高效液相色谱方法及应用 ppt课件

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高效液相色谱法 PPT课件

①固定相：非极性键合相如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）
键合硅胶 ②流动相：水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调整剂
常用甲醇－水、乙腈－水等应用：最广。非极性至中等极性的组分，（还有有机酸、碱及盐等极性组分）
1. 保留机制:
疏溶剂理论（solvophobic theory）
（二）紫外检测器(ultraviolet detector)
1.检测原理：朗伯－比尔 (Lambert-Beer) 定律，响应信号（吸光度）与浓度成正比A=εCl
2.特点：灵敏度较高（10-6—10-9 g/ml），噪音低，线性范围宽，稳定性好，适于梯度洗脱，不破坏样品，应用广（分析、制备）。
三.与气相色谱法相比
气相试样
液相试样气相流动相液相流动相气相柱温液相柱温
气体、容易转
气体、常用氢气液体、、氮气
可用的
高柱温
溶剂较多
常温
变为气
固体
体的液
体
第一节高效液相色谱法的主要类型和原理
一、主要类型
四类基本类型色谱法分配色谱法（partition chromatography）吸附色谱法（adsorption chromatography）离子交换色谱法（IEC）空间排阻色谱法（SEC）
（二）流动相的强度和选择性
1.溶剂的极性（强度）正相色谱：溶剂极性越强，洗脱能力越强反相色谱：极性弱的溶剂洗脱能力强 2.溶剂的选择性
不同种类的溶剂，分子间的作用力不同，故选择性不同
混合溶剂（二元或多元流动相）
以反相色谱流动相的选择为例：
反相色谱常用溶剂的强度因子
水
甲醇
乙腈

《高效液相》课件

蛋白质分离与纯化
蛋白质分离
高效液相色谱技术可以用于蛋白质的分离和纯化，通过不同的分离模式和固定相选择，实现对蛋白质的快速分离和纯化。
蛋白质性质分析
通过高效液相色谱技术可以对蛋白质的性质进行分析，如蛋白质的分子量、等电点等，为蛋白质的结构和功能研究提供有力支持。
蛋白质相互作用研究
高效液相色谱技术可以用于研究蛋白质之间的相互作用，如蛋白质与配体、抑制剂等之间的相互作用，有助于深入了解蛋白质的功能和作用机制。
原理
利用不同物质在固定相和流动相之间的分配系数差异进行分离，通过检测器进行检测，收集各个组分，达到分析样品组分的目的。
发展历程
01
02
03
04
起源
20世纪初，俄国植物学家茨维特发明了色谱法。
1940年代
气相色谱法（GC）出现，并逐渐发展成熟。
1960年代
高效液相色谱法（HPLC）开始发展，并逐渐取代气相色谱
02
高效液相色谱仪
仪器组成
进样器
将样品注入色谱柱，是色谱仪的重要部件之一
。
色谱柱
用于分离样品中的各组分，由固定相和流动相
组成。
检测器
检测色谱柱流出的组分，并将其转换为电信号
。
数据处理系统
用于采集、处理和显示检测器输出的信号。
重要部件介绍
01
02
03
色谱柱填料
常用的填料有硅胶、氧化铝、活性炭等，根据不同分离需求选择合适的填料。
《高效液相》ppt课件
目录
• 高效液相色谱法简介 • 高效液相色谱仪 • 高效液相色谱分离技术 • 高效液相色谱在生物医药领域的应用 • 高效液相色谱实验技术 • 高效液相色谱技术前沿与展望

高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt

色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验色谱法原理色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ，低压汞灯。
② 可调波长： 190 ～ 800mm ，钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱石英窗光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统

waters-e高效液相色谱ppt课件

4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用甲醇水溶液冲洗。 5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水冲洗及
保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水极性太强且易长霉。。 6.开机时，流速和柱压要逐渐增加。 7.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。当流动相含有一个分开的化合物谱带，高效液相色谱可以收集含有纯
化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。
注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。
高检将效测电器信液连号相接转计换色算为谱机色数谱如据图站，何在，工显高示效作屏液上相展色现谱出系来统。单元先记录电信号，再
液相色谱的基本流程图
流动相
进样阀泵
色谱柱
泵输液进样
分离
检测器
检测
AB C
DE
G
F
记录
液液相相流色色动谱谱相实：的验种所类各需及的部配基比分本，参示等数度-意-或亦梯图称度色谱条件
固定相：色谱柱类型及内径、长短流动相输送系统参数：流速检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等温度控制进样量
四元梯度洗脱的溶剂输送动进样系统柱温箱液晶显示器内置的柱塞杆密封垫清洗系统溶剂瓶托盘键盘用户界面及软盘驱动器
打开电源至on位置，开机依次接通 2695 分离单元、检测
2器开、机计算机和打印机的电源。接通后，约 20s 仪器开始自
检，约 1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化。
溶流【剂动M管相en理脱u/气系St确a统tu认s的所】有，准溶进备剂入管“路St都at充us满（溶1 剂），”按屏幕

高效液相色谱操作步骤ppt课件

2：冲洗进样系统
a:清洗手动进样阀，将手动进样阀的扳手逆时针扳到头，用一次性平头微量注p射pt课器件完吸整入2~4ml的50%甲 14
十二：关机
依次关闭检测器的氘灯将高压泵的流速降为“0” 关闭检测器开关关闭高压泵开关关闭仪器色谱工作站关闭检测器电源开关关闭高压泵电源开关关闭柱温箱电源开关关闭电脑开关关闭稳压电源开关并在仪器使用登记本上记录p环pt课境件完温整度、湿度、仪器工 15
分析速度快等。
拧紧色谱柱的接口
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6
四：放置流动相
1：将储存流动相的贮 2：更换仪器泵头里清液瓶放置于贮液瓶架上洗瓶中的超纯水（以确保仪器外回路系统清洁和良好的工作状态）
清洗瓶
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7
五：开机
依次打开：稳压器柱温箱高压泵检测器计算机电源开关
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2：设定分析方法的方
法文件（文件名称，表
示浓度的单位）
3：设定样品分析表
简（而标言准之名称：、软测件定的次各数种、设置；繁杂但不复杂
样品名称、编号）
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11
九：进样分析
1：启动设置程序文件、设定分析方法的方法文件、设定样品分析表按照样品分析表的顺序，用平头微量注射器将经过0.45um滤膜过滤的标准溶液和样品溶液逐次注入六通进样阀中，
头）进入高效液相色谱用一次性注射器和一次
仪样品液都必须经过样性滤头过滤后，加入2ml
品过滤装置过滤
具塞试管中备用。
一次性滤头：由机系、水系组成；
滤膜的孔径为0.45um
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5
三：色谱柱的连接
将色谱柱按流动相流动方向即色谱柱标示箭头

高效液相色谱HPLC简介.ppt

种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不
同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
2
操作过程图示
3
色谱分离的机理
分离是一个物理的过程。
固定相(Stationary Phase) 流动相(Mobile Phase) 样品 (溶解于流动相中的溶质)
4
项目进样方式流动相分离原理检测器
14
液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反；固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。反相键合相色谱柱最常用的就是ODS柱，也就是C18柱。
15
液相色谱类型
• 正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。 • 反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。
16
色谱柱简介
• 正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2）和氰基团（CN）的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯甲烷等。
9
检测器简介（二）
◆ 电导检测器（ECD）原理：监测溶液的电导率变化的检测器。特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组成变化有明显响应、灵敏度低（10-3g）。适用于离子型化合物。

高效液相色谱法教学精【全】ppt课件

§1-3 色谱柱的分离效率
一、塔板理论塔板理论认为: 一根柱子可以分为n
段，每段内组分在两相间迅速达到平衡，把每一段称为一块理论塔板。
设柱长为L，理论塔板高度为H，则
H=L/Ｎ
Ｎ为理论塔板数。
理论塔板数一N
①色谱峰对称： N 16(tR )2
说明：
tW
a. 在给定的操作条件下，N几乎相同
三、高效液相色谱法的特点
高压: 以液体作为流动相，液体流经色谱柱时，
受到阻力较大必须对流动相施加高压。一般可达到150～300kg／cm2，甚至可达700kg／cm2以上。
高速:
分析时间较经典液相色谱少得多（交换速度快），一个复杂样品的分析仅需几分钟到几十分钟。
高效:
气相色谱的分离效能很高，高效液相色谱的柱效则更高（化学键合相），一般约可达 6000理论塔板／米
②一定色谱条件下，对k’有差异的组
分，则柱效愈高，分离效果愈好。
塔板理论的特点和不足：
(1)当L一定时，N 越大(H 越小)，被测组
分在柱内被分配的次数越多，柱效越高，所得色谱峰越窄。 (2)柱效不能表示被分离组分的实际分离
效果：如两组分的分配系数K 相同，
无论该色谱柱的柱效多大，都无法分离。
① 柱效较高，ΔK(分配系数)较大，完全分离。 ② ΔK 不是很大，柱效较高，峰较窄，基本分离。 ③ 柱效较低，ΔK 较大，但分离的不好。 ④ ΔK 小，柱效低，分离效果更差。
一．分离度的数学表达式：
Rs
2(tR 2 tR1 ) W2 W1
2(tR 2 tR1 )
1.699 [Y1/ 2(2) Y1/ 2(1) ]
于世林编著)
第一章高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述一、色谱法

高效液相色谱仪使用与操作规程(学生用PPT培训课件

高效液相色谱仪使用与操作规程(学生用ppt培训课件
目录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的安装与调试 • 高效液相色谱仪的使用步骤 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 安全注意事项 • 高效液相色谱仪的发展趋势与展
望
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分析复杂混合物中各组分的仪器，广泛应用于化学、制药、食品、环保等领域。
检测器技术升级
发展高灵敏度、高稳定性和高可靠性的检测器，提高检测精度和
可靠性。
应用领域拓展
新药研发
高效液相色谱技术在药物分析、药物代谢和药物动力学等领域发挥重要作用。
环境监测
用于检测水体、土壤和空气中的污染物和有害物质，为环境保护提供有力支持。
食品安全
用于检测食品中的农药残留、添加剂、毒素等有害物质，保障食品安全。
确保实验室环境干燥、清洁，避免仪器受潮或落尘。
操作时应避免剧烈振动仪器，以防损坏内部组件。
仪器安全
定期检查仪器管路是否漏液，若有漏液应及时处理。
仪器应放置在通风橱内，以防气体泄漏对实验人员造成危害。
仪器使用完毕后应关闭所有电源，并按照仪器说明书进行保养。
数据安全与保密
操作过程中避免无关人员靠近仪器，以防误操作导致数据丢失或损坏。
仪器保养与校正
01
02
03
04
定期对仪器进行全面检查，包括泵、进样阀、色谱柱和检测
器等部件。
根据仪器使用情况，适时清洗或更换泵内滤网、色谱柱和检
测器。
按照厂家推荐，使用专用工具和材料进行保养和校正。
定期对仪器进行性能验证，确保其准确性和可靠性。

《高效液相色谱仪》课件

《高效液相色谱仪》ppt课件
目录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的组成和工作原理 • 高效液相色谱仪的操作流程 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 高效液相色谱仪的实验技术与应用实例
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分析复杂混合物中各组分的仪器，基于物质在固定相和流动相之间的分配差异实现分离。
。
食品工业
用于检测食品中的添加剂、农药残留和营养成分等。
高效液相色谱仪的发展历程
起源
20世纪50年代初，基于经典液相柱色谱的原理，开发出了高
效液相色谱法。
发展
20世纪60年代，出现了填充柱和柱切换技术，提高了分离效率。
革新
20世纪70年代，出现了高效微粒固定相和新型检测器，提高了灵敏度和选择性。
流动相的纯化和过滤
确保流动相的纯度和清洁度，以避免对色谱柱和检测器造成污染。
流动相的脱气
使用真空脱气法或超声波脱气法去除流动相中的气泡，以避免对色谱分离造成干扰。
色谱柱的安装与选择
安装色谱柱
按照仪器说明书正确安装色谱柱，确保密封性和稳定性。
色谱柱的选择
根据样品的性质和分离要求，选择合适的色谱柱类型和规格。
检测器对流出的组分进行检测，并将信号记录下来，形成色谱图。
高效液相色谱仪的分离原理
分配原理
组分在固定相和流动相之间的分配平衡是实现物质分离的基础。
吸附与解吸平衡
组分在固定相上的吸附与流动相中的溶解度差异导致分离。
分子间作用力
分子间的相互作用力（如范德华力、氢键等）影响组分的吸附与解吸平衡。
物的分子结构和化学键信息。

高效液相色谱法培训PPT课件

注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯度斜率，使各组分在合适的保留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分能够充分分离，同时避免过长的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度，确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测组分浓度在该范围内时，测定结果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性，确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控制图，包括平均值、标准差和控制限等指标。
VS
发展历程及应用领域

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据统计，在已知化合物中，能用气相色谱测量的约占20％；能用高效液相色谱测量的达到70％～80％。三、高效液相色谱法的特点 1.分离效能高 2.选择性高 3.检测灵敏度高 4.分析速度快
高效液相色谱法的分类
按溶质在两相分离过程中的物理化学原理分类 1.吸附色谱（Adsorption Chromatography） 2.分配色谱（Partition Chromatography） 3.离子色谱（Ion Chromatography） 4.体积排阻色谱（Size Exclusion Chromatography
高效液相色谱方法及应用
色谱分析法是分析化学中获得广泛应用的一个重要分支，是一个具有强大生命力的分离分析技术。
高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。
高效液相色谱仪简介
1.贮液瓶 2.高压输液泵 3.进样器 4.色谱柱 5.检测器 6.记录装置
贮液罐(流动相)
一、流动相脱气（1）吹氦脱气法（2）加热回流法（3）抽真空脱气法（4）超声波脱气法（5）在线真空脱气法
高压输液泵及梯度洗脱装置
一、高压输液泵高压输液泵可以分为以下两类： 1．恒流泵：可输出恒定体积流量的流
(2)示差折光检测器。
示差折光检测器是根据流动相中出现组分时，流动相折射率发生变化而设计的。
溶液的折射率等于流动相折射率与其浓度的乘积，加上组分折射率与其浓度的乘积。
示差折光检测器为通用型检测器，凡具有与流动相折射率不同的组分，均可检测且操作简便，但这种检测器灵敏度不高，对温度十分敏感，不能做梯度淋洗。
建立高效液相色谱分析方法的
一般步骤
通常在确定被分析的样品以后，要建立一种高效液相色谱分析方法必须解决以下问题：
①根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种高效液相色谱分析方法。
②选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）。
③选择适当的或优化的分离操作条件，确定流动相的组成、流速及洗脱方式。
④由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。
下列优良常规操作能够最大限度降低维修费用：
使用HPLC级试剂和流动相
清洁的仪器、流动相和样品，如果必要，进行过滤
保证溶剂的相溶性
如果必要，冲洗整个系统，去掉盐，防止污染
对仪器的使用、维护和保养进行记录
高效液相色谱的应用
剂孔性凝胶
多种不同性能的配位体键联在固相基体上
流动相
不同极性有机溶剂
不同极性有机溶剂和水
不同pH值有机溶剂
的缓冲溶或一定pH
液
值的缓冲
溶液
不同pH值的缓冲溶液，可加入改性剂
分离原理
吸附与解吸பைடு நூலகம்
溶解与挥发
可逆性的离子交换
多孔凝胶的渗透或过滤
具有锁匙结构络合物的可逆性离解
动相。（1）注射式泵（又称注射式螺杆泵）（2）往复型泵 2．恒压泵：恒压泵又称气动放大泵，
是输出恒定压力的泵。
二、梯度洗脱装置
1．梯度洗脱（gradient elution）又称为梯度淋洗或程序洗脱。在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比，称为梯度洗脱。
2．梯度洗脱特点：提高柱效以及改善检测器的灵敏度。
进样装置
液相色谱常用的进样方式有三种：直接注射进样、停流进样和高压六通阀进样。直接注射进样的优点是操作简便，并可获得较高的柱效，但这种方法不能承受高压。停流进样是在高压泵停止供液、体系压力下降的情况下，将样品直接加到柱头。这种进样方式操作不方便，重现性差，仅在不得已时才使用。高压六通阀进样的优点是进样量的可变范围大、耐高压、易于自动化，但容易造成谱峰柱前扩宽。
） 5.键合相色谱法（bonded-phase chromatography） 6.亲和色谱（Affinity Chromatography）
按分离过程物理化学原理分类的各种液相色谱法的比较
吸附色谱分配色谱离子色谱体积排阻亲和色谱色谱
固定相
全多孔固固定液载体吸附剂带在固相
基体上
高效微粒具有不同离子交换孔径的多
二、与气相色谱法比较气相色谱仅能测量在操作温度下可气化且不分
解的物质，而对高沸点化合物、非挥发性物质、
热不稳定物、离子型化合物及高聚物的分离及测量有困难，致使其应用受到了很大的限制。
高效液相色谱法不受样品挥发度和热稳定性的限制，适合分离生物大分子、离子型化合物、不稳定的天然产物以及其他各种高分子化合物等。
色谱柱
多用内壁抛光的不锈钢制成，内径2～ 6mm，直形柱柱长l0～l00cm。在需要增加柱长时，可使用死体积小的连接管，把几根直形柱串接起来。
检测器
用于液相色谱中的检测器，应具有灵敏度高、噪声低、线性范围宽、响应快、死体积小等特点，还应该对温度和流速的变化不敏感。
液相色谱法中有两种基本类型的检测器：
高效液相色谱法的特点
一、与经典液相色谱法比较经典液相（柱）色谱法使用粗粒多孔固定相，装
填在大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱入口压力低，仅有低柱效，分析时间冗长。
高效液相色谱法使用了全多孔微粒固定相，装填在小口径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高柱压的色谱柱，溶质在固定相的传质，扩散速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效和高分离能力。
一类是选择性检测器，如紫外一可见分光光度检测器；
另一类是通用型检测器，如示差折光检测器。
(1)紫外一可见分光光度检测器。
是一种应用广泛，灵敏度和测量精度都比较高约选择性检测器。
它的检测原理基于被测组分对特定波长的紫外一可见光的选择性吸收，被测组分浓度与吸光度的关系服从朗伯一比尔定律。
它适用于在紫外和可见区有吸收的样品。