影响限制性内切酶活性的因素5

在进行限制性酶切反应过程中，影响限制性酶切反应效果的因素较多，要设计酶切反应，一般均应考虑诸如酶切系统、温度条件、反应体积、底物性质及星型反应等因素。

根据各种不同的条件，酶切反应的设计一般应注意以下问题：1. 大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。

当最终反应液中甘油浓度大于12％时，某些限制酶的识别特异性降低，从而产生星活性，更高浓度的甘油会抑制酶活性。

因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。

（20ul体系酶量2ul是上限，如果切的底物量很大就请放大体系的体积，效果很好！！）2. 浓缩的限制酶可在使用前用1×限制酶缓冲液稀释，但切勿用水稀释以免酶失活，用水稀释的酶不能长期保存。

3. 反应体系中Mg2+是限制酶仅有的共同因子，当用其它二价阳离子代替Mg2+或加入能螯合Mg2+的EGTA或EDTA时，酶活性会被抑制，或改变酶的特异性，导致星型反应4. 多种因素可引发星型反应：①非最适的pH；②Co2+、Mn2+、2n2+取代Mg2+；③酶浓度大于25u/ug；④盐浓度降低；⑤高浓度甘油的存在(>12%)；⑥有机溶剂的存在。

（呵呵，所以反应是底物一定要处理干净，用ddH2O溶解最好；另：酚会严重抑制梅切！！）5. 反应混合物中DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的DNA会形成粘性DNA溶液抑制酶的扩散，并降低酶活性。

建议酶切反应的DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。

（比如XbaI在质粒浓度高时效果很差就是切不开啦）6. 酶切反应所加入的酶量应适中，根据底物的种类、量的多少和体积的大小而定，对不同的限制酶，各厂家均有一最大的消化量指标可参考。

7. 当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，如果这些酶可以在同种缓冲液中作用良好，则两种酶可同时切割，如果这些酶所要求的缓冲液有所不同，则可采用以下两种替代方法：①先用在低离子强度的缓冲液中活性高的酶切割DNA，然后加入适量NaCl及第二种酶，继续反应；②使用能够使多数内切酶均表现较高活性的单种缓冲液。

简析限制性内切酶限制性内切酶（即限制酶）是基因工程中的必用操作工具之一。

基因工程是近年来高考中的热点，而对于限制酶的考查也是历年高考题中的常考知识点。

1限制酶的作用及影响因素1.1 作用：切割特定的核苷酸序列[高考赏析]（2008，全国I）已知某种限制性内切酶在一线性DNA分子上有3个酶切位点，如图中箭头所指，如果该线性DNA分子在3个酶切位点上都被该酶切断，则会产生a、b、c、d四种不同长度的DNA片段。

现在多个上述线性DNA分子，若在每个DNA分子上至少有1个酶切位点被该酶切断，则从理论上讲，经该酶切后，这些线性DNA分子最多能产生长度不同的DNA片段种类数是（）A.3B.4C.9D. 12【答案】C【解析】：每一种限制性内切酶切割DNA后会留下特征性的粘性末端，同时一次切割后，会把DNA分割成两个片段，且不同的内切酶切后的片段不一样。

若在3个酶切点切断，得到4种长度不同的DNA片段；若在2个酶切点切断，得到3种长度不同的DNA片段；若在1个酶切点切断，得到2种长度不同的DNA片段。

因此最多能产生4+3+2=9种长度不同的DNA分子。

1.2 作用结果：形成DNA片段末端黏性末端：错位切，切下后的两端形成一种回文式的单链末端。

平末端：平切，在两条链的特定序列的相同部位切割，形成一个无黏性末端的平口。

[高考赏析]（2008，江苏）将动物致病菌的抗原基因导入马铃薯制成植物疫苗，饲喂转基因马铃薯可使动物获得免疫力。

以下是与植物疫苗制备过程相关的图和表。

请根据以下图表回答下列问题。

（1）在采用常规PCR方法扩增目的基因的过程中，使用的DNA聚合酶不同于一般生物体内的DNA聚合酶，其最主要的特点是。

（2）PCR过程中退火（复性）温度必须根据引物的碱基数量和种类来设定。

表1为根据模板设计的两对引物序列，图2为引物对与模板结合示意图。

请判断哪一对引物可采用较高的退火温度？__________。

（3）图1步骤③所用的DNA连接酶对所连接的DNA两端碱基序列是否有专一性要求？。

名词说明1.基因工程：是将目的基因或DNA片段与适合的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因和蛋白质的活性表达，使转基因生物取得新的遗传性状的操作。

2.限制性内切核酸酶：能够识别双链DNA分子中的某一段特定核苷酸序列，并在此切割DNA 双链的内切核酸酶。

3.同切点酶：又称同裂酶，是一类来源于不同微生物、能识别相同DNA序列的限制性内切核酸酶。

4.同尾酶：是一类限制性内切核酸酶，它们来源各异，识别的靶序列也各不相同，但切割后能产生相同的黏性结尾。

5.酶的星号活性（Star activity）：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的酶的星号活性现象。

连接酶：是能催化双链DNA片段靠在一路的3’羟基结尾与5’端磷酸基团结尾之间通过形成磷酸二酯键，使两结尾连接的一种核酸酶。

7.载体：在基因克隆中能携带外源基因进入受体细胞复制、整合或表达的工具称为载体。

8.多克隆位点：是包括多种同一个限制性酶切点的一段很短的9. α互补：为质粒DNA编码β—半乳糖苷酶的α亚基，宿主细胞可编码β亚基尽管宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们能够融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种互补现象叫α互补。

10.黏粒载体（考斯质粒载体）：是一类人工构建的含有λ-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。

11.质粒：是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳固遗传的一类核酸分子12.探针：当用一个标记的核酸分子与核酸样品杂交,即可查明该样品中是不是存在与该标记核酸分子具有同源性的核酸分子。

那个标记的核酸分子称为探针(probe)，能够是DNA，也能够是RNA，或合成的寡核苷酸.13、SD序列：是存在于原核生物起始密码子上游7-12个核苷酸内的一种4-7个核苷酸的保守片段，它与16SrRNA3’端反向互补，因此可将mRNA的AUG起始密码子置于核糖体的适当位置以便起始翻译作用。

影响限制性内切酶活性的因素包括DNA的纯度、缓冲液、温度及酶本身。

不同的限制性内切酶对缓冲液中盐浓度的要求各不相同。

一般配制高、中、低盐3种缓冲液，用于酶反应。

DNA甲基化，附有蛋白质或高分子量DNA胶体溶液太粘稠均会降低内切酶的消化效率。

由于在限制性内切酶消化反应中，甘油浓度超过5％（V/V）会抑制内切酶活性，因此在20μl 反应体系中，甘油浓度应少于lμl。

用2种酶消化DNA时，各种酶所需盐浓度相同，则消化可同时进行；若需要的盐浓度不相同，则必须先用低盐浓度的限制性内切酶消化完后，再调整到高盐缓冲系统，加入高盐浓度的限制性内切酶，继续消化。

由于loadingbuffer中有高浓度的甘油，因此加入loadingbuffer后会是酶失活。

酶切实验中的注意事项:1)反应取酶时应使用无菌吸头，以免污染酶液，同时应尽量缩短酶在温室的放置时间。

2)反应混合物混匀时，应避免强烈振荡以保证不使内切酶变性及DNA大分子的完整。

3)反应前的低速离心是必要的，这可使因混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底4）DNA或酶切试剂中混有DNase，在一定的温度或缓冲液的作用下，激发DNase的作用，将DNA降解。

如果楼主得试剂和步骤是正确，既排除了其他因素（试剂，体系，有没有混匀等）。

因为大多数内切酶失活，都是因为酶蛋白本身结构得不可逆改变，各种亚基团不稳定至分离等（如甘油得浓度增大，温度增大65度以上）。

所以，向楼主说得在室温放置一个小时，一般不会失活，只是酶切效率降低而已，但反应还是进行得，这样酶就在消耗，酶本身得活性基团在分离，再拿到37度，效率肯定会低，甚至没活性，导致酶切看不到条带（如果你的酶切片断小得话，拿PAGE跑，可能会看到带）。

基因工程复习题一、名词解释 201.转导：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程。

2.转染：以噬菌体为载体，不经过蛋白包装成病毒颗粒，而是用DNA连接酶使噬菌体DNA 环化，再通过质粒转化方式导入受体菌的过程。

3.质粒：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。

4.基因库：特定生物体全基因组的集合（天然存在）。

5.转化率：每μgDNA转化成功的细菌克隆数。

6.同尾酶：来源和识别序列不同，但能切出相同的粘性末端的限制性内切酶。

7.同裂酶：来源不同，识别位点的序列相同的限制性内切酶。

8.Ti质粒：在根瘤土壤杆菌细胞中存在的一种染色体外自主复制的环形双链DNA分子，它控制根瘤的形成，可作为基因工程的载体。

9.SD序列：mRNA的核糖体结合位点，含有一个启始密码子和一段同核糖体16S RNA3’末端碱基互补的序列，3-9个核苷酸,富含嘌呤,位于起始密码子上游3-11个核苷酸处10.cos位点：DNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为cos位点。

11.基因工程：通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。

12.报告基因：编码产物能够被快速测定、不依赖于外界压力的一类基因。

13.平台效应：PCR反应经过一定数量的循环后，随着产物的对数积累趋于饱和，DNA片段不再呈指数积累，而是进入线性增长期或静止期，此过程称为平台效应。

14.受体细胞：是能摄取外源重组DNA并使其稳定维持和表达，或有待于实施遗传改良的细胞。

15.cDNA library：将生物特定的组织器官或特定发育时期的全部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部表达基因的转录本。

16.穿梭质粒载体：人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。

分⼦⽣物学问答题问答题第⼆章⼀、⽤于基因重组的载体需要具有哪些条件？1）具有⾃主复制能⼒，保证重组DNA分⼦可以在宿主细胞内得到扩增2）具有较多的拷贝数，易与宿主细胞的染⾊体DNA分开，便于分离提纯3）分⼦质量相对较⼩，易与操作，并能够容纳较⼤分⼦质量的⽬的基因4）具多个单⼀限制性内切酶位点，便于⽬的基因克隆5）有⼀个或多个筛选标记（如对抗⽣素的抗性、营养缺陷型或显⾊表型反应等）6）具有较⾼的遗传稳定性⼆、限制性内切酶主要分为⼏个类型？各有什么特点？限制性内切酶主要分为三种类型，即Ⅰ型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶。

Ⅰ型和Ⅲ型酶⼀般都是⼤的、多亚基的蛋⽩质复合物，同时具有内切酶活性和甲基化酶活性。

均需ATP ⽔解供能。

Ⅰ型酶能够识别特异的核苷酸序列，但是切割位点是随机的，Ⅲ型限制酶从距离识别位点⼀侧约25bq处单链切割DNA分⼦。

识别序列是⾮对称的，现在已知的酶数量相当少。

Ⅰ型和Ⅲ型酶在DNA重组技术中⽤处不⼤。

Ⅱ型限制性核酸内切酶只有⼀种多肽，通常以同源⼆聚体形式存在，核酸内切酶活性和甲基化作⽤活性是分开的。

⽆需ATP⽔解供能，仅需Mg2﹢参与。

具有序列特异性，可对靶DNA进⾏精确切割，在DNA 重组技术中有特别⼴泛的⽤途。

三、影响限制性内切酶作⽤的因素有哪些？DNA第底物的纯度、DNA的甲基化程度、DNA分⼦的结构、酶切反应的温度、酶切反应的时间、酶切反应的缓冲体系等四、DNA连接酶主要有哪些应⽤？1）作为DNA重组技术的重要⼯具酶，催化两个具有黏性末端或平末端的DNA⽚段5’-P和3’-OH之间形成磷酸⼆酯键，组成新的重组DNA分⼦。

2）在DNA复制中发挥接合缺⼝的作⽤，这种单链缺⼝是由复制叉上的不连续性所产⽣3）在DNA损伤修复、遗传重组、及DNA链的剪接中起缝合缺⼝的作⽤五、反转录病毒载体有哪些优点？1）具有⼴泛的哺乳动物细胞宿主2）可主动感染分裂细胞3）感染细胞后，病毒基因组反转录⽣成双链DNA，可整合到宿主染⾊体中，与染⾊体同时复制，持续表达外源基因4）基因组⾃⾝含有完整⾼效的调控元件六、腺病毒载体有哪些优点？1）可插⼊⼤⽚段外源基因，可达35kb2）宿主范围⼴，尤其⼈类是腺病毒的⾃然宿主3）不仅可感染分裂期细胞，也可感染⾮分裂细胞4）病毒滴度⾼，可达10^9-10^11pfu/ml5）可原位感染组织，如肺等6）重组载体进⼊细胞后并不整合到宿主染⾊体DNA上，⽽是游离于染⾊体外瞬时表达，安全性好七、腺病毒载体有哪些不⾜？①病毒基因组较⼤，构建载体较复杂②⼏乎可感染所有细胞，缺乏特异性③载体不发⽣整合，导致⽬的基因只能短暂表达，因此需要重复应⽤，可能诱发机体的免疫反应第三章①化学合成法已知⽬的基因的核苷酸序列，或根据基因产物的氨基酸序列推导出其核苷酸序列，可利⽤全⾃动DNA合成仪化学合成该⽬的基因。

限制酶使用说明一、分类目前，已被发现的限制酶，根据其反应的必须因子和切断点等特性，被分为以下三大类：类别反应必须因子切点酶例 I 型 s-腺苷基蛋氨酸、ATP、Mg2+识别部位和切点不同，切断部位不定Eco B、Eco KII 型 Mg2+切断识别部位或其附近的特定部位Eco R I、Bam H I III 型 ATP、Mg2+识别部位和切点不同，但切断特定部位Eco P I、Hin f III 应用于基因工程研究用的限制酶，一般全是II型酶，现在市场上销售的酶都属于II型酶, 这些限制酶由于其反应条件和底物DNA种类的不同，其切断状况及出现Star活性的频率等各有不同，并且其程度也根据酶的不同而千差万别。

因而在使用限制酶时，必须对这些要素充分注意，确保目标序列的切断反应能顺利进行，下面具体介绍一下使用限制酶时的一些注意点。

二、注意事项1. 甲基化的影响从带有DNA甲基化酶基因的宿主菌中制备的DNA，其碱基的一部分已经被甲基化，因此即便使用能够识别、切断被甲基化部分的序列的限制酶，也几乎无法切断被甲基化的部分。

被甲基化的部位，根据底物DNA及宿主种类的不同而不同。

例如宿主菌为大肠杆菌的情况下，根据宿主的种类有以下两种情况：在进行转化时，通常使用的菌株为C600、HB101、JM109等，因为都带有dam、dcm甲基化酶，所以使用这些菌株制备的DNA时，必须注意。

另外，动物由来的DNA，CG序列多为5m CG；植物由来的DNA，CG及CNG序列多为5m CG和5m CNG。

2. Star活性限制酶在一些特定条件下使用时，对于底物DNA的特异性可能降低。

即可以把与原来识别的特定的DNA序列不同的碱基序列切断，这个现象叫Star活性。

Star活性出现的频率，根据酶、底物DNA、反应条件的不同而不同，可以说几乎所有的限制酶都具有Star活性。

并且，它们除了识别序列的范围增大之外，还发现了在DNA的一条链上加入切口的单链切口活性，所以为了极力抑制Star活性，一般情况下，即使会降低反应性能，我们也提倡在低甘油浓度、中性pH、高盐浓度条件下进行反应。

限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法（The common problems and solutions of restriction endonuclease digestion）The common problems and solutions of restriction endonuclease digestionRestriction enzyme digestion of the common problems and solutions, personally feel very well summed up, specially posted for you to share.Enzyme digestion problems, see enzyme instructions, the corresponding reagent company directory. The enzymes produced by different companies, the source of strains, the preparation process, purity, viability and enzymatic activity may be optimized differently,.Can be found in the above definition, unit of enzyme preservation conditions, enzyme system of [buffer and other enzymes such as buffer, double cut enzyme reaction temperature [some enzymes in 50, 55 or 30 temperature reaction, whether methylation affects the enzyme activity and whether there is an asterisk, asterisk may appear live factors and protective base, isocaudarner, isoschizomer1. enzymes can not be cut or incompleteThe 1.1 plasmid is the most common or poorly expressed inhibitor. The presence of miscellaneous proteins can affect enzyme digestion, showing A260/A280 below 1.8; inhibitors are common in phenols, salts, and ethanol; [re DNA, using reliable kits or reliable manual extraction reagents,1.2 enzyme problems: make sure the enzyme is effective [although many enzymes have expired time, but expired as long as the enzyme can be effectively cut, available. Make sure the enzyme is not effective. Mark it and replace it.[note] topic: by endonucleaseA. endonuclease, if no special requirement, keep -20~-30 degrees. Is not as low as possible, the enzyme is usually preserved in 50% glycerol buffer, when the temperature is too low, will freeze (enzyme transport process exception, because the enzyme requires low temperature transport, so the convenient situation is the use of dry ice, the enzyme will freeze, but the freezing times is limited, is a relatively better choice), if is often used, the enzyme will be repeated freezing and thawing, thereby reducing the activity. Of course, if the temperature is too high, ha ha, you want to go.B. enzyme should be used in ice box for enzyme extraction. It's clear to everyone, but it's no harm putting too much emphasis on it. Some of the students because the lab is put out, the enzyme in the ice box, but there are two ignored: when taking the enzyme, the hand does not hold the upper end of the pipe, and the grip at the bottom, equivalent to hand in to the enzyme by heating; some enzymes are placed in the ice box, but the absorption of the enzyme when will the enzyme take out. Once or twice a day, it can affect enzyme activity.C. enzyme should be tightened as soon as possible after the lid. Sometimes we can find that even if -20~-30 degrees are placed,the enzyme will freeze. That is because of personal reasons may be cut in the configuration when the enzyme reaction, enzyme tube lid open for a long time, glycerol will absorb moisture in the air, for large packaging commonly used enzyme sometimes arise freezing phenomenon. In addition, sometimes, because of careless operation, some of the broken ice congealed on the ice box fell into the enzyme tubes. (I appeared two times myself. SweatD. uptake of enzymes by tips. We used to take the enzyme tips is the smallest of the kind, suitable for 2ul and 10ul guns, but tips usually has two kinds, one is the most commonly used short tips, with it next to the enzyme, tips enzyme, the gun is almost to be inserted into the pipe, sometimes stained with enzyme in the gun body. Therefore, it may cause pollution. Then, we need to pay great attention to the action, or change to another long tips, specially for the enzyme solution.1.3 buffer problem. Some enzymes cut buffer, adding a number of easier to precipitate or dissolved components [ligase buffer is more like this], and sometimes when the enzyme buffer is not completely melted, the concentration of buffer is heterogeneous. The new buffer melts first, and the salt ion concentration is high. After a period of time, the concentration of the ions in the melt decreases. Normally, this has little effect, but problems arise if you use some enzymes that are sensitive to the concentration of ions.1.4 double enzyme buffer selection: make sure the correct buffer and reaction temperature are used [refer specifically to the enzyme buffer cut from the manufacturer and double enzymecut buffer, where NEB is availableHttp://www.neb-china.COM / CN /技术/重/ double_digests.htm1.5酶切位点的甲基化影响：有时甲基化会影响酶切，常见的有Xba I、Bcl I等。

实验五DNA的限制性内切酶酶切反应DNA restriction enzyme digestion一、实验目的通过本实验掌握DNA的限制性内切酶酶切反应的基本原理与实验过程。

二、实验原理限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA 序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。

它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于ATP 的存在。

Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA 分子,然后从底物上解离。

Ⅱ类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。

绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4 至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。

Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的DNA 片段(如Sma:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的DNA 片段称粘性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。

5'…G↓AATTC…3' →5'…G AATTC…3' ；3'…CTTAA↑G …5' →3'…CTTAA G…5' 。

Pvu I 的识别序列5'…ＣＧＡＴ↓ＣＧ…3' →5'…ＣＧＡＴＣＧ…3'三、实验仪器与设备水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉,紫外透射仪,凝胶成像系统四、实验材料与试剂pUC18质粒：2686bp，0.5μg/μl，40μl/管（日本东洋纺织株式会社） Pvu I 酶及其酶切缓冲液：10U/μl，200U/管（北京鼎国昌盛生物技术有限公司），在pUC18质粒上有两个酶切位点，分别为酶切第一个碱基位是276（896bp）、2066（1790bp)10X的酶切反应体系（使用时酶切反应体系为1X）琼脂糖(Agarose) 溴化乙锭：5×TBE 电泳缓冲液：（使用时稀释10倍）6×电泳载样缓冲液：五、实验步骤1.将清洁干燥并经灭菌的eppendorf 管(最好0.2ml)编号,用微量移液枪分别加入pUC18质粒2μl（1μg）和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水15μl（使总体积为19μl）, 用手指轻弹管壁使溶液混匀,然后加入1μl 酶液,用吸头轻轻抽吸数次混匀酶切反应物，用微量离心机2000rpm数秒,使溶液集中在管底。

1、下列有关基因的叙述，错误的是【 A 】A 蛋白质是基因表达的唯一产物B 基因是 DNA 链上具有编码功能的片段C 基因也可以是 RNAD 基因突变不一定导致其表达产物改变结构2、基因工程的单元操作顺序是【 B 】A 增，转，检，切，接B 切，接，转，增，检C 接，转，增，检，切D 切，接，增，转，检3、生物工程的上游技术是【 A 】A 基因工程及分离工程B 基因工程及发酵工程C 基因工程及酶工程D 基因工程及细胞工程4、下列各组专业术语中，含义最为接近的是【 C 】A 终止子与终止密码子B 基因表达与基因转译C DNA 退火与 DNA 复性D 重组子与转化子5、根据酶切活性对盐浓度的要求，限制性核酸内切酶可分成【 B 】A 2 大类B 3 大类C 4 大类D 5 大类6、T 4 -DNA 连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段 DNA 片段连接在一起，其底物的关键基团是【 D 】A 2' -OH 和 5' – PB 2' -OH 和 3' -PC 3' -OH 和 2' – PD 5' -OH 和 3' -P7、下列有关连接反应的叙述，错误的是【 A 】A 连接反应的最佳温度为37 ℃B 连接反应缓冲体系的甘油浓度应低于 10%C 连接反应缓冲体系的 ATP 浓度不能高于 1mMD 连接酶通常应过量 2-5 倍8、原生质体转化方法不大适用于【 A 】A 大肠杆菌B 枯草杆菌C 酵母菌D 链霉菌9、下列各常用载体的装载量排列顺序，正确的是【 A 】A Cosmid >λ-DNA > PlasmidB λ -DNA > Cosmid > PlasmidC Plasmid >λ -DNA > CosmidD Cosmid > Plasmid > λ-DNA10、若某质粒带有 lacZ 标记基因，那么与之相匹配的筛选方法是在筛选培养基中加入【 D 】A 半乳糖B 异丙基巯基 - β - 半乳糖苷( IPTG )C 蔗糖D 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚基 - β -D- 半乳糖苷( X-gal )11、下列各组用于外源基因表达的受体细胞及其特点的对应关系中，错误的是【 C 】A 大肠杆菌－繁殖迅速B 枯草杆菌－分泌机制健全C 链霉菌－遗传稳定D 酵母菌－表达产物具有真核性12、分子杂交的化学原理是形成【 D 】A 共价键B 离子键C 疏水键D 氢键13、某一重组 DNA ( 6.2 kb ) 的载体部分有两个 SmaI 酶切位点。

名词解释：1.启动子：启动子（promoter）是基因表达调控的重要顺式元件，是DNA链一段能被RNA聚合酶识别和结合并能起始mRNA合成的DNA序列，位于结构基因转录起始点上游。

2.基因工程：基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因在体外进行剪切和组合，然后与载体拼接，并通过载体转入到另一种生物体（受体）内，使其按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。

3.表达载体：在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件，使目的基因能够表达的载体。

4.转化：DNA分子通过与细胞膜结合进入受体细胞并在细胞内稳定维持和表达的过程。

5.插入失活：外源DNA片段插入到载体的选择标记基因中而使此基因失活，丧失其原有的表性特征。

：酵母人工染色体，是进行大片段克隆的线状载体。

7.退火：当温度突然降低时，反应体系中寡核苷酸引物和其互补的DNA模板在局部形成杂交链。

文库：是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA与适当的载体连接后转化受体菌形成的重组DNA克隆群。

：多个限制酶的单一切点，即多克隆位点。

10.同尾酶：有些来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同，但产生出相同的粘性末端，这类限制酶称为同尾酶。

质粒：考斯质粒是一类人工构建的含有λDNA cos序列和质粒复制子特殊类型的载体。

12穿梭载体：是指能在两种不同的生物中复制的载体。

载体：利用土壤根癌农杆菌中存在着一种诱导瘤细胞的质粒构建成的载体。

14.基因文库：从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。

15.融合型表达蛋白：蛋白质的N未端由原核 DNA 序列或其他 DNA 序列编码，C端由真核 DNA 的完整序列编码，蛋白质由一条短的原核多肽或具其他功能的多肽和真核蛋白质结合在一起，故称融合蛋白。

16.反转录酶：是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。

17.末端转移酶：一种能将脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)加到某DNA片段上3′-OH基上的酶。

实验十五 DNA的限制性内切酶酶切分析【目的要求】1.掌握限制性核酸内切酶的基本概念、作用特点及作用原理2.熟悉DNA的限制性内切酶酶切分析操作技术及其影响因素3.了解DNA酶解技术生物研究领域的应用【实验原理】限制性内切酶(restriction endonuclease，RE)是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸顺序(一般具有双重对称的回文结构)，并以内切方式水解水解双链DNA的核酸水解酶。

它主要分布于细菌体内，目前已发现1800多种。

根据酶的组成、辅助因子及水解DNA的方式不同，可将限制性内切酶分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种类型，而Ⅱ型限制性内切酶是重组DNA技术中常用的限制性内切酶，如Eco RⅠ、BamHⅠ等，它们被誉为分子生物学家的手术刀。

临床上某些遗传病由于基因突变发生在限制性内切酶切割位点，因此当用一定的限制性内切酶切割时，产生的酶切DNA片段大小就会与正常人酶切DNA片段发生差异，因而发生DNA限制性酶切图谱改变，据此可达到基因诊断的目的。

实验选用价格低廉、酶切效果较好的Eco RⅠ(识别位点G↓AATTC)对λDNA进行酶切分析，观察限制性内切酶的特定切割作用及其限制性图谱，理论上可产生21226bp，7421bp，5804bp，5604bp，4878bp和3530bp等不同分子量的DNA片段。

经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外扫描仪下摄影即可观察到λDNA的Eco RⅠ限制性酶切图谱。

【实验准备】一、器材1.恒温水浴箱2.电泳仪和电泳槽3.紫外扫描分析仪4.台式高速离心机5.微波炉6.加样枪、EP管及试管架等二、试剂1．DNA底物λDNA或质粒DNA或制备的肝组织DNA。

2．限制性内切酶Eco RⅠ及其缓冲液购自华美生物工程公司，每种限制性内切酶均配有2种缓冲液，在配套的缓冲液中该限制性内切酶均可获得100%酶切活性。

3．10×TAE 电泳缓冲液取Tris24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml，加蒸馏水至500ml。

限制性内切酶酶切的常见问题及解决方法，个人觉得总结得很好，特转贴供本供大家分享。

酶切出现问题，先看内切酶说明书，相应试剂公司目录。

不同公司出产的内切酶，菌株来源、制备工艺、纯度活力、酶切活性优化可能不同，酶切效果也有差别。

可在上面找到酶单位定义、保存条件、酶切体系[buffer及与其它酶双切的buffer等]、酶切反应温度[有些酶是在50、55或30等温度下反应的]、酶是否受甲基化影响、是否有星号活性及出现星号活可能因素、保护性碱基，同尾酶、同裂酶等等。

1. 酶切不开或不完全1.1 质粒问题纯度差或残留酶切抑制物最为常见。

杂蛋白存在会影响酶切，表现为A260/A280低于1.8；抑制物常见酚、盐、乙醇等。

[重新提DNA，使用可靠试剂盒或可靠手工提取试剂]1.2 酶的问题：确认内切酶有效 [很多内切酶虽然有过期时间，但过期后只要能够有效酶切，可用。

确认酶切效果不好，做标记，更换] 。

【题外话：用内切酶注意】a. 内切酶如无特殊要求，保存-20~-30度。

并非越低越好，酶通常是保存在50％甘油缓冲液中，温度过低时，酶会发生冻结（运输过程例外，由于酶需要低温运输，所以方便的情况下是使用干冰，酶会冻结，但冻结次数有限，相对是一种比较好的选择），如果是经常使用的话，酶会被反复冻融，从而降低了活性。

当然如果温度过高，呵呵，你就自己想去吧。

b. 酶在使用时应置于冰盒中取酶。

这点大家都清楚，不过多强调也没坏处。

因为实验室有些同学，酶取出后是放在冰盒上的，但有两点忽略了：拿酶的时候，手不是抓着管子上端，而握在管子的底部，相当于用手在给酶进行加热；有些酶是放在冰盒中，但吸酶的时候，还是将酶拿出来。

偶尔一次没有大碍，反复如此，可能会影响酶活。

c. 酶使用完后应尽快旋紧盖子。

有时我们可以发现，即使是-20~-30度放置，酶仍然会冻结。

个人认为的可能原因是由于在配置酶切反应时，酶管的盖子在较长时间的开着，甘油会吸取空气中的水分，对于常用的大包装的酶有时就会出现冻结现象。

一、限制性内切酶酶切注意事项在进行限制性酶切反应过程中，影响限制性酶切反应效果的因素较多，要设计酶切反应，一般均应考虑诸如酶切系统、温度条件、反应体积、底物性质及星型反应等因素。

根据各种不同的条件，酶切反应的设计一般应注意以下问题：1. 大多数限制酶贮存在50%甘油溶液中，以避免在-20 C条件下结冰。

当最终反应液中甘油浓度大于 12％时，某些限制酶的识别特异性降低，从而产生星活性，更高浓度的甘油会抑制酶活性。

因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。

2. 浓缩的限制酶可在使用前用1邓艮制酶缓冲液稀释，但切勿用水稀释以免酶失活，用水稀释的酶不能长期保存。

3. 反应体系中Mg2+是限制酶仅有的共同因子，当用其它二价阳离子代替Mg2+或加入能螯合Mg2+的EGTA或EDTA时，酶活性会被抑制，或改变酶的特异性，导致星型反应。

4. 多种因素可引发星型反应：①非最适的pH;②Co2+、Mn2+、2n2+取代 Mg2+;③酶浓度大于25u/ug ；④盐浓度降低；⑤高浓度甘油的存在（＞12%）；⑥有机溶剂的存在。

5. 反应混合物中 DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的DNA会形成粘性DNA溶液抑制酶的扩散，并降低酶活性。

建议酶切反应的DNA浓度为0.1-0.4ug/ul 。

6. 酶切反应所加入的酶量应适中，根据底物的种类、量的多少和体积的大小而定，对不同的限制酶，各厂家均有一最大的消化量指标可参考。

7. 当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，如果这些酶可以在同种缓冲液中作用良好，则两种酶可同时切割，如果这些酶所要求的缓冲液有所不同，则可采用以下两种替代方法：①先用在低离子强度的缓冲液中活性高的酶切割DNA然后加入适量 NaCl及第二种酶，继续反应;②使用能够使多数内切酶均表现较高活性的单种缓冲液。

8. 用同一种酶切割不同的DNA时，所需酶量不同，可根据DNA底物上酶切位点的多少与ZDNA 存在位点的数目比较后，决定用酶量。

限制性内切酶消化技术的使用中常见问题引言：限制性内切酶消化技术是生物学研究和分子生物学实验中常用的一项技术。

通过切割DNA分子，限制性内切酶消化技术可以实现DNA的分离、测序、重组和修饰等多种用途。

然而，在使用限制性内切酶消化技术的过程中，也会遇到一些常见问题。

本文将针对这些问题进行详细阐述，并提供相应的解决方法。

问题一：限制性内切酶未能有效切割目标DNA在进行限制性内切酶消化反应时，有时会出现限制性内切酶未能完全切割目标DNA的情况。

这可能是由于以下原因造成的：1. 酶活性损失：限制性内切酶的活性受多种因素影响，如pH值、温度、离子浓度等。

在使用限制性内切酶之前，应确保其活性没有受到损害。

可以通过进行阳性对照实验，或者使用已被证实具有良好活性的酶来验证。

2. 酶切位点序列变异：限制性内切酶只能识别并切割特定的DNA序列。

若目标DNA序列中的限制性内切酶切割位点发生变异或缺失，将导致酶无法正常切割。

可以通过测序目标DNA来验证切割位点是否存在变异。

解决方法：1. 确认酶的活性：使用阳性对照实验或者使用已被证实具有良好活性的限制性内切酶来验证其活性。

2. 验证切割位点序列：通过测序目标DNA来验证切割位点的序列，确保其与限制性内切酶的切割位点一致。

问题二：限制性内切酶反应产物异常在进行限制性内切酶消化反应后，有时反应产物会出现异常的情况，如模板DNA完全被切割或完全未切割。

这可能是由于以下原因造成的：1. 反应条件不合适：反应缓冲液的pH值、离子浓度和温度等因素都会影响限制性内切酶的活性。

若反应条件不合适，将导致限制性内切酶无法正常切割目标DNA。

2. 酶过多或过少：限制性内切酶的用量应根据目标DNA的长度和预测切割位点来确定。

若酶用量过多或过少，会导致反应产物异常。

解决方法：1. 优化反应条件：通过调整反应缓冲液的pH值、离子浓度和温度等因素，优化反应条件，确保限制性内切酶能够正常切割目标DNA。