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专题22基因工程1.（2015·天津卷.6）2015年2月3日，英国议会下院通过一项历史性法案，允许以医学手段培育“三亲婴儿”。
三亲婴儿的培育过程可选用如下技术路线。
据图分析，下列叙述错误的是（）A、该技术可避免母亲的线粒体遗传病基因传递给后代B、捐献者携带的红绿色盲基因不能遗传给三亲婴儿C、三亲婴儿的染色体全部来自母亲提供的细胞核D、三亲婴儿的培育还需要早期环胎培养和胚胎移植等技术【答案】C【考点定位】本题考查核移植技术、动物细胞培养、体外受精和早期胚胎培养、胚胎移植及细胞质遗传和核基因遗传等知识。
2.( 2015·重庆卷.6)下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是（）A．表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反转录获得B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原（起）点C．借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来D．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用【答案】C【考点定位】本题主要是考查利用基因工程改造生物体性状的操作要点。
3.(2014·江苏卷.23)下列关于基因工程技术的叙述,错误的是( )A. 切割质粒的限制性核酸内切酶均特异性地识别6 个核苷酸序列B. PCR 反应中温度的周期性改变是为了 DNA 聚合酶催化不同的反应C. 载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因D. 抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达【答案】ABC【考点定位】基因工程技术的相关知识。
4.(2014·重庆卷.4)题4图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。
以下相关叙述，正确的是( )A．②的构建需要限制性核酸内切酶和DNA聚合酶参与B．③侵染植物细胞后，重组Ti质粒整合到④的染色体上C．④的染色体上若含抗虫基因，则⑤就表现出抗虫性状D．⑤只要表现出抗虫性状就表明植株发生了可遗传变异【答案】D【考点定位】基因工程。
高二生物理科基因工程和植物细胞工程测试题一、选择题：1.分析以下事实：（1）胡萝卜韧皮部细胞通过细胞培养能发育成完整植株。
（2）绵羊乳腺细胞核移入去核卵母细胞中，能发育成有生殖能力的绵羊。
基于以上事实下列说法不正确的是（）A.高度分化的动植物细胞都具有全能性B.分化的动物细胞核具有全能性C.分化细胞中不表达的基因仍存在于细胞核中，并没有消失D.分化细胞中不表达的基因具有启动表达的潜能2.（08江苏卷·20）下列关于植物组织培养的叙述中，错误的是（）A．培养基中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压B．培养中的生长素和细胞分裂素影响愈伤组织的生长和分化C．离体器官或组织的细胞都必须通过脱分化才能形成愈伤组织D．同一株绿色开花植物不同部位的细胞经培养获得的愈伤组织基因相同3.用高度分化的植物细胞、组织和器官进行组织培养可以形成愈伤组织，下列叙述错误的是A.该愈伤组织是细胞经过脱分化和分裂形成的B.该愈伤组织的细胞没有全能性C.该愈伤组织是由排列疏松的薄壁细胞组成D.该愈伤组织可以形成具有生根发芽能力的胚状结构4.下面关于植物细胞工程的叙述，正确的是（）A.叶肉细胞脱分化后可形成无定形状态的薄壁细胞B.叶肉细胞经再分化过程可形成愈伤组织C.融合植物叶肉细胞时，应先去掉细胞膜D.叶肉细胞脱离母体后，可以表现出全能性5.在下列选项中，需要采用植物组织培养技术的是（）①.利用秋水仙素处理萌发的种子或幼苗，获得多倍体植株②.获取大量的脱毒苗③.利用基因工程培养抗棉铃虫的植株④.单倍体育种⑤.无子西瓜的快速大量繁殖A.①②③B.③④⑤C.①②④⑤D.②③④⑤6.下面为植物组织培养过程流程图解，以下相关叙述不正确的是（）A.上述过程中脱分化发生在b步骤，形成愈伤组织，在此过程中植物激素发挥了重要作用B.再分化发生在d步骤，是愈伤组织重新分化成根或芽等器官的过程C.从叶组织块到种苗形成的过程说明番茄叶片细胞具有全能性D.人工种子可以解决有些作物品种繁殖能力差、结子困难或发芽率低等问题7.玉米是一种主要的农作物，为了提高玉米的产量，科学家在玉米育种中和栽培中作了大量的研究。
专题27基因工程1.(2022·辽宁高考)12.抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。
为给监管转基因生物安全提供依据，采用PC方法进行目的基因监测，反应程序如图所示。
下列叙述正确的是（）A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市2.(2022·江苏高考)6.采用基因工程技术调控植物激素代谢，可实现作物改良。
下列相关叙述不合理的是（）A.用特异启动子诱导表达iaaM（生长素合成基因）可获得无子果实B.大量表达ip（细胞分裂素合成关键基因）可抑制芽的分化C.提高ga2ox（氧化赤霉素的酶基因）的表达水平可获得矮化品种D.在果实中表达acs（乙烯合成关键酶基因）的反义基因可延迟果实成熟3.(2022·山东高考)13.关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（）A.过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解B.离心研磨液是为了加速DNA的沉淀C.在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色D.粗提取的DNA中可能含有蛋白质4.（2021江苏）13.下图是剔除转基因植物中标记基因的一种策略，下列相关叙述错误的是（）A.分别带有目的基因和标记基因的两个质粒，都带有T-DNA序列B.该方法建立在高转化频率基础上，标记基因和目的基因须转到不同染色体上C.若要获得除标记基因的植株，转化植株必须经过有性繁殖阶段遗传重组D.获得的无筛选标记转基因植株发生了染色体结构变异5.（2022·1月浙江选考）29.回答下列（一）、（二）小题：（二）我国在新冠疫情按方面取得了显著的成统，但全球疫情形势仍然非常严峻、尤其是病毒出现了新变异株——德尔塔、奥密克戎，更是威胁着全人类的生命健康。
（4）新冠病毒核酸定性检测原理是：以新冠病毒的单链RNA为模板，利用__________酶合成DNA，经PCR扩增，然后在扩增产物中加入特异的__________，如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。
基因工程真题汇编1、2013年标卷I-40．【生物——选修3：现代生物科技专题】（15分）阅读如下资料：资料甲：科学家将牛生长激素基因导入小鼠受精卵中，得到了体型巨大的“超级小鼠”；科学家采用农杆菌转化法培育出转基因烟草。
资料乙：T4溶菌酶在温度较高时易失去活性。
科学家对编码T4溶菌酶的基因进行了改造，使其表达的T4溶菌酶第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸，在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成了一个二硫键，提高了T4溶菌酶的耐热性。
资料丙：兔甲和兔乙是同一物种的两个雌性个体，科学家将兔甲受精卵发育成的胚胎移植到兔乙体内，成功产出兔甲的后代，证实了同一物种的胚胎可在不同个体的体内发育。
回答下列问题：（1）资料甲属于基因工程的范畴。
将基因表达载体导入小鼠的受精卵中常用法。
构建基因表达载体常用的工具酶是和。
在培育有些转基因植物时，常用农杆菌转化法，农杆菌的作用是。
（2）资料乙属于工程的范畴。
该工程是指以分子生物学相关理论为基础，通过基因修饰或基因合成，对进行改造，或制造一种的技术。
在该实例中，引起T4溶菌酶空间结构改变的原因是组成该酶肽链的序列发生了改变。
（3）资料丙属于胚胎工程的范畴。
胚胎移植是指将获得的早期胚胎移植到种的、生理状况相同的另一个雌性动物体内，使之继续发育成新个体的技术。
在资料丙的实例中，兔甲称为体，兔乙称为体。
2、2014课标卷II-40．[生物——选修3：现代生物科技专题]（15分）植物甲具有极强的耐旱性，其耐旱性与某个基因有关。
若从该植物中获得该耐旱基因，并将其转移到耐旱性低的植物乙中，有可能提高后者的耐旱性。
回答下列问题：（1）理论上，基因组文库含有生物的基因；而cDNA文库中含有生物的基因。
（2）若要从植物甲中获得耐旱基因，可首先建立该植物的基因组文库，再从中出所需的耐旱基因。
（3）将耐旱基因导入农杆菌，并通过农杆菌转化法将其导入植物的体细胞中，经过一系列的过程得到再生植株。
要确认该耐旱基因是否在再生植株中正确表达，应检测此再生植株中该基因的，如果检测结果呈阳性，再在田间试验中检测植株的是否得到提高。
高考生物专题复习《基因工程》一、单选题1．（2023·山东青岛·高三期末）自然界中很少出现蓝色的花，天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中花青素在碱性条件下显蓝色。
我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因（idgS）及其激活基因（sfp）构建基因表达载体（如下图），通过农杆菌转化法导入白玫瑰中，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。
下列叙述错误的是（）A．上述获得蓝色玫瑰的方案中需要转入能调控液泡pH的基因B．将idgS基因插入Ti质粒时使用的限制酶是SpeI和SacIC．sfp和idgS基因具有各自的启动子，前者调控后者的表达D．农杆菌可将Ti质粒上的T-DNA整合到白玫瑰染色体DNA上【答案】A【详解】A、分析题意，用农杆菌转化法将链霉菌的靛蓝合成酶基因（idgS）及其激活基因（sfp）导入白玫瑰后，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝，所以无需转入能调控pH的基因，A错误；B、分析题图可知，将idgS基因插入Ti质粒时可用SpeI和SacI以避免产生的黏性末端环化，增加构建成功的概率，B正确；C、分析题图可知，sfp和idgS基因具有各自的启动子，sfp可激活idgS的表达，C正确；D、将目的基因导入植物细胞可用农杆菌转化法，故农杆菌可将Ti质粒上的T—DNA整合到白玫瑰染色体DNA上，D正确。
故选A。
2．（2023春·江苏徐州·高二统考期中）土壤农杆菌侵染植物细胞时，Ti质粒上的T-DNA片段转入植物的基因组。
利用农杆菌以Ti质粒作为载体进行转基因，下列相关叙述正确的是（）A．T-DNA片段有利于介导外源DNA整合到植物的染色体DNA上B．用Ca2+处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞C．Ti质粒是一种环状DNA分子，属于细菌的拟核DNAD．目的基因应插入T-DNA片段外，以防止破坏T-DNA【答案】A【详解】A、Ti质粒上的T-DNA片段能转入植物的基因组中，因此T-DNA片段利于介导外源DNA整合到植物的染色体，A正确；B、农杆菌转化法中不需要用Ca2+处理农杆菌，应直接利用土壤农杆菌感染植物细胞，B错误；C、Ti质粒是一种环状DNA分子，是存在于细菌细胞质中的DNA，C错误；D、在农杆菌转化法中，需要将目的基因插入到T﹣DNA片段上，D错误。
高考生物基因工程真题汇编1、（2011年江苏卷）33．（8分）请回答基因工程方面的有关问题：(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如右图所示）。
图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。
①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为。
②在第轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。
(2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。
某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。
①第1组：；②第2组：。
(3) PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为。
(4)用限制酶EcoRV、Mbol单独或联合切割同一种质粒，得到的DNA片段长度如下图(1 kb即1000个碱基对)，请在答题卡的指定位置画出质粒上EcoRV、Mbol的切割位点。
2、（11年北京卷）31.（16分）T-DNA可能随机插入植物基因组内，导致被插入基因发生突变。
用此方法诱导拟南芥产生突变体的过程如下：种植野生型拟南芥，待植物形成花蕾时，将地上部分浸入农杆菌（其中的T-DNA上带有抗除草剂基因）悬浮液中以实现转化。
在适宜条件下培养，收获种子（称为T1代）。
（1）为促进植株侧枝发育以形成更多的花蕾，需要去除，因为后者产生的会抑制侧芽的生长。
代播种在含的培养基上生长，成熟后自交，（2）为筛选出已转化的个体，需将T1代）。
收获种子（称为T2代播种在含的培养基上，获得所需（3）为筛选出具有抗盐性状的突变体，需将T2个体。
（4）经过多代种植获得能稳定遗传的抗盐突变体。
为确定抗盐性状是否由单基因突变引起，需将该突变体与植株进行杂交，再自交代后统计性状分离比。
（5）若上述T-DNA的插入造成了基因功能丧失，从该突变体的表现型可以推测野生型基因的存在导致植物的抗盐性。
（6）根据T-DNA的已知序列，利用PCR技术可以扩增出被插入的基因片段。
专题18 基因工程2023年高考真题一、单选题1．（2023·湖南·统考高考真题）盐碱胁迫下植物应激反应产生的H2O2对细胞有毒害作用。
禾本科农作物AT1蛋白通过调节细胞膜上PIP2s蛋白磷酸化水平，影响H2O2的跨膜转运，如图所示。
下列叙述错误的是（）A．细胞膜上PIP2s蛋白高磷酸化水平是其提高H2O2外排能力所必需的B．PIP2s蛋白磷酸化被抑制，促进H2O2外排，从而减轻其对细胞的毒害C．敲除AT1基因或降低其表达可提高禾本科农作物的耐盐碱能力D．从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因是改良农作物抗逆性的有效途径1．B【分析】分析题图：AT1蛋白通过抑制PIP2s蛋白的磷酸化而抑制细胞内的H2O2排到细胞外，从而导致植物抗氧化胁迫能力减弱，进而引起细胞死亡。
AT1蛋白缺陷，可以提高PIP2s蛋白的磷酸化水平，促进细胞内的H2O2排到细胞外，从而提高植物抗氧化的胁迫能力，进而提高细胞的成活率。
【详解】A、由题图右侧的信息可知，AT1蛋白缺陷，可以促进PIP2s蛋白的磷酸化，进而促进H2O2排出膜外，A正确；B、据题图左侧的信息可知，AT1蛋白能够抑制PIP2s蛋白的磷酸化，减少了H2O2从细胞内输出到细胞外的量，导致抗氧化胁迫能力弱，不能减轻其对细胞的毒害，B错误；C、结合对A选项的分析可推测，敲除AT1基因或降低其表达，可提高禾本科农作物抗氧化胁迫的能力，进而提高其成活率，C正确；D、从特殊物种中发掘逆境胁迫相关基因，可通过基因工程技术改良农作物抗逆性，D正确。
故选B。
2．（2023·浙江·统考高考真题）某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因（GFP）整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。
实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。
为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。
《植物基因工程》复习资料整理第一部分概述植物基因工程：采用工程设计的方式，通过体外DNA重组技术，将特定的外源基因导入受体植物细胞内，由此获得的转化植物可以表现出预期的遗传特性，具有上述特点的科学被称之为植物基因工程。
第二部分转化系统1.植物转化：外源DNA通过载体﹑媒体或其他物理﹑化学方法导入植物细胞并得到整合及表达的过程。
实现这一过程的途径称之为“植物转化系统”。
2.转化：外源DNA通过载体﹑媒体或其它物理﹑化学方法导入细胞并得到整合及表达的过程。
——Transformation3.T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA，称为转移DNA。
4.Ti质粒致瘤原理：5.T-DNA的结构特点：a.Ti质粒T-DNA区的长度约为23kb。
b.T-DNA仅存在于植物肿瘤细胞的核DNA中；T-DNA 含有激发和保持肿瘤状态所必需的基因；T-DNA和植物DNA之间没有同源性。
c.在T-DNA的5´端和3´端都有真核表达信号。
如TATAbox、AATAAbox及polyA等。
e.T-DNA的两端左右边界各为25bp的重复序列，即边界序列（border sequence），分别称之为左边界（BL或TL）和右边界（BR或TR）。
该25bp边界序列属保守序列,但通常右边界（TR）序列更为保守，左边界(TL)序列在某些情况下有所变化。
其核心部分是14bp，可分为10bp(CACG ATATAT)及4bp(GTAA)两部分,是完全保守的。
f.左边界（TL）缺失突变仍能致瘤,但右边界（TR）缺失则不再能致瘤,几乎完全没有T-DNA的转移,这说明右边界(TR)在T-DNA转移中的重要性。
6.T-DNA在植物细胞中的整合过程（原理）：T-DNA在植物染色体中的插入是随机的，可以插入任何一条染色体，但插入的位点有以下特点：a. T-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点。
植物生物技术试题及答案一、单项选择题（每题2分，共20分）1. 植物生物技术中，下列哪项技术不属于基因工程范畴？A. 基因克隆B. 基因编辑C. 植物组织培养D. 植物细胞融合答案：C2. 植物基因工程中常用的启动子是：A. 病毒启动子B. 细菌启动子C. 真菌启动子D. 动物启动子答案：A3. 植物组织培养中，脱分化是指：A. 细胞从分化状态恢复到未分化状态B. 细胞从未分化状态发展到分化状态C. 细胞从成熟状态恢复到幼年状态D. 细胞从幼年状态发展到成熟状态答案：A4. 植物生物技术中，下列哪项技术可以用于植物品种改良？A. 基因编辑B. 基因克隆C. 基因测序D. 基因表达答案：A5. 植物基因工程中，目的基因的导入方法不包括：A. 农杆菌介导的转化B. 基因枪介导的转化C. 电穿孔法D. 化学诱导法答案：D6. 植物生物技术中，下列哪项技术可以用于植物抗病性研究？A. 基因编辑B. 基因克隆C. 植物组织培养D. 植物细胞融合答案：A7. 植物组织培养中，愈伤组织是指：A. 植物细胞的无序生长B. 植物细胞的有序生长C. 植物细胞的分化D. 植物细胞的脱分化答案：A8. 植物生物技术中，下列哪项技术可以用于植物抗虫性研究？A. 基因编辑B. 基因克隆C. 植物组织培养D. 植物细胞融合答案：A9. 植物基因工程中，目的基因的筛选方法不包括：A. 抗生素筛选B. 荧光筛选C. 放射性同位素筛选D. 酶联免疫吸附试验答案：C10. 植物生物技术中，下列哪项技术可以用于植物耐逆性研究？A. 基因编辑B. 基因克隆C. 植物组织培养D. 植物细胞融合答案：A二、多项选择题（每题3分，共15分）1. 植物生物技术中，下列哪些技术可以用于植物基因功能研究？A. 基因克隆B. 基因编辑C. 基因沉默D. 基因过表达答案：ABCD2. 植物基因工程中，常用的植物表达载体元件包括：A. 启动子B. 终止子C. 选择标记基因D. 增强子答案：ABC3. 植物组织培养中，下列哪些因素会影响细胞生长和分化？A. 激素水平B. 光照条件C. 培养基成分D. 温度答案：ABCD4. 植物生物技术中，下列哪些技术可以用于植物遗传改良？A. 基因编辑B. 基因克隆C. 基因沉默D. 基因过表达答案：ABCD5. 植物基因工程中，下列哪些方法可以用于目的基因的导入？A. 农杆菌介导的转化B. 基因枪介导的转化C. 电穿孔法D. 化学诱导法答案：ABC三、判断题（每题2分，共10分）1. 植物组织培养是一种无性生殖方式。
高中基因工程试题及答案一、选择题1. 基因工程是指：A. 基因的自然选择B. 基因的人工选择C. 基因的人工重组D. 基因的自然重组答案：C2. 基因工程中常用的载体是：A. 质粒B. 病毒C. 染色体D. 线粒体答案：A3. 基因枪法属于哪种基因转移技术？A. 化学法B. 物理法C. 生物法D. 机械法答案：B4. 以下哪个不是基因工程的步骤？A. 目的基因的获取B. 目的基因的克隆C. 目的基因的表达D. 目的基因的自然选择答案：D5. 基因工程在医学领域的应用不包括：A. 基因治疗B. 基因检测C. 基因编辑D. 基因克隆答案：D二、填空题6. 基因工程的核心技术是________。
答案：重组DNA技术7. 基因工程中常用的受体细胞有________和________。
答案：大肠杆菌、酵母菌8. 基因工程在农业上的应用包括________和________。
答案：转基因作物、基因改良9. 基因工程在环境保护中的应用包括________和________。
答案：生物修复、污染物降解10. 基因工程在工业生产中的应用包括________和________。
答案：生物催化剂、生物制药三、简答题11. 简述基因工程的基本原理。
答案：基因工程的基本原理是利用分子生物学技术，将目的基因从一种生物体中提取出来，然后通过重组DNA技术将其插入到另一种生物体的基因组中，使其在新的宿主细胞中表达，从而获得具有特定性状的生物体或生产特定的生物产品。
12. 基因工程在医学领域有哪些应用？答案：基因工程在医学领域的应用包括基因治疗，通过将正常基因导入患者体内以治疗遗传性疾病；基因检测，用于疾病诊断和风险评估；基因编辑，通过修改基因序列来治疗疾病；以及生产生物药物，如胰岛素、干扰素等。
四、论述题13. 论述基因工程的伦理问题及其解决途径。
答案：基因工程的伦理问题主要包括对人类基因组的修改可能带来的未知风险、基因歧视、生物多样性的减少等。
植物基因工程真题(2011-2013)一、名词解释1. Southern blotting：是指通过吸附或电泳方法将经凝胶电泳分离的大分子物质从胶上转移到固相载体上，再与特定的探针反应从而达到检测或鉴定这些大分子物质的过程。
2. cis-acting elemen t顺式作用元件，存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列，包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等。
它们的作用是参与基因表达的调控，本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，要与反式作用因子相互作用而起作用。
3. subcloing:4. Gene libray5. Yeast Two-Hybrid Assays:6. qRT-PCR7. Shuttle plasmid vector8. insert in activati on9. cDNA library10. RNAi11. Gene kn ockout12. Tran sducti on and tran sfect ion13. DNA probe14. En zyme-li nked immuno sorbe nt assay15. Tran spositi onal recomb in ati on16. EST17. Fluoresce nee in situ hybridizati on 18. q-per 19. SNP1. Per 反应原理和步骤；基本反应过程有哪些；反应体系与反应条件？简要介绍温度和时间设臵间的关系?PCR 反应原理：DNA 的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。
双链 DNA 在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在 DNA 聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成 同样的两分子挎贝。
在实验中发现，DNA 在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。
因此，通过温度变化控制 DNA 的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP 就可以完成特定基因的体外复制。
步骤：由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA 的变性：模板DNA 经 加热至（90-96C ）左右一定时间后，使模板DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链 DNA 解离， 使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火（复性）： 模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至（ 25-65C ）左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在（70-75C ）、DNA 聚合酶（如TaqDNA 聚合酶）的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就 可获得更多的 ？半保留复制链？，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环 需2〜4分钟，2〜3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
标准的反应体系：10 X 扩增缓冲液 4种dNTP 混合物 引物 模板DNA Taq DNA 聚合酶 Mg2+加双或三烝水至5ul各 200mol/L 各 10〜100pmol 0.1 〜2 ig 1〜2 U 1.5〜2.0mmol/L 50 il反应条件：为温度、 时间和循环次数。
温度和时间设臵间的关系： 基于PCR 原理三步骤而设臵变性-退火-延伸三个温度点。
在标准反应中采用三温度点法，双链DNA 在90〜95 C 变性，再迅速冷却至 40〜60 C,引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70〜75 C,在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。
对于较短靶基因（长度为100〜300bp 时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一， 一般采用94 C 变性，65 C 左右退火与延伸（此温度Taq DNA 酶 仍有较高的催化活性）。
①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR 失败的最主要原因。
一般情况下，93 C 〜94 C lmi 足以使模板DNA 变性，若低于93 C 则需延长时间，但温度不能过高， 因为高温环境对酶的活性有影响。
此步若不能使靶基因模板或 致PCR 失败。
② 退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR 特异性的较重要因素。
变性后温度快速简单题PCR 产物完全变性，就会导冷却至40 C〜60 C,可使引物和模板发生结合。
由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。
退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。
对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55 C为选择最适退火温度的起点较为理想。
引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm 值(解链温度)=4(G+C) + 2(A+T)复性温度=Tm值-(5〜10 C)在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。
复性时间一般为30〜60sec足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：70〜80 C 15(核苷酸/S/酶分子70 C 60核苷酸/S/酶分子55 C 24核苷酸/S/酶分子高于90 C时，DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70〜75 C之间，常用温度为72 C,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb 以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。
3〜4kb的靶序列需3〜4min；扩增10Kb需延伸至15mi n。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
循环次数循环次数决定PCR扩增程度。
PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。
一般的循环次数选在30〜40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
2. 基因工程载体的构建需要考虑哪些方面的因素？主要考虑以下几方面的因素。
(1)基因的特点：如果一个来自动物的目的基因含有内含子，就不能用于转基因植物，因为动物中内含子的剪接系统与植物的不同，植物不能将动物基因的内含子剪切掉，只能用该基因的cDNA。
基因的产物如果是一个糖蛋白，那么该基因在原核生物细菌中表达出来的蛋白就可能不具备天然状态下的活性，因为糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加上的，而细菌无这些细胞器。
(2)要选择强启动子或组织特异性启动子。
启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。
如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。
(3)要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物。
3. 转录因子包括什么主要的功能结构域？其主要的结构特点与功能是什么？作为蛋白质的转录因子从功能上分析其结构可包含有不同区域：①DNA结合域(DNA binding domain),多由60-100个氨基酸残基组成的几个亚区组成；②转录激活域( activating domain),常由30-100氨基酸残基组成，这结构域有富含酸性氨基酸、富含谷氨酰胺、富含脯氨酸等不同种类，一酸性结构域最多见；③连接区，即连接上两个结构域的部分。
不与DNA直接结合的转录因子没有DNA结合域，但能通过转录激活域直接或间接作用与转录复合体而影响转录效率。
与DNA结合的转录因子大多以二聚体形式起作用，与DNA结合的功能域常见有以几种：①螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）及螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix，HLH）这类结构至少有两个a螺旋其间由短肽段形成的转角或环连接，两个这样的motif结构以二聚体形式相连，距离正好相当于DNA 一个螺距（3.4nm）两个a螺旋刚好分别嵌入DNA的深沟。
②锌指（zincfinger）其结构如图所示，每个重复的？指?状结构约含23个氨基酸残基，锌以4个配价键与4个半胱氨酸、或2个半胱氨酸和2个组氨酸相结合。
整个蛋白质分子可有2-9个这样的锌指重复单位。
每一个单位可以其指部伸入DNA双螺旋的深沟，接触5个核苷酸。
例如与GC盒结合的转录因子SP1中就有连续的3个锌指重复结构。
③碱性-亮氨酸拉链（basic leucine zipper, bZIP ）这结构的特点是蛋白质分子的肽链上每隔6个氨基酸就有一个亮氨酸残基，结果就导致这些亮氨酸残基都在a螺旋的同一个方向出现。
两个相同的结构的两排亮氨酸残基就能以疏水键结合成二聚体，这二聚体的另一端的肽段富含碱性氨基酸残基，借其正电荷与DNA双螺旋链上带负电荷的磷酸基团结合。
若不形成二聚体则对DNA的亲和结合力明显降低。
在肝脏、小肠上皮、脂肪细胞和某些脑细胞中有称为C/EBP 家族的一大类蛋白质能够与CAAT盒和病毒增强子结合，其特征就是能形成bZIP二聚体结构。
4. 当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施？为什么？注意星活性（所谓星活性又称Star活性。
是指由于反应条件不同而产生的切断与原来认识序列不同的位点的现象，也就是说产生Star活性后，不但可以切断特异性的识别位点，还可以切断非特异性的位点。
产生Star活性的结果是酶切条带增多。
），先低盐，后高盐；先低温酶，后高温酶；并且可以直接在换酶前将第一种酶失活，再加第二种酶，否则，易产生星活性。
或使用通用缓冲液。
5. 对天然质粒的人工构建主要表现在哪些方面？天然质粒往往存在着缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造构建：A,加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择，通常是抗生素基因。
B，增加或减少合适的酶切位点，便于重组。
C，缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量。
D，改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝。
E,根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件。
6双向电泳的主要步骤和原理.双向电泳是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照蛋白的pl分离），然后再进行SDS-PAGE （按照蛋白的分子量大小分离），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。
实验步骤：第一向等电聚焦1）从冰箱中取-20 C冷冻保存的水化上样缓冲液（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml/管），臵室温溶解。
2）在小管中加入0.01g DTT，Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml，充分混匀。
3）从小管中取出400ml水化上样缓冲液，加入100ml样品，充分混匀。
4）从冰箱中取-20 C冷冻保存的IPG预制胶条（17cm pH 4-7）,室温中放臵10分钟。
