毕赤酵母常用表达载体

毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。

不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。

它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。

同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。

这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。

与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。

例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。

毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。

甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。

为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。

由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。

而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。

两种醇氧化酶蛋白：毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。

细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。

甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。

AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。

AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。

表达：AOX1基因的表达在转录水平受调控。

毕赤酵母表达知识归纳1a.配制500×BIOTIN stock solution（0.02％）有这么3种方案：1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；3、水浴加热，温度不能高于50度。

D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。

在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。

天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。

b.有几个比较迷惑的问题请教大家：(很典型的小问题）1、制感受态细胞，OD多少比较好？pyrimidine 战友的方法：取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中。

说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低2、关于高效转化法，文献说用(LiAc)，而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用(LiAc)没用，要用LiCl。

Lithium acetate does not work with Pichia pastoris. Use only lithium chloride.3、YNB到底能高温灭么？有的说能有的说不能。

过滤灭菌的怎么操作？我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。

然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。

4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。

该115度还是121度灭？网上搜了下，都有人用！5、电转化参数用400欧还是200欧？有的用400，有的还专门说不是用400。

都是从园里看到的！电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400）6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？如果不想筛高拷贝的，是否PCR验证一下即可？网友的回答：ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的。

invitrogen手册上可以灭菌的。

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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。

不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。

它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。

同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。

这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。

与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。

例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。

毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。

甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。

为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。

毕赤酵母表达实验手册作者：Jnuxz 来源：丁香园时间：2007-9-5大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。

然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。

大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。

另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。

包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。

大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。

但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。

近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。

因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。

［1］。

同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。

酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。

1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。

干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。

毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。

然而，许多蛋白质在翻译的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。

大肠杆菌缺少适合用于表达结构复杂的蛋白质。

另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。

包含体的形成虽然简化了产物的纯的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。

因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。

大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过其主要优点是成本低、产量高、易于操作。

但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。

近年程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵间题［1］。

与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的们对酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）分子遗传学方面的认识最早，酿酒酵母也最先作为外宿主．1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因一干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得素和胰岛素已大量生产并在人群中广泛应用，但很大部分表达由实验室扩展到工业规模时，培养基数的选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，而大多数外源基因的高效表达需要高拷贝数的量下降。

同时，实验室用培养基复杂而昂贵，采用工业规模能够接受的培养基时，往往导致产量的酵母的局限，人们发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源来发展最为迅速，应用也最为广泛，已利用此系统表达了一系列有重要生物学活性的蛋自质。

毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。

此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。

当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。

毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。

而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。

分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。

胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。

工程菌株Y11430，MG1003，GS115 （AOX1），KM71，SMD1168。

毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。

其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。

多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。

含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。

体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。

多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE 电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。

毕赤酵母的培养巴斯德毕赤酵母是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。

与其它酵母一样，在无性生长期主要以单倍体形式存在，当环境营养限制时，常诱导2个生理类型不同的接合型单倍体细胞交配，融合成双倍体。

比赤酵母表达常用的培养基：1 LB培养基胰蛋白胨1% 酵母粉0.5% 氯化钠1% PH 7.0----------------大肠杆菌培养制作平板加入2%的琼脂粉，121摄氏度20分钟，可于室温保存。

用于培养pPICZ αA 原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug / mL（博来霉素，抗菌素）宿主细胞His- -----------诱变造成的。

MD------------酵母转化筛选培养基（营养缺陷型His-）13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖用于表达的毕赤酵母都属于组氨酸缺陷型的只有染色体上成功整合入重组质粒载体基因的毕赤酵母菌株才能在组氨酸缺失的MD培养基生长，以此筛选出重组子。

MM--------------酵母转化进一步筛选培养基仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，成为基本培养基（minimal medium,MM），有时用符号“[ －]”来表示。

不同微生物的基本培养基是不相同的。

2 LLB 培养基胰蛋白胨1% 酵母粉0.5% 氯化钠0.5%PH 7.0制作平板时加入2％琼脂粉。

121℃高压灭菌20min。

可于室温保存数月。

用于培养pPICZ αA 原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2 周.3 YPD培养基酵母粉1%，胰蛋白胨2%，葡萄糖2%，固体加2%的琼脂粉，YPD 培养基可常温保存,是毕赤酵母的最基本培养基，琼脂YPD 平板在4℃可保存几个月。

加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ 培养基，可以4℃条件下保存1～2 周。

4 BMGY培养基酵母粉1% 蛋白胨2%，磷酸钾缓冲溶液平PH 6 100mmol/L YNB（酵母氮源）1.34% 生物素（4×10 -5）%甘油1%，毕赤酵母诱导表达前培养基，YNB和Biotin过滤除菌。

猫血清白蛋白重组蛋白及其在毕赤酵母中的表达方法
猫血清白蛋白重组蛋白是一种重要的生物活性蛋白，具有多种生物学功能，如维持血浆渗透压、运输物质、免疫防御等。

在毕赤酵母中表达猫血清白蛋白重组蛋白，有助于研究该蛋白的结构和功能，并为生物制药、生物材料等领域提供重要资源。

猫血清白蛋白重组蛋白在毕赤酵母中的表达方法如下：
1. 基因克隆：首先从猫基因组数据库中获取猫血清白蛋白基因序列，通过 PCR 扩增得到目的基因。

然后，将目的基因与毕赤酵母的穿梭载体（如 pPICZα）进行重组，构建表达载体。

2. 转化毕赤酵母：将构建好的表达载体转化到毕赤酵母细胞中，通过筛选抗性平板得到转化子。

3. 诱导表达：在含有一定浓度诱导剂（如甲醇）的培养基中，培养转化子，诱导目的蛋白的表达。

甲醇诱导剂可以激活重组蛋白的表达，且在一定范围内，甲醇浓度越高，表达量也越高。

但过高的甲醇浓度会影响酵母的生长。

4. 蛋白纯化：诱导表达后的酵母细胞经过破碎、离心等步骤，获取含目的蛋白的的上清液。

然后，利用离子交换层析、凝胶过滤等方法对目的蛋白进行纯化。

5. 活性鉴定：对纯化的猫血清白蛋白重组蛋白进行活性鉴定，检测其在生理功能方面的表现，如抗氧化、抗炎等。

6. 应用：猫血清白蛋白重组蛋白在生物制药、生物材料等领域具有广泛应用前景。

例如，它可以作为生物制药的原料，用于治疗疾
病；也可以作为生物材料，用于组织工程和再生医学等。

总之，通过以上方法，可以在毕赤酵母中表达猫血清白蛋白重组蛋白，并进行纯化和活性鉴定。

这为研究猫血清白蛋白的结构和功能，以及将其应用于生物制药、生物材料等领域奠定了基础。

hITF毕赤酵母表达载体的构建及分泌表达孙勇,彭曦,张勇,吕尚军,汪仕良(第三军医大学西南医院全军烧伤研究所,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆400038)提要:目的构建hITF毕赤酵母分泌型表达载体,表达重组hITF,为功能研究奠定基础。

方法通过PCR获得hITFcDNA片段,将目的基因插入酵母表达载体pGAPZαA分泌信号下游,得到重组载体pGAPZαA-hITF。

BspHⅠ线性化后氯化锂转化进入X-33, Zeocin筛选转化酵母菌, PCR鉴定目的基因。

阳性转化子经摇瓶表达,取上清TCA沉淀后做Tricine SDS-PAGE分析及Western blot检测。

结果经测序及PCR证实, hITFcDNA准确插入酵母表达载体pGAPZαA中,氯化锂转化后,重组载体通过同源重组整合进入酵母基因组中。

Tricine SDS-PAGE分析证明hITF的分子量约为10×103,Western blot分析表明,表达蛋白具有良好的抗原性和特异性。

结论成功构建出酵母表达载体pGAPZαA-hITF,获得重组hITF,为深入研究hITF 奠定了基础。

关键词:人肠三叶因子;毕赤巴斯德酵母;分泌表达中图法分类号:R379;R394-33;R394. 3文献标识码:AConstruction of hITF yeast expression vector and secreted expression of hITF inPichia pastorisSUN Yong,PENG Xi,ZHANGYong,LU Shang-jun,WANG Shi-liang(StateKeyLaboratory ofTrauma,Burns and CombinedInjury,Institute ofBurns,SouthwestHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing 400038,China)Abstract:Objective To constructPichia pastorissecreted expression vector of hITF,express recombinanthITF and underlie the base of function analyses.Methods The hITF gene encodingmature peptidewasamplified by polymerase chain reaction,and then inserted into the downstream of the alpha-mating factor signalof theP. pastorisexpression vector pGAPZαA. Recombinantplasmid pGAPZαA-hITF was linearized byBspHⅠand transform ed into theP. pastorisstrainX-33with lithium chloride. Zeocin resistantcloneswere chosen byYPD plates containing 100μg/ml Zeocin and the presence of insertwas identified using PCR. The positivetransformantswere fermented inflask and the proteins in the culture supernatantwere deposited with TCA andassayedwithTricine SDS-PAGE andWestern blotting.Results Itwas proved that the fragmentamplifiedwasinserted into theP. pastorisexpression vector pGAPZαA correctly by PCR and gene sequencing. After lithiumchloride transformation,the recombinantplasmidwas integrated into the regionsofhomologywithin the yeastgenome. Tricine SDS-PAGE analysis proved that the molecularweight of hITF was about10×103andWesternblotting demonstrated that the expression proteinshave good antigenicity andspecificity.Conclusion ITFP.pastorisexpression vectorwassuccessfully constructed and recombinanthITF was expressed. This research layfoundation for the further function studying ofhITF.Key words:human intestinal trefoil factor;Pichiapastoris;secreted expression肠三叶因子( intestinal trefoil factor, ITF)是1991年发现的特异分布于肠道的小分子蛋白[1],它由59个氨基酸残基构成,分子量约6. 7×103,属于三叶肽家族。