植物基因工程PPT课件

第一节 植物基因的克隆与分离
一、根据基因的功能分离目的基因 从蛋白到DNA
一种比较有效的分离高等植物基因的策略， 它涉及目的基因编码产物蛋白质的分离、纯化 及突变体表型的互补克隆。
在纯化相应的编码蛋白后，构建cDNA或基因组， DNA中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行：
(1) 将纯化的蛋白质进行氨基酸测序技术、cDNA代表性差示分析（RDA）
1. mRNA差减杂交(scDNA克隆
根据不同材料mRNA种类的差别分离目的基因。只适用于缺失突变 体，在很大程度上受生物体核DNA复杂性的影响，而且又存在着实 验周期长、重复性差、效率低等缺点。1992年，美国哈佛大学的 F.M.Ausubel实验室，应用该法从拟南芥菜中克隆到了一个与植物茎 杆高度相关的基因，这可能是已见报道的为数不多的典型例子之一。
用内源转位子分离同源寄主基因的技术 异源转位子标签法(hetrologous transposon tagging)
1.转座子标签法（Transposon tagging）
转座的结果是使被转入的基因失活，从而有效地诱导产生 表型突变株。然后构建一个对应于突变株的基因库，用作标 签的转座子作为探针从基因库中筛选相对应的克隆，分离得 到相对应于变异的基因，这就是转座子标签克隆基因。
同源转位子标签法(homologous transposon tagging)：
三、根据DNA的插入作用分离目的基因
当一段特定的DNA序列，插入到植物基因组中目的基因的 内部或其邻近位点时，便会诱发该基因发生突变，并最终导 致表型变化，形成突变体植株。如果此段DNA插人序列是 已知的，那么它便可用来作为DNA杂交因A序列相 当于人为地给目的基因加上一段已知的序列标签，因此 DNA插入突变分离基因的技术，又叫做DNA标签法(DNAtagDgiNnAg)标。签法克隆植物组织中的基因是较为常用的一种方 法，T-DNA（T-DNA tagging）和转座子（transposon tagging）均可作为基因标签。
(2) 将相应的编码蛋白制成相应抗体探针，从cDNA入载体表达库 中筛选相应克隆。
但在任何类型的细胞中，都仅有少数的基因表达成相应的蛋 白质，而且其表达活性和种类还会随着发育阶段及环境因素的 变化而变化。因而单从蛋白质水平出发分离目的基因，显然是 存在着相当的难度和一定的局限性。
二、根据mRNA特异分离目的基因
植物基因工程
转基因植物(Transgene plant)是拥有来自其 他物种基因的植物。该基因变化过程可以来自 不同物种之间的杂交，但现在该名词更多的特 指那些在实验室里通过重组DNA技术人工插 入其他物种基因以创造出拥有新特性的植物。
第一节 植物基因的克隆与分离 第二节 植物基因工程研究常用的基因 第三节 植物基因转移的病毒载体 第四节 植物基因转移的质粒载体 第五节 植物基因转化方法 第六节 转基因植物的检测鉴定
Neurospheres (NS) are cultured by the usual methods. Sister cultures are differentiated for 24 hours and each are subjected to representational difference analysis (RDA) with two rounds of subtraction. The subtracted products are then cloned into plasmids, propagated in bacteria, and arrayed at high density onto a glass slide. The custom microarray is then screened with amplified complementary DNA derived from a different set of neurosphere and differentiating cell (DC) cultures. The genes that are verified to be enriched in neurosphere cultures are then subjected to sequence analysis and further screening by in situ hybridization. Cy3 and Cy5 are green and red fluorescent dyes, respectively. bFGF, basic fibroblast growth factor; E17, embryonic day 17; P0, day of birth; P1 ctx, postnatal day 1 cortex.
2. mRNA差别显示的技术
1993年，由美国波斯顿Dena-Farber癌症研究所工作的两位科学 家P.Liang和A.D.Pardee建立。
3. cDNA代表性差示分析(representational difference analysis) 技术， cDNA RDA
1994年 M.Huband和D. G.Scatz在N.Lisitsyn 等人的基 础上，发展了一种用于克隆差别 表达的基因的方法。此法保留了 差减杂交和差别显示的精髓，并 充分发挥了PCR反应以指数形 式扩增双键模板而仅以线性形式 扩增单链模板这一特性，并通过 降低cDNA群体复杂性和多次更 换cDNA两端接头等方法，特异 地扩增目的基因片段。现已被广 泛地应用于分离编码产与未知的 发育基因。