高中生物论文解读限制性核酸内切酶应用的考点例析人教版

限制性内切酶考点盘查限制性内切酶是基因工程中最难把握的知识点，高考中对这种酶的考察特别重视，我们有必要对相关的知识先进行归纳，才有利于解答试题。

1 限制性核酸内切酶的基本知识①来源及化学本质:主要是从原核生物中分离纯化出来的。

化学本质为蛋白质。

②作用：催化作用，可用于DNA的切割获取目的基因和载体的切割，切割的化学键为磷酸二酯键。

③作用特点：特异性,即限制酶可识别特定的脱氧核苷酸序列,切割特定位点。

④切割方式：错位切--产生两个相同的黏性末端，平切--形成平末端。

如果是错位切则将一个基因从DNA分子上切割下来,需要破坏4个磷酸二酯键,同时产生4个黏性末端，增加4个游离的磷酸基团。

2 限制性核酸内切酶的难点解析2.1 目的基因切割要点归纳①要把目的基因切割下来需要在目的基因的两边都进行切割，但绝对不可以破坏目的基因的结构。

②切割目的基因的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。

③切割产生的末端有三种情况：都是平末端、都是粘性末端、一边是粘性末端，一边是平末端。

2.2 质粒切割要点归纳①质粒的切割可以切一个切口，也可以切两个切口。

如果是一个切口，则连接时可能会产生一些我们不需要的连接物(如自身环化等)；如果是两个切口则质粒会丢失一段DNA片段，但可以控制连接物就是我们需要的目的基因和质粒的连接。

切割时注意不要破坏了载体上的标记基因（至少保留有一个标记基因）、终止子、启动子、复制原点等。

②切割质粒的酶可以用同一种限制酶，也可以用两种不同的限制酶。

③切割产生的末端有三种情况：都是平末端，都是粘性末端，一边是粘性末端，一边是平末端。

2.3 限制性核酸内切酶的说明不同的酶识别序列一般不同，但也有识别序列相同的。

如果识别序列相同，切割点也相同则切割产生的粘性末端一样。

一种酶的识别序列中可能包含另外一种酶的识别序列，切割时可以产生相同的粘性末端。

不同的酶识别的序列一般不同，但有时也可能相同，这时切割产生的粘性末端也相同。

5.DNA 酶 切 位 点 没 有 甲 基 化
( 如 Dpn1) 6.DNA 位点上存在其它修饰 7.DNA 不存在该酶识别顺序
验证
二 . 如果 DNA 切割不完全？ 1. 内切酶活性下降 2. 内切酶稀释方法不正确 3.DNA 不纯，反应条件不佳 4. 内 切 酶 识 别 的 DNA 位 点 上 的 碱 基 被 甲 基 化 或 存 在其它修饰 5. 部分 DNA 溶液粘在管壁上 6. 内切酶溶液粘度大，取样不准 7. 酶切后 DNA 粘性末端退火 8. 由于反应溶液、温度使内切酶变性 9. 过度稀释使酶活性降低

应用二
利用pBR322作为载体重组人体的抑生长激素也是一 个经常提到的应用例子。其过程和水稻叶绿体基因重组 大同小异，只是除了在质粒载体上插入抑生长激素基因 外，还将含有lac操纵子起始部分的片段（包括启动子， 操作区，核糖体集合位点和β-半乳糖苷酶的主要部分） 插在抑生长激素基因的旁边。由于有了lac操作子的控 制，重组基因产生的蛋白质的调节就变得比较容易了
限制性核酸内切酶切割原理、
方法、结果分析及应用
PPT制作：杜雨濛、张佳佳、陈靓
课堂内容回顾：
1、定义： 1、定义：限制性核酸内切酶是可以识别特 定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的 两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一 类酶，简称限制酶。 2、分类：
（根据酶的基因、蛋 白质结果、依赖的辅 助因子及DNA裂解的 特异性，将限制性内 切酶分为三种类型）
解决方法 1. 用 5-10 倍量过量消化 2. 用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶 3. 同上 4. 同上
5. 反应前离心数秒
6. 将内切酶稀释，增大取样体积 7. 电泳前将样品置 65 ℃保温 5-10 分钟，取出 后置冰浴骤冷 8. 使用标准反应缓冲液及温度 9. 适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏 10. 使用最佳反应体系

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II型限制性内切酶的分类（一）
❖
内切酶中最普遍的是象Hha I、Hind III和
Not I这样在识别序列中进行切割的酶。这一类
酶是构成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都
以同二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的
是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到
DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连续的
位的内切酶可以切割1μg不同来源和纯度的DNA。 通常，一个50μl的反应体系中，1μl的酶在1X Buffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降 解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可 相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶 来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完 全反应。
II型限制性内切酶的分类（二）
❖
IIS型酶，比如Fok I和Alw I，它们在识别位点之外切开
DNA。这些酶的大小居中，约为400-650个氨基酸左右；它们
识别连续的非对称序列，有一个结合识别位点的域和一个专门
切割DNA的功能域。一般认为这些酶主要以单体的形式结合到
DNA上，但与临近的酶结合成二聚体，协同切开DNA链。因此
序列的功能域构成C端，或以独立的亚基形式存在。
当这些酶与底物结合时，它们或行使限制性内切酶的
功能切开底物，或作为修饰酶将其甲基化。
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一些概念
❖粘末端和平末端 ❖同尾酶 ❖同裂酶 ❖同识异切酶 ❖消化 ❖星号活力
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同裂酶和同尾酶：
同裂酶： 有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺
段丢失了可被Mst II或CvnⅠ切开的一个限
制性内切酶位点。由于基因突变改变了限制 性酶切的结果，用Southern blot分析方法 和限制性片段长度多态性（简称RFLP）分析 方法即可对镰刀型红细胞贫血症胎儿做产前 诊断，或对发病家族成员的基因组型进行分 析。

解读《限制性核酸内切酶应用的考点例析》我们知道限制性核酸内切酶（限制酶）是指能识别DNA中特定碱基顺序，并在特定位点切割双链DNA的核酸内切酶。

它在生物学中应用相当广泛，是基因工程中的工具酶，用来构建重组DNA分子，对于遗传性疾病的基因定位和基因诊断的研究也具有重要的应用价值。

下面我们以问题的形式简要地了解它在这些方面的应用。

1。

限制酶的特点例1．下面哪项不具有限制酶识别序列的特征（）A．GAATTC B．GGGGCCCC C．CTGCAG D．CTAAATCCTTAAG CCCCGGGG GACGTC GATTTAG解析：限制酶识别的各种序具有回文对称的特点。

所谓回文对称序列就是当以不同的方向分别阅读DNA的两条互补链时，DNA的两条链上的碱基序列相同。

如A中的DNA分子，其中一条链从左向右阅读碱基序列是GAATTC，另一条互补链从右向左阅读碱基序列也是GAATTC。

答案：D例2．限制酶HindⅢ酶切DNA的识别序列是AAGCTT，限制酶HpaⅡ酶切DNA的识别序列是CCGG。

假定DNA分子中A、T、G、C所含的比例相等，那么，限制酶HindⅢ酶切割双链DNA的概率是，酶切位点间的平均距离约kb（千碱基）；限制酶HpaⅡ酶切割双链DNA的概率是，酶切位点间的平均距离约kb。

解析：因为限制酶识别序列具有回文对称序列的特点，这两个序列在相应的互补链上又会呈现，因此我们只需考虑DNA的一条链即可。

六碱基长HindⅢ识别序列AAGCTT出现的概率是（1/4）6或1/4096，因此HindⅢ酶切位点之间的平均距离大约为4 kb。

同样的道理，4碱基长的HpaⅡ酶识别序列CCGG出现的概率是（1/4）4或1/256，因此HpaⅡ酶切位点的平均距离大约为kb。

2．黏性末端与限制酶类型的关系例3．用同一种限制酶处理会产生相同的黏性末端，但用不同的限制酶处理也可能产生相同的黏性末端。

下列所示的四个黏性末端是由（）种限制酶作用产生的。

第三章基因工程第一节重组DNA技术的基本工具基因工程：指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。

从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫重组DNA技术。

一、分子手术刀—限制性内切核酸酶1.全称和简称全称：_限制性内切核酸酶_简称：__限制酶_2.来源：主要是从_原核生物__中分离纯化出来的3.作用：①能够识别_双链_DNA分子的某种_特定核苷酸序列。

①使_每一条_链中_特定部位_的_磷酸二酯键__断开。

4.作用部位：_磷酸二酯键__5.识别序列：大多数限制酶的识别序列由_6_个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由_4_个、_8_个或__其他数量_的核苷酸组成。

6.切割结果：DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式__黏性末端_和__平末端__。

（1）EcoR①限制酶切割EcoR①识别序列为GAATTCEcoR①切割部位为GA之间的磷酸二酯键（2）Sma①限制酶切割Sma①识别序列为CCCGGGSma①切割部位为CG之间的磷酸二酯键二、分子缝合针—DNA连接酶1.功能：将__两个DNA片段连接起来_，恢复被限制酶切开的_磷酸二酯键__。

2.种类E·coli DNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体特点只缝合黏性末端缝合黏性末端平末端作用恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键3名称作用部位作用底物作用结果限制酶磷酸二酯键DNA将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键DNA片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶或热稳定DNA聚合酶磷酸二酯键脱氧核苷酸将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端DNA(水解)酶磷酸二酯键DNA将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键DNA将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链RNA聚合酶磷酸二酯键核糖核苷酸将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端三、分子运输车——载体1.作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。

定义和命名
DNA限制性内切酶： 生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸 酶。它可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA 的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这 样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在 DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。 限制性核酸内切酶的命名；一般是以微生物属名的第一个字母 和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)。例 如，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性 内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基 顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、 HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。
2.限制与修饰系统的种类 根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制 与修饰系统主要分成三大类。表 2-1 是各种限制与修饰系统的比较。 Ⅱ 型（type Ⅱ）限制与修饰系统所占的比例最大，达 93% 。Ⅱ 型酶相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近 切割 DNA ，产生带 3'- 羟基和 5'- 磷酸基团的 DNA 产物，需 Mg2+ 的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需 SAM 。识别序列主要为 46bp ，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或 简并序列，切割位置因酶而异，有些是隔开的。 Ⅱs 型（type Ⅱs）限制与修饰系统，占 5% ，与 Ⅱ 型具有相似 的辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断的，长度为 4-7bp ， 切割位点可能在识别位点一侧的 20bp 范围内。 Ⅱ 型限制酶一般是同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相 反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在 DNA 链的两 个互补位点上。修饰酶是单体，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成， 分别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的。 在 Ⅱ 型限制酶中还有一类特殊的类型，该酶只切割双链 DNA 中的 一条链，造成一个切口，这类限制酶也称切口酶 （nicking enzyme）， 如 N.Bst NBI 。

简析限制性内切酶限制性内切酶（即限制酶）是基因工程中的必用操作工具之一。

基因工程是近年来高考中的热点，而对于限制酶的考查也是历年高考题中的常考知识点。

1限制酶的作用及影响因素1.1 作用：切割特定的核苷酸序列[高考赏析]（2008，全国I）已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指，如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。

现在多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是（）A.3B.4C.9D. 12【答案】C【解析】：每一种限制性内切酶切割DNA后会留下特征性的粘性末端，同时一次切割后，会把DNA分割成两个片段，且不同的内切酶切后的片段不一样。

若在3个酶切点切断，得到4种长度不同的DNA片段；若在2个酶切点切断，得到3种长度不同的DNA片段；若在1个酶切点切断，得到2种长度不同的DNA片段。

因此最多能产生4+3+2=9种长度不同的DNA分子。

1.2 作用结果：形成DNA片段末端黏性末端：错位切，切下后的两端形成一种回文式的单链末端。

平末端：平切，在两条链的特定序列的相同部位切割，形成一个无黏性末端的平口。

[高考赏析]（2008，江苏）将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。

以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表。

请根据以下图表回答下列问题。

（1）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是。

（2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。

表1为根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。

请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？__________。

（3）图1步骤③所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列是否有专一性要求？。

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14、谁要是自己还没有发展培养和教育好，他就不能发展培养和教育别人。2021年8月25日星期三上午4时35分33秒04:35:3321.8.25
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基因工程
一、基因工程的基本工具
（1）基因的“剪刀”：限制性核酸内切酶
↓ 限制酶
GA A T T C
CT T A A G
↓
一、基因工程的基本工具
（1）基因的“剪刀”：限制性核酸内切酶
↓ 限制酶
GA A T T C
CT T A A G 切割磷酸二酯键
↓
一、基因工程的基本工具
（1）基因的“剪刀”：限制性核酸内切酶
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17、儿童是中心，教育的措施便围绕他们而组织起来。上午4时35分33秒上午4时35分04:35:3321.8.25
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You have to believe in yourself. That's the secret of success. 人必须相信自己，这是成功的秘诀。

限制性内切酶在生物传感器中的优势：高特异性、高灵敏度、操作简便等
基因组测序：限制性内切酶在DNA片段的精确切割中起到关键作用，是基因组测序的基础步骤之一。
分子生物学研究：限制性内切酶在分子生物学研究中用于制备特定DNA片段，是基因克隆、基因表 达和基因功能研究的重要工具。
生物技术药物开发：限制性内切酶在生物技术药物开发中用于对目的基因进行精确的切割和调控， 从而实现基因治疗和基因疫苗等创新药物的开发。
在基因表达研究中的应 用：通过限制性内切酶 对基因进行切割，可以 研究基因的表达调控机 制。
在疾病诊断中的应用： 限制性内切酶可以用于 检测特定的基因突变或 变异，有助于疾病的早 期诊断。
在个性化医疗中的应用： 限制性内切酶可以用于 编辑患者的基因，为个 性化医疗提供技术支持。
限制性内切酶在基 因编辑技术中的应 用，如CRISPRCas9系统，可用 于创建疾病模型， 以研究疾病的发病 机制和治疗方法。
合成生物学：限制性内切酶在合成生物学领域中用于设计和构建人工生物系统，从而实现精确控制 细胞代谢和行为的目的。
PART SIX
伦理问题：基因编辑技术可能引发人类基因库的污染，对人类生命尊严和伦理道德造成威胁。
法律问题：基因编辑技术可能违反法律法规，对人类基因库的改变和干预需要得到相关部门的 批准和监管。
责任问题：基因编辑技术可能引发责任问题，例如对基因编辑技术的滥用、误用等行为需要承 担相应的法律责任。
透明度问题：基因编辑技术需要公开透明，对技术的使用和结果需要向公众和相关部门进行报 告和公示。
安全性问题：限制性内切酶在基因 治疗中的使用可能引发不可预测的 副作用和风险
法律问题：限制性内切酶的使用和基 因治疗的应用需要遵守相关法律法规 和伦理准则，以确保安全性和合法性

二.如果DNA切割不完全？ 1.内切酶活性下降 2.内切酶稀释方法不正确 3.DNA不纯，反应条件不佳 4.内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其 它修饰 5.部分DNA溶液粘在管壁上 6.内切酶溶液粘度大，取样不准 7.酶切后DNA粘性末端退火 8.由于反应溶液、温度使内切酶变性 9.过度稀释使酶活性降低 10.反应条件不适
通过 使 用 (15 种 )限 制 性 内 切 酶 酶 切 重 组质 粒，说明限制性内切酶的应用和限制性内切酶酶
切图谱分析的方法o
方法：
1.质粒的构建 采用聚合酶链反应chainreaction，PCR)方法扩增出 MLCKcDNA
片段，插入质粒 pBKrsv中，构建成 pBKrsv-MLCK 重组质粒
Ⅲ型酶：与Ⅰ型酶一样，具有限制3、与命修名饰活：性，其切割位点很难预测。
规则： 第一个字母（大写）：取自该酶的细胞属名 第二、三个字母（小写）：该细胞的种名 第四个字母（罗马数字）：代表同一菌株中 不同限制性内切酶的编号
例如：EcoRⅠ、HindⅢ 等等
限制性核酸内切酶切割原理1来自Ⅰ类和Ⅲ类酶： 在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于
大家好
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限制性核酸内切酶切割原理、 方法、结果分析及应用
课堂内容回顾：
1、定义： 1、定义：限制性核酸内切酶是可以识别特
定的核苷酸序列，并在每条链中特定部位的 两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一 类酶，简称限制酶。
2、分类：
（根据酶的基因、蛋 白质结果、依赖的辅 助因子及DNA裂解的 特异性，将限制性内 切酶分为三种类型）
实验中可能出现的 问题及其讨论
一 . 如 果 DNA 完 全 没 有 被 内 切 酶切割？

限制性核酸内切酶在分子生物学中扮演着重要角色，它们能够识别特定的DNA序列并在特定位置进行切割。这些酶的活性受温度影响，且能识别和切割特定的DNA序列。在基因工程中，限制性核酸内切酶被广泛应用于切割目的基因和载体，以便于后续的基因重组操作。通过选择不同的限制性核酸内切酶，可某种限制性核酸内切酶切割后可能产生40bp和60bp两种长度的DNA片段，而另一种酶则可能产生20bp和60bp的片段。通过合理选择和组合这些酶，科学家们能够精确地操控DNA分子，实现基因的高效表达和调控。此外，限制性核酸内切酶还可用于分析DNA分子的结构和功能，为分子生物学研究提供有力工具。

生物选修三知识点之答禄夫天创作专题1 基因工程基因工程的概念基因工程是指依照人们的愿望,进行严格的设计,通过体外DNA重组和转基因技术,赋予生物以新的遗传特性,缔造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产物.基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的,又叫做DNA重组技术.（一）基因工程的基本工具1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的.（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,而且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,因此具有专一性.（3）结果：经限制酶切割发生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端.2.“分子缝合针”——DNA连接酶(1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比力：①相同点：都缝合磷酸二酯键.②区别：E·coliDNA连接酶来源于T4噬菌体,只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端,但连接平末真个之间的效率较低. (2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端,形成磷酸二酯键.DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端,形成磷酸二酯键.3.“分子运输车”——载体（1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保管.②具有一至多个限制酶切点,供外源DNA片段拔出.③具有标识表记标帜基因,供重组DNA的鉴定和选择.（2）最经常使用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、自力于细菌染色体之外,并具有自我复制能力的双链环状DNA分子.（3）其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒(二)基因工程的基本把持法式目的基因的获取第一步：目的基因是指：1.编码卵白质的结构基因.2.原核基因采用直接分离获得,真核基因是人工合成.人工合成目的基因的经常使用方法有反转录法_和化学合成法_.3.PCR技术扩增目的基因（1）原理：DNA双链复制（2）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃,引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃,热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成.第二步：基因表达载体的构建1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在,而且可以遗传至下一代,使目的基因能够表达和发挥作用.2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标识表记标帜基因（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需的卵白质.（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的尾端.（3）标识表记标帜基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来.经常使用的标识表记标帜基因是抗生素基因.第三步：将目的基因导入受体细胞_1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内,而且在受体细胞内维持稳定和表达的过程.2.经常使用的转化方法：将目的基因导入植物细胞：采纳最多的方法是农杆菌转化法,其次还有基因枪法和花粉管通道法等.将目的基因导入植物细胞：最经常使用的方法是显微注射技术.此方法的受体细胞多是受精卵.将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少,最经常使用的原核细胞是年夜肠杆菌 ,其转化方法是：先用 Ca2+ 处置细胞,使其成为感受态细胞,再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下增进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程.3.重组细胞导入受体细胞后,筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标识表记标帜基因是否表达.第四步：目的基因的检测和表达1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否拔出了目的基因,方法是采纳 DNA分子杂交技术.2.其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA,方法是采纳用标识表记标帜的目的基因作探针与 mRNA杂交.3.最后检测目的基因是否翻译成卵白质,方法是从转基因生物中提取卵白质,用相应的抗体进行抗原－抗体杂交.4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定.如转基因抗虫植物是否呈现抗虫性状.（三）基因工程的应用1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物,利用转基因改良植物的品质.2.植物基因工程：提高植物生长速度、改善畜产物品质、用转基因植物生产药物.3.基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内,使该基因表达产物发挥作用.（四）卵白质工程的概念卵白质工程是指以卵白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础,通过基因修饰或基因合成,对现有卵白质进行改造,或制造一种新的卵白质,以满足人类的生产和生活的需求.（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的卵白质）转录翻译专题2 细胞工程（一）植物细胞工程1.理论基础（原理）：细胞全能性全能性表达的难易水平：受精卵＞生殖细胞＞干细胞＞体细胞；植物细胞＞植物细胞2.植物组织培养技术（1）过程：离体的植物器官、组织或细胞―→愈伤组织―→试管苗―→植物体（2）用途：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产.（3）位置：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序.3.植物体细胞杂交技术（1）过程：（2）诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电安慰等.化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂.（3）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍.（二）植物细胞工程1. 植物细胞培养（1）概念：植物细胞培养就是从植物机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和繁殖.（2）植物细胞培养的流程：取植物组织块（植物胚胎或幼龄植物的器官或组织）→剪碎→用胰卵白酶或胶原卵白酶处置分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰卵白酶或胶原卵白酶处置分散成单个细胞继续传代培养.（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上,称为细胞贴壁.细胞数目不竭增多,当贴壁细胞分裂生长到概况相互抑制时,细胞就会停止分裂增殖,这种现象称为细胞的接触抑制.（4）植物细胞培养需要满足以下条件①无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处置.通常还要在培养液中添加一定量的抗生素,以防培养过程中的污染.另外,应按期更换培养液,防止代谢产物积累对细胞自身造成危害.②营养：合成培养基成份：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等.通常需加入血清、血浆等天然成份.③温度：适宜温度：哺乳植物多是36.5℃＋0.5℃；p H：7.2～7.4.④气体环境：95%空气＋5%CO2.O2是细胞代谢所必需的,CO2的主要作用是维持培养液的pH.（5）植物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞.2.植物体细胞核移植技术和克隆植物（1）哺乳植物核移植可以分为胚胎细胞核移植（比力容易）和体细胞核移植（比力难）.（2）选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞比力年夜,容易把持；卵(母)细胞细胞质多,营养丰富.（3）体细胞核移植的年夜致过程是：（右图）核移植胚胎移植（4）体细胞核移植技术的应用：①加速家畜遗传改良进程,增进良畜群繁育；②呵护濒危物种,增年夜存活数量；③生产珍贵的医用卵白；④作为异种移植的供体；⑤用于组织器官的移植等.（5）体细胞核移植技术存在的问题：克隆植物存在着健康问题、暗示出遗传和生理缺陷等.3.植物细胞融合（1）植物细胞融合也称细胞杂交,是指两个或多个植物细胞结合形成一个细胞的过程.融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞,称为杂交细胞.（2）植物细胞融合与植物原生质体融合的原理基秘闻同,诱导植物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似,经常使用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电安慰等.（3）植物细胞融合的意义：克服了远缘杂交的不亲和性,成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段.（1）抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体.从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差.（2）单克隆抗体的制备过程：简易、快速的优点.②用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗,可制成“生物导弹”,也有少量用于治疗其它疾病.专题3 胚胎工程（一）植物胚胎发育的基本过程1、胚胎工程是指对植物早期胚胎或配子所进行的多种显微把持和处置技术,如胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术.经过处置后获得的胚胎,还需移植到雌性植物体内生产后代,以满足人类的各种需求.2、植物胚胎发育的基本过程（1）受精场所是母体的输卵管上段.（2）卵裂期：特点：细胞有丝分裂,细胞数量不竭增加,但胚胎的总体体积其实不增加,或略有减小.（3）桑椹胚：特点：胚胎细胞数目到达32个左右时,胚胎形成致密的细胞团,形似桑椹.是全能细胞.（4）囊胚：特点：细胞开始呈现分化（该时期细胞的全能性仍比力高）.聚集在胚胎一端个体较年夜的细胞称为内细胞团,将来发育成胎儿的各种组织.中间的空腔称为囊胚腔.（5）原肠胚：特点：有了三胚层的分化,具有囊胚腔和原肠腔.（二）胚胎干细胞1、哺乳植物的胚胎干细胞简称ES或EK细胞,来源于早期胚胎或从原始性腺中分离出来.2、具有胚胎细胞的特性,在形态上暗示为体积小,细胞核年夜,核仁明显；在功能上,具有发育的全能性,可分化为成年植物体内任何一种组织细胞.另外,在体外培养的条件下,可以增殖而不发生分化,可进行冷冻保管,也可进行遗传改造.3、胚胎干细胞的主要用途是：①可用于研究哺乳植物个体发生和发育规律；②是在体外条件下研究细胞分化的理想资料,在培养液中加入分化诱导因子,如牛黄酸等化学物质时,就可以诱导ES细胞向分歧类型的组织细胞分化,这为揭示细胞分化和细胞凋亡的机理提供了有效的手段；③可以用于治疗人类的某些顽疾,如帕金森综合症、少年糖尿病等；④利用可以被诱导分化形成新的组织细胞的特性,移植ES细胞可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能；⑤随着组织工程技术的发展,通过ES细胞体外诱导分化,定向培育出人造组织器官,用于器官移植,解决供体器官缺乏和器官移植后免疫排斥的问题.（三）胚胎工程的应用1.体外受精和胚胎的早期培养(1)卵母细胞的收集和培养：主要方法：用促性腺激素处置,使其排出更多的卵子,然后,从输卵管中冲取卵子,直接与获能的精子在体外受精.第二种方法：从刚屠宰母畜的卵巢中收集卵母细胞；第三种方法是借助超声波探测仪、腹腔镜等直接从活体植物的卵巢中吸取卵母细胞.收集的卵母细胞,都要在体外经人工培养成熟后,才华与获能的精子受精.(2) 精子的收集和获能：在体外受精前,要对精子进行获能处置.(3) 受精：获能的精子和培养成熟的卵细胞在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精过程.(4)胚胎的早期培养：精子与卵子在体外受精后,应将受精卵移入发育培养液中继续培养,以检查受精状况和受精卵的发育能力.培养液成份较复杂,除一些无机盐和有机盐外,还需添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成份,以及血清等物质.当胚胎发育到适宜的阶段时,可将其取出向受体移植或冷冻保管.分歧植物胚胎移植的时间分歧.(牛、羊一般要培育到桑椹胚或囊胚阶段才华进行移植,小鼠、家兔等实验植物可在更早的阶段移植,人的体外受精胚胎可在8~16个细胞阶段移植.)2.胚胎移植(1)胚胎移植是指将雌性植物的早期胚胎,或者通过体外受精及其它方式获得的胚胎,移植到同种的、生理状态相同的其它雌性植物的体内,使之继续发育为新个体的技术.其中提供胚胎的个体称为“供体”,接受胚胎的个体称为“受体”.（供体为优良品种,作为受体的雌性植物应为罕见或存量年夜的品种.）位置：如转基因、核移植,或体外受精等任何一项胚胎工程技术所生产的胚胎,都必需经过胚胎移植技术才华获得后代,是胚胎工程的最后一道“工序”.(2) 胚胎移植的意义：年夜年夜缩短了供体自己的繁殖周期,充沛发挥雌性优良个体的繁殖能力.(3) 生理学基础：①植物发情排卵后,同种植物的供、受体生殖器官的生理变动是相同的.这就为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境.②早期胚胎在一按时间内处于游离状态.这就为胚胎的收集提供了可能.③受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应.这为胚胎在受体的存活提供了可能.④供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系,但供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响.(4) 基本法式主要包括：①对供、受体的选择和处置.选择遗传特性和生产性能优秀的供体,有健康的体质和正常繁殖能力的受体,供体和受体是同一物种.并用激素进行同期发情处置,用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处置.②配种或人工授精.③对胚胎的收集、检查、培养或保管.配种或输精后第7天,用特制的冲卵装置,把供体母牛子宫内的胚胎冲刷出来(也叫冲卵).对胚胎进行质量检查,此时的胚胎应发育到桑椹或胚囊胚阶段.直接向受体移植或放入－196℃的液氮中保管.④对胚胎进行移植.⑤移植后的检查.对受体母牛进行是否妊娠的检查.3.胚胎分割(1)概念：是指采纳机械方法将早期胚胎切割2等份、4等份等,经移植获得同卵双胎或多胎的技术.(2)意义：来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质,属于无性繁殖.(3)资料：发育良好,形态正常的桑椹胚或囊胚.（桑椹胚至囊胚的发育过程中,细胞开始分化,但其全能性仍很高,也可用于胚胎分割.）(4)把持过程：对囊胚阶段的胚胎分割时,要将内细胞团均等分割,否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育.专题4 生物技术的平安性和伦理问题（一）转基因生物的平安性争论：(1)基因生物与食物平安：反方观点：反对“实质性同等”、呈现滞后效应、呈现新的过敏原、营养成份改变正方观点：有平安性评价、科学家负责的态度、无实例无证据(2)转基因生物与生物平安：对生物多样性的影响反方观点：扩散到种植区之外酿成野生种类、成为入侵外来物种、重组出有害的病原体、成为超级杂草、有可能造成“基因污染”正方观点：生命力有限、存在生殖隔离、花粉传布距离有限、花粉存活时间有限(3)转基因生物与环境平安：对生态系统稳定性的影响反方观点：打破物种界限、二次污染、重组出有害的病原微生物、毒卵白等可能通过食物链进入人体正方观点：不改变生物原有的分类位置、减少农药使用、呵护农田土壤环境（二）生物技术的伦理问题(1)克隆人：两种分歧观点,大都人持否定态度.否定的理由：克隆人严重违反了人类伦理品德,是克隆技术的滥用；克隆人冲击了现有的婚姻、家庭和两性关系等传统的伦理品德观念；克隆人是在人为的制造在心理上和社会位置上都不健全的人.肯定的理由：技术性问题可以通过胚胎分级、基因诊断和染色体检查等方法解决.不成熟的技术也只有通过实践才华使之成熟.中国政府的态度：禁止生殖性克隆,不反对治疗性克隆.四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人的实验.(2)试管婴儿：两种目的试管婴儿的区别两种.分歧观点,大都人持认可态度.否定的理由：把试管婴儿看成人体零配件工厂,是对生命的不尊重；早期生命也有活下去的权利,抛弃或杀死过剩胚胎,无异于“谋杀”.肯定的理由：解决了不育问题,提供骨髓中造血干细胞救治患者最好、最快捷的方法,提供骨髓造血干细胞其实不会对试管婴儿造成损伤.(3)基因身份证：否定的理由：个人基因资讯的泄漏造成基因歧视,势必造成遗传学失业年夜军、造成个人婚姻困难、人际关系疏远等严重后果.肯定的理由：通过基因检测可以及早采用预防办法,适时进行治疗,到达挽救患者生命的目的.（三）生物武器(1)种类：致病菌、病毒、生化毒剂,以及经过基因重组的致病菌.(2)散布方式：吸入、误食、接触带菌物品、被带菌昆虫叮咬等.(3)特点：致病力强、大都具沾染性、沾染途径多、污染面广、有潜伏期、不容易被发现、危害时间长等.(4)禁止生物武器公约及中国政府的态度不发展、不生产、不贮存生物武器,并反对生物武器及其技术和设备的扩散.专题5 生态工程1．生态原理2．生态工程实例分析3.受损生态环境的重要作用的同时,不要忘记年夜自然固有的强年夜的生态恢复力量；更不能误认为只要有了生态工程,就可以走发达国家“先污染、破坏,后治理”的老路.附页：1.离体的植物器官、组织或细胞―（脱分化）→愈伤组织―（再分化）→试管苗―→植物体2.除去细胞壁的酶：纤维素酶和果胶酶.3.植物培养基中的激素：细胞分裂素和生长素,当生长素的含量高于细胞分裂素时,主要诱导植物细胞脱分化和根原基的形成；当细胞分裂素的含量高于生长素时,主要诱导植物细胞再分化和芽原基的形成.4.各培养基成份比力：5.体细胞核移植用去核的卵母细胞的原因：①体积年夜,易把持②营养多※③激发细胞核的全能性.6.精子的发生：从初情期开始,细胞核→头部,高尔基体→顶体,线粒体→线粒体鞘,中心体→尾7.卵子的发生：在胚胎性别分化后,卵巢内的卵母细胞通过有丝分裂增加其数量.排卵：马排出低级卵母细胞,绵羊,牛等排出次级卵母细胞.8.判断卵子受精的标识表记标帜：在卵黄膜和透明带的间隙看到两个极体.9.受精：场所：输卵管准备：精子获能（体外受精时,使用一定浓度的肝素或者钙离子载体A23187溶液）,卵子在受精前也要经历类似精子获能的过程. 受精阶段：获能精子与卵子相遇,首先发生顶体反应,释放的顶体酶可直接溶解卵丘细胞质之间的物质,并在透明带融出一条通道,当精子与卵黄膜接触时,与卵黄膜融合,精子入卵.10.防止多精入卵的两道屏障：透明带反应、卵黄膜封闭作用11.牛的体外受精技术最高.12.胚胎移植最重要意义：胚胎移植可充沛发挥雌性优良个体的繁殖潜力.13.使用性激素使受体和供体母牛进行同期处置,使用促性腺激素增进供体母牛超数排卵.。

第37卷第11期2020 年中学生物学Middle School BiologyVol.37 No. 112020文件编号：1003 -7586(2020)11 - 0007-02一组与限制性核酸内切酶有关的疑难问题分析刘建峰(广东省汕头市澄海苏北中学广东汕头515829)限制性核酸内切酶，又称限制酶，是一类可以识别并附着特定的脱氧核苷酸序列，并对每条主链中特定部位的两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的酶，简称限制酶。

根据限制酶的结构，辅助因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型:Type I、Type II及Type ID。

I型限制酶既能催化宿主DMA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；II型限制酶只催化非甲基化的DNA的水解；瓜型限制酶同时具有修饰及认知切割的作用。

由于n型限制酶所识别的位置多为短的回文序列，所剪切的碱基序列通常即为所识别的序列，所以是基因工程上实用性较高的限制酶种类，如，£c〇R I、//iM 1D。

1区分限制酶、D N A连接酶、D N A酶和D N A聚合酶的方法限制酶、DNA连接酶、DNA酶和DNA聚合酶是一组易于混淆的概念，原因是它们的作用均与脱氧核苷酸链上的磷酸二酯键有关。

限制酶和DNA酶均可剪切磷酸二酯键，DNA连接酶和DNA聚合酶均可催化形成磷酸二酯键。

限制酶和DNA连接酶用于剪切或连接DMA链（或片段），DNA酶和DNA聚合酶用于剪切或连接游离的脱氧核苷酸分子。

在明确了以上联系和区别后，教师可以引导学生构建如图1所示的知识模型来帮助理解和掌握。

作用脱氧核苷酸链（片段）一游离的脱氧核苷酸对象•DNA聚合酶-DNA连接酶—限制酶…DNA酶形成磷酸二酯键破坏图1关于几种酶的知识模型2限制酶的存在特点和作用特点限制酶主要是从原核生物中分离出来的，迄今己 经从近300多种不同的微生物中分离出约4 000种限 制酶。

限制酶在细菌细胞中普遍存在，几乎在所有细菌的属、种中都至少发现一种限制酶，多者在一属中就 有几十种，例如在嗜血杆菌属中现己发现的就有22 种。

高二生物知识点集锦（65）新人教版选修1．若某种限制性核酸内切酶的识别序列是CCTAGG，它在A和G之间切断DNA。

下图表示用该酶处理某基因后产生的片段。

下列有关叙述正确的是( )A．该正常基因中有4个CCTAGG序列B．产生的DNA片段可用核糖核酸连接酶连接起来C．用该酶处理得到图示基因片段要水解3个磷酸二酯键D．若该基因某处有一个CCTAGC突变为CCTAGG，用该酶处理后将产生5个片段解析：选D。

该正常基因被切为4个片段，有3个切点，应有3个CCTAGG序列；产生的DNA 片段不能用核糖核酸连接酶连接，只能用DNA连接酶连接；用该酶处理得到图示基因片段要水解6个磷酸二酯键；若该基因某处有一个CCTAGC突变为CCTAGG，则有4个切点，用该酶处理后将产生5个片段。

2．下列关于生物工程中常见的几种酶的叙述，正确的是(多选)( )A．DNA连接酶可把目的基因与载体的黏性末端的碱基黏合，形成重组DNAB．限制性核酸内切酶将一个DNA分子片段切成两个片段需消耗两个水分子C．Taq酶是用PCR仪对DNA分子扩增过程中常用的一种耐高温的DNA聚合酶D．用纤维素酶和果胶酶处理植物细胞获得原生质体，便于植物杂交育种解析：选BC。

DNA连接酶连接的是磷酸二酯键，形成重组DNA。

限制性核酸内切酶将一个DNA 分子片段切成两个片段，切断两个磷酸二酯键，需消耗两个水分子。

用纤维素酶和果胶酶处理植物细胞获得原生质体，便于植物体细胞杂交。

3．(2011·浙江理综)将ada(腺苷酸脱氨酶基因)通过质粒pET28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。

下列叙述错误的是( )A．每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒B．每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点C．每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个adaD．每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子解析：选C。

大肠杆菌成功表达出腺苷酸脱氨酶，说明这些大肠杆菌都至少含有一个重组质粒，A项正确；作为载体的条件为至少含有一个或多个酶切位点，所以作为载体的质粒至少含有一个限制性核酸内切酶识别位点，B项正确；作为基因表达载体应包括目的基因、启动子、终止子、标记基因四部分，但并不是每个酶切位点都至少插入一个ada，C项错误；由于这些目的基因成功表达，所以每个ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子，D项正确。