下载文档原格式
LabAlliace高效液相色谱系统培训教材一、液相色谱系统的基本原理1、色谱法分类按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。
气相色谱法适用于分离挥发性化合物。
GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以GLC应用最广。
液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。
LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。
此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。
按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法。
(此外还有电泳)。
按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。
2、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。
高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
Alliance LC使用方法1．开机自检及登陆操作系统检查仪器电源、流动相及管路连线是否正常；打开Waters 2695电源开关，仪器开始自检（4-5min），待屏幕上方出现“Idle”字样表示自检成功；根据检测需要，打开2998 PDA或者2424 ELSD、2489 UV检测器电源开关；打开电脑，双击Empower图标，输入用户名及密码，登陆操作系统。
2．脱气（Degas）按面板右下方“Menu/Status”键进入“Status（1）”界面，移动光标至“Degasser Mode”，按Enter选择“On”，打开在线脱气。
建议流动相可以先使用超声波振荡脱气1 min，再开机进行在线脱气。
3．设定柱温（可选项）在“Status（1）”界面，移动光标至“Col Htr Set”，输入目标温度按Enter即可。
（也可在工作站方法中设置）4．Prime Seal Wash（清洗柱塞杆）按“Menu/Status”键回到“Menu”界面，按下排功能键“Diag”，然后再按下排功能键“Prime Seal Wsh”，“Start”，冲洗1-2min后，“HALT”，“CLOSE”。
5．Wet Prime在“Status（1）”界面中“Composition”下，选择将用到的溶剂通道为“100%”，按液晶屏幕右下角“Direct Function”键，移动光标选择“3 Wet Prime”，“OK”，流速及时间可使用默认值，也可自行设定（如：5 mL/min，3min），“OK”即可。
将每一个会用到的溶剂通道按照上述操作一次。
6．Purge Injector（注射器排气泡及清洗）进入“Direct Function”界面后，选择“4 Purge Injector”，“OK”，默认数值为6，“OK”。
7．Prime Needle Wash（清洗注射针）进入“Diagnostics”界面，按下排功能键之“Prime Ndl Wsh”，“Start”，默认30秒钟，“Close”，即可返回“Diagnostics”界面。
高效液相色谱仪操作步骤及注意事项汇总1. 过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。
2. 对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。
3.打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。
4进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。
5. 有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。
冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。
冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10?ml/min。
6. 调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。
点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。
7. 设计走样方法。
点击file，选取select?users?and?methods，可以选取现有的各种走样方法。
若需建立一个新的方法，点击new?method。
选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。
选完后，点击protocol。
一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。
8. 进样和进样后操作。
选定走样方法，点击start。
进样，所有的样品均需过滤。
方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。
全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。
9．填写登记本，由负责人签字。
10．流动相均需色谱纯度，水用20m的去离子水。
脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。
11．柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。
12．所有过柱子的液体均需严格的过滤。
13．压力不能太大，最好不要超过2000 psi。
选择波长要从以下几个方面考虑：1. 检测波长要大于溶剂截止波长。
如果所选择的波长下溶剂有很强的吸收当然是不合适的。
高效液相色谱仪操作规程1开机先打开电脑，再依次接通2695分离单元、检测器和打印机的电源（注：在打开2424蒸发光散射检测器电源之前，先开启气体供应）。
接通2695分离单元后，约20秒仪器自检，约1分钟后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化，待主屏幕上主标题区出现“Idle”仪器自检通过，进入待命状态。
2溶剂管理系统的准备2.1流动相的脱气确认所有溶剂管路都充满溶剂，按[Menu/Status]，进入“Status（1）”屏幕，光标选“Degasser”按[Enter]显示选项屏幕，Mode为“on”。
2.2启动溶剂管理系统2.2.1干启动当溶剂的管路是干的或是需要更换溶剂时，在“Status（1）”屏幕下，按[Direct Function]，光标选中“Dry Prime”，按[Enter]，显示“Dry Prime”屏幕，按欲启动的溶剂管路的屏幕键，如[Open A]，光标选“Duration”，按数字键输入时间（一般为5分钟），按[Continue]，待限定时间结束后，重复操作，使实验所需的各溶剂管路均启动、排气并充满流动相。
2.2.2湿启动在“Status（1）”屏幕下，光标选“Composition”中欲使用的流动相，输入100%，按[Direct Function]，光标选“Wet prime”，按“Enter”，显示Wet prime”屏幕，输入流速和时间（5ml/min和5min）按[OK]。
待限定时间结束后，对每种流动相重复操作。
3样品管理系统的准备A管带黄色标记、B管带蓝色标记号、C管带红色标记、D管带绿色标记，绿色管为冲洗泵头用，白色管为冲洗进样器用，所用溶剂均为甲醇：水=50%（v/v）。
将样品瓶插到样品盘合适的位置，打开样品仓门，显示“Door is Open”屏幕，装入样品盘，按[Next]，直至所有样品盘装毕，关仓门。
4编辑分析方法及执行样品分析表4.1创建项目双击电脑桌面图标“Empower”，用户名输入“system”密码输入“manager”选中操作项目和色谱系统→确定。
1. 开机自检具体操作如下：（1）打开Alliance 2695和2489的电源开关至ON，仪器开始自检；（2）仪器进行大约5分钟的自检过程，待仪器自我测试完毕后，出现画面上方的状态显示区出现Idle，表示开机测试正常。
（3）打开Empower软件，进入系统(用户名system，密码manager)2. 流动相（1）有机溶剂要求用色谱纯（进口名牌最好），水合缓冲盐溶液要用超纯水，每48小时制备新鲜的水相流动相，尤其是100%含水流动相使用时间不超过两天。
（2）检查6根管子是否都在液面以下，溶剂的位置必须高于溶剂混合阀，并检查、计算溶剂的用量，不够需及时配制、添加。
洗针液的溶剂瓶应放于试验台面上，与2695仪器底部位于同一水平面上。
（3）柱塞密封垫（Seal Wash）、针以及进样器选用甲醇进行清洗，所用所有溶剂或溶液均需用0.45μm的膜过滤并超声脱气20分钟，用洁净的玻璃容器盛放，避免污染，同时玻璃容器应用超纯水清洗而不能用自来水。
3. 灌注柱塞密封清洗清洗操作步骤：（1）回到Menu画面，选择Diag，确定Seal Wash的管路放在正确的位置；（2）按Prime Sealwash，再按Start，直到清洗溶剂流出泵杆密封圈冲洗废液管，先按Halt，再按Close4. 灌注针头清洗操作步骤：回到Main画面，选择Diag，按下Prime NdlWash。
设定值为30秒，若想多洗几次，按Start Again。
5. 打开真空脱气机如液相仪管路干，可进行使用，如管路不干则按照以下步骤进行操作：按Menu/Status键，进入Status(1)画面；利用方向键将光标移至Degasser位置，按Enter；利用上下键选择模式为ON。
注意在开启除气装置时，要确认所用溶剂管路都充满溶剂；若没有溶剂时请执行溶剂的Dry Prime操作。
6. 执行干灌注确定流动相溶剂的管子放在正确的位置，检测器（Detector）废液管及定量环（Sample Loop）的废液管是否放置于适当的废液容器中。
页码：1/4编号：SOP-QA-010201生效日期：年月日标准操作规程STANDARD OPERA TING PROCEDURE题目Alliance2695型高压液相色谱仪标准操作规程Subject颁发部门质量保证部Issue Department起草日期年月日Written by Date审核日期年月日Examined by Date批准日期年月日Approved by Date分发质量保证部、中心化验室、档案室Receiver1 目的：建立Alliance 2695型高效液相色谱仪标准操作规程，以保证Alliance 2695型高效液相色谱仪的正确使用。
2 范围：适用于Alliance 2695型高效液相色谱仪操作的全部行为。
3 责任：中心化验室对本SOP的实施全面负责。
4 内容：4．1 开机4．1．1接通仪器插座电源开关。
4．1．2 先打开2695主机的电源开关，再打开2996检测器的电源开关。
4．1．3待2695主机与2996检测器自检完毕后，打开电脑显示器、电脑主机电源开关，计算机开始自检进入Windows 2000桌面。
4．1．4在电脑屏幕上用鼠标双击Millennium32（M32）图标。
进入Waters高压液相操作系统主窗口。
4．1．5单击M32主窗口上“Login”键，当出现User name提示时，输入使用者代号，在Password提示里输入此代号对应密码。
再按回车键即可激活Millennium32操作窗口。
4．2 硬件操作4．2．1溶剂脱气先打开氦气瓶气体阀门，将分压表调至0．5MPa；按“Menu/Status”键，进入“Status(1)”界面，用“↑”、“↓”、“←”、“→”键在界面上“Sparge”项中，选择A、B、C或D中所选用的溶剂流路号进行脱气处理（如选用A、B两瓶溶剂，则选择A-100%，B-100%，按“Enter”键开始脱气），脱气15～20分钟后，可将脱气量由100%降为30%。
高效液相软件操作方法
以下是高效液相软件操作方法：
1. 创建项目：打开高效液相软件后，选择“新建项目”，输入项目名称和相关信息，创建新的项目。
2. 输入试样信息：在新建项目后，可输入试样信息，包括样品名称、样品编号、分析日期等。
输入完毕后，保存信息。
3. 创建实验方法：在新建项目中，可创建实验方法。
点击“实验方法”选项卡，选择“新建方法”，输入方法名称和相关信息，设置实验条件和参数。
4. 导入样品：在“样品”选项卡中，选择“导入样品”，选择需要分析的样品列表，将样品导入到项目中。
5. 运行实验：选择实验方法后，点击“运行实验”，系统将开始执行实验方法。
实验结果将自动保存。
6. 数据分析：在“分析结果”选项卡中，可查看和分析实验结果。
根据需要选择分析方法，进行数据分析和结果呈现。
7. 数据输出：在数据分析后，可将分析结果输出为PDF、Excel等格式。
选择
“输出数据”选项卡，设置输出格式和参数，将分析结果输出到指定位置。
以上是高效液相软件的基本操作方法，具体操作方法可能因不同厂家软件版本略有不同。
LabAlliace高效液相色谱系统培训教材一、液相色谱系统的基本原理1、色谱法分类按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。
气相色谱法适用于分离挥发性化合物。
GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以GLC应用最广。
液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。
LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。
此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。
按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法。
(此外还有电泳)。
按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。
2、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。
高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
高效液相色谱法标准操作程序高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1 对仪器的一般要求和色谱条件所用的仪器为高效液相色谱仪，由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成，仪器应按现行国家技术监督局“液相色谱仪检定规程”定期检定并符合有关规定。
1.1 色谱柱最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。
反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等）也有使用。
正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。
离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异构体的分离通常使用手性填充剂。
填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留行为和分离效果。
孔径在15nm （1nm=10Å）以下的填料适合于分析分子量小于2000 的化合物，分子量大于2000 的化合物则应选择孔径在30nm 以上的填料。
除另有规定外，普通分析柱的填充剂粒径一般在3μm~10μm 之间。
粒径更小（约2μm）的填充剂常用于填装微径柱（内径约2mm）。
使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当的调整。
当对其测定结果产生争议时，应以品种正文规定的色谱条件的测定结果为准。
以硅胶为载体的普通键合固定相的使用温度通常不超过35℃，为改善分离效果可适当提高色谱柱的使用温度，但不能超过60℃。
流动相的pH 值应控制在2～8 之间。
当pH 值大于8 时，可使载体硅胶溶解；当pH 值小于2 时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。
