最新病毒血凝和血凝抑制试验--(以新城疫为例)资料

鸡新城疫血凝与血凝抑制实验鸡新城疫血凝（HA）及血凝抑制(H1)试验基本原理：许多病毒表面具血凝素，具有凝集某些动物或人红细胞的特性，称为血凝现象，可用于鉴定病毒。

血凝现象可以被特异性抗体所抑制，称为血凝抑制现象，利用这种特性可进行血清学试验，称为血凝抑制试验。

器材及试剂:待检病毒:鸡新城疫病毒鸡胚尿囊液；待检血清：抗鸡新城疫病病毒阳性血清；生理盐水/PBS、1%鸡红细胞、96孔V形微量血凝板、加样器等。

实验步骤PBS的配制：1%鸡红细胞的配制：（一）血凝试验（HA）取96孔板，按以下步骤操作：1、第一排1-12孔各加生理盐水50ul，第二排1-12孔加生理盐水50ul为红细胞对照；2、吸50ul病毒液于第一排第1孔，混匀后取50ul至第2孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，各孔经倍比稀释后稀释度依次为2-1~2-12 。

3、第一排1-12孔及第二排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微型震荡器震荡2min混匀。

4、室温静置10-30分，观察结果（见下表）。

5、结果判定：红细胞对照组红细胞完全沉降，以试验排中能使等量红细胞发生完全凝集的病毒最高稀释倍数，作为病毒的血凝价，即HI效价，用2n表示。

（二）四单位检测：（三）血凝抑制试验（HI）取一96孔板，按以下步骤操作：1、4个单位抗原的制备：按HA试验测出的病毒血凝价除以4即为4个单位血凝素的稀释度。

2、待检血清的稀释：第一、二、三排1-12孔各加生理盐水50ul，于第一排第1孔中加入50ul待检血清，反复吹吸3-5次混匀后，取50ul至第2孔混匀，吸取50ul至第3孔，依次稀释至第12孔，弃去50ul，经倍比稀释，血清的稀释倍数为21~212 。

3、第一、二排1-12孔各加4个单位血凝素50ul，微量震荡器震荡2min混匀；4、室温静置20min；5、第一、二、三排1-12孔各加1%鸡红细胞50ul，微量震荡器震荡2min混匀混匀。

6、室温静置10-30分，观察结果（见下表）；7、结果判定：第二排为抗原对照，红细胞应全部凝集，第三排为红细胞对照，红细胞应全部沉降。

血凝抑制实验报告三篇一、血凝试验操作程序1、取96孔90°V形酶标板，用微量移液器在第一至第五排的1~12孔每孔加25 μL PBS液。

2、吸取25 μL标准禽流感抗原加入到第一排第1孔中充分混匀。

3、从第1孔吸取25 μL混匀后的抗原液加到第2孔中，混匀后吸取25μL加入到第3孔中，依次进行倍比稀释至第二排最后一孔即第24孔，最后弃去25 μL。

第三排孔至第四排孔同上操作。

4、依次向第一至第五排孔的每孔中加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。

5、将酶标板置于微量振荡器上振荡10秒，室温（20-25℃）静置30 min观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。

6、结果判定：将板作45°倾斜，观察红细胞是否呈泪滴状流淌。

以完全凝集（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数为1个血凝单位（HAU）二、血凝抑制试验操作程序1、根据血凝试验结果配制4HAU抗原。

（即1HAU抗原除以4）2、取96孔V形酶标板，用移液器在第1~12孔各加入25 μL PBS。

3、在第1孔加入25 μL被检血清，充分混匀后移出25 μL加至第2孔，依次类推，倍比稀释至第12孔，弃去25 μL。

4、按以上步骤加入阳性血清和阴性血清（各做两份），作对照孔。

5、在第1~12孔各加入25 μL 4单位抗原，置于微量振荡器上轻轻混匀，室温20-25℃下静置30 min。

6、每孔加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。

置于微量振荡器上轻轻混匀，室温（20-25℃）静置40 min后观察结果，若环境温度过高，可于4℃条件下进行，红细胞将呈明显的纽扣状沉到孔底。

7、结果判定：只有阴性对照孔血清滴度不大于2 log2，阳性对照孔误差不超过1个滴度，试验结果才有效。

将酶标板作45°倾斜，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释倍数判为该血清的血凝抑制滴度。

当被检血清效价大于等于4log2，判为禽流感抗体阳性。

三、试验过程中的注意事项1样品的保存及试验前处理1.1 采集的血液样品应及时分离血清，最好分装至离心管中，标记清楚，离心后吸出血清，对应编号冷藏送检，并禁止运输过程中剧烈震动。

实训九 NDV的血凝及血凝抑制试验（微量法）目的要求熟练掌握病毒的血凝及血凝抑制试验（微量法）的操作方法及结果判定，明确其应用价值。

仪器及材料pH7.2生理盐水、1％鸡红细胞悬液、NDV、新城疫病毒待检血清、微量血凝板（96孔V型板）、微量移液器（带吸头）、微型振荡器、温箱、离心机、天平、注射器。

方法与步骤（一）病毒的血凝（HA）试验1．1％鸡红细胞悬液的制备（1）采血先在注射器中吸入抗凝剂（3.8％枸橼酸钠液）1ml，采成年健康鸡血，心脏或静脉采血3-4ml。

（2）离心洗涤共3次，每次2000r/min，5min，每次离心后弃去上清液和白细胞，仅留纯的红细胞，最后读出红细胞的体积。

（3）配制用生理盐水将纯的红细胞稀释成体积比为1%的红细胞悬液。

2．操作术式振荡1min，室温(18℃～20℃)下作用30～40min,或置37℃恒温培养箱中作用15～30min观察结果（1）加生理盐水 1-12孔，每孔中分别加入50μl。

（2）NDV病毒液倍比稀释换吸头，吸取50μl病毒液，加于第1孔的生理盐水中，并用移液器吹打3～5次使液体混和均匀，然后取50μl移入第2孔，混匀后取50μl移入第3孔，依次倍比稀释到第11孔，第11孔中液体混匀后从中吸出50μl弃去。

第12孔不加病毒抗原，作盐水对照。

（3）加1%红细胞悬液换吸头，1-12孔，每孔中分别加入50μl。

加样完毕，振荡1min ，室温（18～20℃）下作用30～40min ，或37℃恒温箱中作用15～30min ，观察并判定结果。

3．结果判定及记录完全凝集（＋）：红细胞呈伞状分布于反应孔底层。

伞完全不凝集（－）：红细胞呈点状沉淀于反应孔底层。

点不完全凝集（±）：介于＋与－之间。

病毒的血凝价（或称血凝滴度）：能使一定量红细胞发生完全凝集的病毒最大稀释倍数为该病毒的血凝滴度，或称血凝价。

（二）病毒的血凝抑制（HI ）试验采用同样的血凝板，每排孔可测1份血清样品。

病毒的血凝试验某些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集试验(HA)，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的血凝可为相应的特异抗体所抑制，即血球凝集抑制试验(HI)，具有特异性。

通过HA—HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。

一、目的要求掌握HA和HI的基本操作技术，了解其实用价值。

二、实验材料新城疫病毒液0.1mL，1％鸡红细胞50mL，生理盐水50mL，阳性血清0.5mL,96孔“U”形或“V”形微量反应板，50微升定量移液管，滴头。

实验内容及操作程序1．血球凝集试验(HA)以新城疫病毒为例，操作过程如下(表 8—1)。

(1)在96孔“V”形微量反应板上进行，自左至右各孔加50uL生理盐水。

(2)于左侧第1孔加50uL病毒原液或收获液，混合均匀后，吸50uL至第2孔，混合均匀后，吸50uL至第3孔，依次倍比稀释，至第11孔，吸弃 50uL，稀释后病毒稀释度为第1孔1：2，第2孔1：4，第3孔1：8……。

最后1孔为对照。

(3)自左至右依次向各孔加1％鸡红细胞50uL置微型混合器上振荡lmin或以后固定转圈振荡反应板，使血球与病毒充分混合，在37℃温箱中作用15~30min后，待对照红细胞已沉淀可观察结果。

(4)判定结果：以100％凝集(血球呈颗粒性伞状凝集沉于孔底)的病毒最大稀释孔为该病毒血凝价，即一个凝集单位，不凝集者红细胞沉于孔底呈点状。

表8-1 血细胞凝集(HA)试验表从表7-1看出，本病毒的血凝价为1：128，则1：128的0.1mL中有1个凝集单位，1：64、1：32分别为2、4个凝集单位。

或将128／4=32，即1：32为4个凝集单位，第12孔为血球对照应不凝集。

2023年血凝抑制实验报告2023年血凝抑制实验报告1一、原理流感病毒颗粒表面的血凝素（HA）蛋白，具有识别并吸附于红细胞表面受体的结构，HA试验由此得名。

HA蛋白的抗体与受体的特异性结合能够干扰HA蛋白与红细胞受体的结合从而出现抑制现象。

二、应用该试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。

可用于流感病毒分离株HA亚型的鉴定，也可用来检测禽血清中是否有与抗原亚型一致的感染或免疫抗体。

三、缺点只有当抗原和抗体HA亚型相一致时才能出现HI现象，各亚型间无明显交叉反应；除鸡血清以外，用鸡红细胞检测哺乳动物和水禽的血清时需要除去存在于血清中的非特异凝集素；需要在每次试验时进行抗原标准化；需要正确判读的技能。

四、试验步骤1阿氏（Alsevers）液配制称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa 15min高压灭菌，4℃保存备用。

（3.8%枸橼酸钠（3.8g枸橼酸钠，100ml超纯水），101 kPa,20min高压灭菌，4℃保存备用,保存期1个月）。

210%和1%鸡红细胞液的制备2.1采血用注射器吸取阿氏液约1mL（3.8%枸橼酸钠），取至少2只SPF鸡（如果没有SPF鸡，可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡），采血约2～4mL，与阿氏液混合（3.8%枸橼酸钠），放入装10mL阿氏液（生理盐水）的离心管中混匀。

2.2洗涤鸡红细胞将离心管中的血液经1500～1800 r/min离心8分钟，弃上清液，沉淀物加入阿氏液（生理盐水），轻轻混合，再经1500～1800 r/min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后，加入阿氏液20 mL（生理盐水），轻轻混合成红细胞悬液，4℃保存备用，不超过5天。

2.310%鸡红细胞悬液取阿氏液保存不超过5天的红细胞，在锥形刻度离心管中离心1500～1800 r/min 8分钟，弃去上清液，准确观察刻度离心管中红细胞体积(mL)，加入9倍体积(mL)的生理盐水，用吸管反复吹吸使生理盐水与红细胞混合均匀。

血凝抑制实验报告三篇（经典版）编制人：__________________审核人：__________________审批人：__________________编制单位：__________________编制时间：____年____月____日序言下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

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新城疫的血凝和血凝抑制试验高若开 一、实验目的1.掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操作方法和结果判定方法。

2.分析血凝和血凝抑制试验的影响因素，用以确定最佳免疫时间、判定免疫效果和辅助疾病诊断。

二、实验内容1.血凝试验(HA)检测新城疫抗原2.血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体三、实验原理1.血凝试验（HA ）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA ）,也称直接血凝反应。

2.血凝抑制试验（HI ）原理：当在病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。

这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI ）反应，也称血凝抑制反应。

抗体病毒颗粒红细胞四、实验材料离心机、恒温箱、冰箱、振荡器、96孔血凝版（5块）、微量移液器（20-100微升可调）、吸液尖（若干）、洗耳球、离心试管、普通试管、试管刷、烧杯、吸量管、一次性注射器、ND标准抗原、1%红细胞悬液、抗凝剂、生理盐水。

五、实验步骤（一）抗凝剂的配制将1克柠檬酸钠用25毫升生理盐水稀释备用。

1毫升抗凝剂可用于采集9毫升血液。

（二）10%红细胞悬液的配制1、用注射器吸取0.5毫升抗凝剂无免疫健康青年公鸡的红细胞4.5毫升。

2、1500转离心5分钟，吸弃上清液。

3、用5-10倍生理盐水1500转洗涤3次，前两次5分钟，后一次10分钟。

4、吸弃上清液，用吸量管吸取红细胞，配制成10%红细胞悬液。

5、2-6摄氏度储存，备用。

（三）血凝试验（HA)1.在血凝板上第一排的1－12孔内各加入50ul生理盐水2.将系苗用生理盐水5毫升稀释，在第1孔内加入50ul病毒抗原，然后依次倍比稀释至第11孔，最后弃50ul。

3.每孔加入1％鸡红细胞悬液50ul4.轻轻振荡均匀，后放于室温或37℃中静置30分钟5.结果判定血凝效价测定结果判定标准1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100％凝集；2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即75％凝集；3、＋＋：红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即50％凝集；4、＋：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25％凝集；5、－：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集。

应广大养殖朋友和一些兽医朋友的要求，今将养殖场中常做的血凝试验（HA）和测血液或卵黄中禽流感和新城疫等抗体的血凝抑制试验写出来，以供朋友参考，不当之处，尚请斧正。

血凝试验一、血凝原理：正粘病毒（流感）和副粘病毒（新城疫）EDS病毒等有血凝素，能够使家禽的血细胞凝集。

冠状病毒得经胰蛋白酶处理才能较好地凝集。

二、抗体监测原理：血凝抑制（ＨＩ）试验。

抗体监测。

利用抗体来中和病毒使血凝能力不断下降。

三、凝和不凝的判断。

病毒与家禽的（有核）红细胞结合后产生凝集，红细胞带上电荷相互排斥而在一定时间内（大于半小时）不沉淀。

一般的细胞则在重力的作用下沉淀下去，是为不凝集。

（最后都沉）四、血凝的判断：以完全不沉为凝集。

半沉半凝集不算。

（即沉的是不凝，不沉的是凝）五、血凝试验的作用：1、判断有无病毒。

（4㏒2为一标准）2、疫苗的凝集价。

六、对血细胞要求：SPF鸡血最好，健康未免疫鸡次之，免疫健康鸡最差（大量用），病鸡坚决不用。

大量使用的免疫健康鸡血应多洗几遍。

设备（离心机、振荡器、进口<芬兰>八道移液器等）七、采血方法：心脏采血1、垂直采血2、水平采血（鸡采不死）八、采血洗血步骤：1、取无菌10ml注射器加入几粒到十几粒枸橼酸钠（防凝血），抽取5、6ml 生理盐水2、垂直或水平采血，针头能碰到跳动的心脏后再向前进几毫米，出现回血，轻抽注射器即可3、将血放入离心管，放入离心机中，加另一全是水的起平衡作用的离心管，使离心机从0逐渐加到1500～2000转，10 ～15分钟，停机，取出离心管，用吸管吸取上清液及一层薄薄的白细胞再加生理盐水并利用吸管的水流将红细胞搅匀，再离心，多次离心，（将细胞可能因免疫所致的影响降低。

最后将红细胞配成0.5 ～1%备用。

九、血凝测定步骤：在96（8×12）孔微量板上以1~2排（8~2×8个）为单位，用8道（芬兰产1800~2400元每个）或单道微量移液器每孔加25微升生理盐水，在每组的第一孔加25微升待测液体，然后向后倍比稀释，弃去最后一滴于盛废液的容器中。

生理盐水 病毒液 25「 25卩1\25^125^1 25 ”1 25g1 2 25gl 4 25g1、25g1 Q5 25^1 25 卩1弃去实践二病毒血凝和血凝抑制试验--（以新城疫为例）实践目的：1 •掌握血凝（HA 和血凝抑制（HI ）试验的原理2 •掌握鸡新城疫病毒血凝和血凝抑制试验的操作方法实践原理：某些病毒（如鸡新城疫病毒，禽流感病毒等）能够与人或动物的红细胞发生凝集， 此即为 红细胞凝集现象。

这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异性抗体 （免疫血清）所抑制, 即为红细胞凝集抑制试验。

实践内容：1.红细胞凝集试验（HA 试验）主要是测定病毒的红细胞凝集价，以确定红细胞凝集抑制试验所用病毒稀释倍数（抗原单位）。

有试管法和微量法两种，现以常用的微量法进行说明。

鸡新城疫病毒的HA 试验现采用微量法，在 V 形微量反应板上进行。

（1） 首先用微量移液器向每个孔加入稀释液即灭菌生理盐水一滴 （25卩I ）。

（2）用微量移液器取病毒抗原液 25卩1加入第1孔内，吸头浸于液体中缓慢吸吹几次使病毒与稀释液混合均匀，再吸取25^1液体小心地移至第 2孔，如此连续稀释至第11孔，第11孔吸取25 ^1液体弃掉；病毒稀释倍数依为1:2〜1:2048，第12孔为红细胞对照。

（3） 再以微量移液器每孔加1.0 %红细胞悬浮液1滴（25卩I ）。

（4） 在振荡器上振荡混匀约 I 〜2分钟，再置37 C 作用15分钟后观察结果。

（5）每次测定样品都应同时做红细胞对照。

表1鸡新城疫血凝效价（HA ）的测定术式（微量法）孔号1 234567891011 12病毒稀释倍数 1:2 1:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048 对照1%红细胞悬液 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 25g1 感作 置振荡器上混匀1〜2分钟，放37 C 静置15分钟结果例示 # # # # # # # ++ - - - -表示%完全凝集 表示%凝集 表示不凝集结果判定：将反应板倾斜成45度角，沉于管底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者沉淀, 表明红细胞未被或不完全被病毒凝集； 如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。

血凝抑制实验报告血凝抑制实验报告随着个人素养的提升，大家逐渐认识到报告的重要性，报告具有成文事后性的特点。

那么一般报告是怎么写的呢？以下是帮大家整理的血凝抑制实验报告，希望对大家有所帮助。

血凝抑制实验报告1禽流感血凝和血凝抑制试验可用于血清中抗体水平的监测，也可用于推断未使用疫苗群体的感染状态等。

该试验是目前世界卫生组织和国际动物健康组织进行全球流感监测所普遍采纳的方法，而且因其具有经济、快速、可靠、操作简便、能够处理大量的样品，并能在短时间内报告禽流感抗体水平等优点，已经成为当前基层兽医实验室禽流感疫病监测和免疫抗体检测中最为常用的方法。

但因该试验受人为操作影响较大，经常因操作不规范、不严谨等造成结果偏差大、重复性差等问题，现根据几年来的工作经验对该试验过程中应注意的事项做一探讨。

一、血凝试验操作程序1、取96孔90°V形酶标板，用微量移液器在第一至第五排的1~12孔每孔加25μLPBS液。

2、吸取25μL标准禽流感抗原加入到第一排第1孔中充分混匀。

3、从第1孔吸取25μL混匀后的抗原液加到第2孔中，混匀后吸取25μL加入到第3孔中，依次进行倍比稀释至第二排最后一孔即第24孔，最后弃去25μL。

第三排孔至第四排孔同上操作。

4、依次向第一至第五排孔的每孔中加入25μL1%的鸡红细胞悬液。

5、将酶标板置于微量振荡器上振荡10秒，室温（20-25℃）静置30min观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。

6、结果判定：将板作45°倾斜，观察红细胞是否呈泪滴状流淌。

以完全凝集（不流淌）的抗原或病毒稀释倍数为1个血凝单位（HAU）二、血凝抑制试验操作程序1、根据血凝试验结果配制4HAU抗原。

（即1HAU抗原除以4） 2、取96孔V形酶标板，用移液器在第1~12孔各加入25μLPBS。

3、在第1孔加入25μL被检血清，充分混匀后移出25μL 加至第2孔，依次类推，倍比稀释至第12孔，弃去25μL。

病毒的血凝试验某些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集试验(HA)，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的血凝可为相应的特异抗体所抑制，即血球凝集抑制试验(HI)，具有特异性。

通过HA—HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。

一、目的要求掌握HA和HI的基本操作技术，了解其实用价值。

二、实验材料新城疫病毒液0.1mL，1％鸡红细胞50mL，生理盐水50mL，阳性血清0.5mL,96孔“U”形或“V”形微量反应板，50微升定量移液管，滴头。

实验内容及操作程序1．血球凝集试验(HA)以新城疫病毒为例，操作过程如下(表 8—1)。

(1)在96孔“V”形微量反应板上进行，自左至右各孔加50uL生理盐水。

(2)于左侧第1孔加50uL病毒原液或收获液，混合均匀后，吸50uL至第2孔，混合均匀后，吸50uL至第3孔，依次倍比稀释，至第11孔，吸弃 50uL，稀释后病毒稀释度为第1孔1：2，第2孔1：4，第3孔1：8……。

最后1孔为对照。

(3)自左至右依次向各孔加1％鸡红细胞50uL置微型混合器上振荡lmin或以后固定转圈振荡反应板，使血球与病毒充分混合，在37℃温箱中作用15~30min后，待对照红细胞已沉淀可观察结果。

(4)判定结果：以100％凝集(血球呈颗粒性伞状凝集沉于孔底)的病毒最大稀释孔为该病毒血凝价，即一个凝集单位，不凝集者红细胞沉于孔底呈点状。

表8-1 血细胞凝集(HA)试验表从表7-1看出，本病毒的血凝价为1：128，则1：128的0.1mL中有1个凝集单位，1：64、1：32分别为2、4个凝集单位。

或将128／4=32，即1：32为4个凝集单位，第12孔为血球对照应不凝集。