荧光发射发生于 第一电子激发态的最低能 级，与分子激发至那一个 电子能级无关。
S2* S1*
ννννν02134
bc
b
ννννν02134
e
ννννν02134
T1
S0
a
d
f
ννννν02134
a 吸收；b.振动驰豫；c.内部能量转换；d.荧光；e.体系间跨 越；f.磷光
9~10-7秒。
S2*
ννννν02134
bc
S1 *
b
ννννν02134
e
ννννν02134
T1
S0
a
d
f
ννννν02134
a 吸收；b.振动驰豫；c.内部能量转换； d.荧光；e.体系间跨越；f.磷光
荧光和磷光产生的示意图
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二、基本原理
（3）荧光与磷光的比较：
成因
E λ
荧光
荧光分析法（Fluorometry)
一
概述
二
基本原理
三
荧光定量分析方法
四
荧光分析技术与应用
五
小结
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一、概述 • 1、荧光（Fluorescence)

实时荧光定量PCR技术
一、荧光定量 PCR仪
荧光定量PCR仪是一种 带有激发光源和荧光信 号检测系统的PCR仪， 通常配有电脑系统及相 应的分析软件。
与普通PCR的区别（一）
❖ 普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物进行定量分析。
❖ 实时定量PCR技术： 实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对 起始模板进行定量。
❖ MGB探针在检测SNP和定量分析甲基化等位 基因方面具有优势。
TaqMan MGB 探针法
❖ TaqMan MGB 探针能分辨一个碱基的差别
TaqMan MGB 探针法原理图示
❖ 优点：
❖ 1.NFQ为非荧光基团，大大降低测定中荧光的本底值，有提 高了淬灭效率。
❖ 2.MGB结合在探针与靶基因杂交形成的双螺旋的小沟中，促 进探针与靶基因杂交的稳定性和特异性，又使探针的Tm值 大大提高，从而使杂交温度的选择余地更大。
❖ 缺点：
❖ 1.合成TaqMan探针价格昂贵。（一条探针约3000~5000元 ）
❖ 2.中国地区仅有基康生物公司（ABI）提供合成服务，合成 时间长，周期需要1~2个月.
与TaqMan探针相比，MGB探针长度更短，淬灭效率更高。
案例分析
❖ 1.应用SYBR Green I 荧光实时定量PCR检测 成蚊携带的登革病毒。
实时荧光PCR的理论基础
❖ 荧光共振能量转移（FRET）：当一个荧光基 团与一个荧光淬灭基团（可以淬灭前者的发 射光谱）的距离邻近至一定范围时，就会发 生荧光能量转移，淬灭基因会吸收荧光基团 在激发光作用下的激发荧光，从而使其发不 出荧光。但如果荧光基团一旦与淬灭基团分 开，淬灭作用即会消失。所以，利用核酸杂 交和核酸水解所致荧光基团和淬灭基团结合 或分开的原理，建立各种实时荧光PCR。

37
28
续前
给电子基团
3、pH影响 对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；
4、荧光熄灭的影响 荧光物质与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或熄灭的现象。 引起荧光熄灭的物质为荧光熄灭剂 常见的熄灭剂有：卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化 合物、重氮化合物、羰基化合物。
29
续前
返3回5
小结： 掌握
• 基本概念：荧光、振动弛豫、内部能量转换、外部能量转换、体系间跨越及磷光； 激发光谱与荧光光谱
• 基本理论：溶液荧光光谱的特征；物质发射荧光的条件；荧光定量分析的依据、 条件及方法
• 熟悉：影响荧光强度的因素（分子结构和外界条件）
了解
• 荧光分析仪器
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练习：
P297，思考题 3、5，8
13
续前 影响体系间跨越几率增大的因素：
➢含重原子的分子（如碘、溴等），体系间跨越最为常见。 原因：高原子序数的原子中，电子的自旋与轨道运 动之间的相互作用较大，有利于电子自旋反 转的发生。
➢在溶液中存在氧分子等，这些顺磁性物质也能增加体 系间跨越的发生几率。
返回14
续前 4、荧光（fluorescence）
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硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与散射光谱(b)
激发320nm
激发350nm
荧光448nm
荧光光谱
瑞利光320nm
散射光谱
拉曼光360nm
瑞利光350nm 拉曼光400nm
返3回1
11.3 荧光定量分析
1、荧光测定方向：激发光源垂直方向，避免透射光干扰。
受激后，可在各个方向发射荧光， 在透过光的方向不易测定F。
5、散射光的干扰 散射光:当一束平行光照射在液体样品上，大部分光线透过溶液，

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1.1
荧光显微镜的优点和用途
优点：
检出能力高（放大作用） 对细胞的刺激小（可以活体染色） 能进行多重染色 用途： 物体构造的观察——荧光素 荧光的有无、色调比较进行物质判别——抗体荧光等 发荧光量的测定对物质定性、定量分析
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1.1
标本制作的顺序
漂浮法（组织片或培养黏附在一些膜上的组织细胞漂浮于染液上），适用于较大较厚的组织片， 或黏附在一些膜上的组织细胞，染料使用相对较少。由于样品一般是反过来面朝下（染液 面），所以特别注意不要在样品与染液间出现气泡。
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1.1
细胞骨架F-actin（F-肌动蛋白）染色：
况下，可见较大量的棕黄色脂褐素荧光颗粒； 4、某些肿瘤细胞在紫外或蓝光激发可呈现明显的自发荧光，可作原位肿瘤的早期诊断； 5、维生素A呈绿色的自发性荧光。如大鼠食入维生素A后，在肝细胞、Kuffer细胞、肾上腺束状带细胞、肺和
肾的间质细胞、卵巢间质细胞和黄体细胞等的胞质内均可见到维生素A的绿色荧光； 6、某些药物也可呈现一定颜色荧光，如奎宁为绿色荧光，四环素为黄色荧光。四环素能与骨基质中的钙结合，
利用这一特性，可以用四环素饲养动物以观察新骨质的形成。另外，四环素和癌细胞有较大的亲合力， 能在恶性肿瘤内形成黄色的荧光灶； 7、有机体的单胺神经原、消化道和呼吸道粘膜内神经内分泌细胞中的内源性生物胺—儿茶酚胺、5-羟色胺和 组织胺等与某些醛类物质在一定条件下可发生缩合反应而呈现荧光。
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1.1

• 落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经 标本反射进入物镜。
透射荧光显微镜光路(a)
落射荧光显微镜光路(b)
-
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第四节 荧光免疫分析
基本原理：将抗原抗体反应与荧光 物质发光分析相结合，用荧光检测 仪检测抗原抗体复合物中特异性荧 光强度，对液体标本中微量或超微 量物质进行定量测定。
-
• (E)
-
49
6、FITC在紫外光的激发下，所产生的荧光为 • A 灰蓝色 • B 黄绿色 • C 橙色 • D 暗红色 • E 橙红色 • （B）
-
50
7、双标记荧光抗体技术的主要用途是 • A 提高荧光强度 • B 提高荧光效率 • C 可同时检测同一标本中两种抗原 • D 使用一种标记物可检测多种抗原 • E 减少非特异性荧光 • （C）
• 涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和 细胞悬液
• 培养细胞：单层培养细胞（人喉癌上皮细 胞HEP-2)
-
20
标本的固定和保存： 固定剂： 乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等 保存：4℃、-20 ℃
-
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二、荧光抗体染色与结果判断
于已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光 抗体 置25-37 ℃ 30min或4 ℃过夜 用 PBS充分洗涤 镜检。
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试验类型
1 直接法 2 间接法 3 双标记法 两种荧光素分别标记的两种不 同的特异性抗体，与同一标本反应，荧光显 微镜观察两种颜色。
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返回
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荧光抗体染色结果判断
设立实验对照:阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表 面型
抗核抗体(均质型)

五、注意事项
• 在荧光显微镜下观察新鲜的紫鸭趾草花粉和蚕豆 • •
表皮切片时，时间不宜太长，以免细胞逐渐死亡， 影响效果。 把握染色时间，使实验观察效果更好。 实验过程随时记录，并分别描述DNA，蛋白质及 线粒体在细胞内的分布与颜色。
吖啶橙： 可与核酸亲和的荧光活体染料。荧光显 微镜下核呈绿色，细胞质呈黄色。 与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发 出不同颜色的荧光，与DNA结合量少发绿色荧光， 与RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料 具有膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA 染色。因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透 过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧 光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大 小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上 致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而 坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。
(一) 材料：新鲜紫鸭趾草花粉或蚕豆原生质体 悬液，人口腔上皮细胞。 (二) 用品：荧光显微镜，载玻片，盖玻片，镊 子，烧杯，牙签等。 (三) 试剂： 1．二丙酸酯荧光素溶液：取l0mg二丙酸荧光素 于5ml丙酮中，将此溶液逐滴加入5ml PH5-6生理 盐水或0.65M的甘露醇溶液中，直到出现永久性乳 白沉淀为止。 2．0.01物细胞壁 植物细胞壁有强烈的吸附染料的能力，因此很多荧光 染料都能着染细胞壁，但近年来最常用的还是荧光增白剂， 以此来鉴别细胞壁的状况，并常用于检查原生质体细胞壁 是否分解完全，以及原生质体再生细胞壁的鉴别。 1．取洋葱表皮细胞(1cm2)置于载玻片，以荧光增白剂 染色5分钟，加盖玻片，荧光显微镜下观察其细胞壁。 2．取以酶液游离出来的原生质体悬液l滴于载玻片上， 加荧光增白剂一滴，染色5分钟，加盖玻片，在荧光显微 镜下观察原生质体脱壁是否完全，蓝紫光激发观察。 (二) DNA分布的观察 取洋葱内表皮细胞(1cm2)置于载玻片，以0.0l％吖啶 橙染色5分钟，生理盐水冲洗一次，加盖玻片，荧光显微 镜下蓝光激发观察。