实验一35二硝基水杨酸比色法还原糖和总糖的测定

3,5-二硝基水杨酸比色法-还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法是一种常用的测定还原糖和总糖含量的方法。

本文将介绍该方法的操作步骤、原理及注意事项。

一、操作步骤1. 样品制备：精确称取适量糖样品，加入足量去离子水稀释至1 mL，摇匀。

2. 试剂制备：(1) Na2CO3试液：称取0.5 g Na2CO3加入50 mL去离子水中，溶解并稀释至1 L。

(2) 3,5-二硝基水杨酸(DNS)重量浓度为1 g/L的甲醛溶液：按比例称取适量DNS和甲醛，在去离子水中稀释制成重量浓度为1 g/L的甲醛溶液。

3. 测定步骤：(1) 取3个试管，编号为A、B、C，并进行空白对照。

将A、B、C试管分别加入0.1 mL 样品，每个试管中加入相同量的0.9 mL去离子水。

在空白试管中加入相同量的去离子水代替样品。

(2) 在A试管中加入0.5 mL Na2CO3试液，摇匀。

(3) 将B试管浸于沸水中加热3-5分钟，使其中的还原糖完全还原。

(4) 在A、B两样品试管中加入0.5 mL甲醛溶液，摇匀并置于60℃水浴上加热10分钟。

(6) 加入1.5 mL水后，在空白对照试管和样品试管中均加入0.5 mL DNS溶液，摇匀。

(7) 在95℃水浴加热10分钟，并立即冷却至室温。

(8) 测量吸光度值，通过标准曲线计算样品中还原糖或总糖含量。

二、原理还原糖或总糖与Na2CO3在典型的碱性条件下发生醛基反应，把碳水化合物中的亲电基转化为醛基，再将其还原为对应的醇，生成糖醇和尿素等。

然后，在碱性条件下，醛基与3,5-二硝基水杨酸(DNS)反应，发生环化，生成糖醛酸化合物，这些化合物在pH9.0以下表现为桥形分子，具有紫色的吸收峰。

在高温条件下，DNS与糖醛酸化合物相结合，形成柿子色化合物，进一步增加吸收光的强度。

还原糖或总糖的含量可以通过比较样品的吸光度值和标准曲线来测定。

三、注意事项1. 避免试管附着并确保试管内部表面干净。

实验一3．5一二硝基水杨酸比色定糖法【目的和要求】1．掌握3，5一二硝基水杨酸比色法定糖的原理及方法。

2．用3，5一二硝基水杨酸定糖法测定山芋粉中的总糖及还原糖。

【原理】3，5一二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色强度呈现比例关系，利用比色法可测知样品的含糖量。

该方法是半微量测糖法，操作简便，快速，杂质干扰较小。

【操作方法】一、葡萄糖标准曲线的绘制将上述各管溶液混匀后，用72型分光光度计（520nm）进行比色测定，用空白管溶液调零点，记录光密度值。

以葡萄糖浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制出标准曲线。

二、山芋粉中总糖和还原糖含量的测定1．样品中还原糖的提取：准确称取2g山芋粉，放入100ml烧杯内，加入85％乙醇50ml，混匀，在50℃恒温水浴中保温30min，过滤，滤渣再用85％乙醇提取二次。

将滤液合并，蒸去乙醇，加少量水，移入100ml容量瓶中，用水定容，备用。

2．样品中总糖的水解及提取：准确称取出芋1g，放入大试管中，加入1ml 6mol盐酸和15ml蒸馏水。

混匀，在沸水浴中加热半小时后，用碘化钾－碘溶液检查水解程度，若已水解完全，则不呈现蓝色。

冷却后加入酚酞指示剂1滴。

以10％氢氧化钠中和至溶液呈微红色。

过滤并定容至100ml 。

再精确吸取上述溶液10ml ，放入100ml 容量瓶中，定容，备用。

将各管混匀后，按制作标准曲线时同样的操作测定各管的光密度，在标准曲线上查出相应的还原糖含量，按下述公式推算出山芋粉内还原糖与总糖的百分含量。

还原糖％＝还原糖毫克数×样品稀释倍数 ×100样品重量【试剂和器材】一、试剂（1）3´，5´一二硝基水杨酸试剂（又称DNS 试剂）：甲液——溶解6.9g 结晶酚于15.2ml 10％氢氧化钠中，并稀释至69 ml ，在此溶液中加入6.9g 亚硫酸氢钠。

乙液——称取255g 酒石酸钾钠，加到300 ml 10％氢氧化钠中，再加入880 ml 1％ 3，5一二硝基水杨酸溶液。

实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法一、实验目的掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。

二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。

还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。

利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。

还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。

由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料小麦面粉；广范pH试纸。

2．主要仪器（1）大试管：2×20cm×14（2）烧杯：100mL×3（3）三角瓶：100mL×1（4）容量瓶：100mL×3（5）移液管：1mL×3；2mL×2；10mL×4（6）吸耳球、玻璃棒（7）恒温水浴锅（8）漏斗、滤纸（9）白瓷缸、电炉（10）精度天平（11）分光光度计3．试剂（已制备）（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取90℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。

（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂将6.3g 3,5-二硝基水杨酸（DNS）和2mol\L NaOH溶液262mL，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中，7-10天后才能使用。

生物化学综合实验报告题目：3，5—二硝基水杨酸比色法测定还原糖和总糖姓名：学号：同组成员：分院(系）：专业班级：指导教师:完成日期：年月日1。

实验目的用比色法测定山芋中还原糖和总糖含量2。

实验原理先用已知浓度的葡萄糖标准溶液与DNS反应测其分光度，制得标准曲线，在测山芋中糖与DNS反应后的分光度A从而得其总糖和还原糖含量。

3。

实验仪器和试剂试剂：1g/L葡萄糖标准液、3,5-二硝基水杨酸、6mol/L HCl，6mol/L NaOH仪器:25，100ml容量瓶、1，5ml吸量管、50ml移液管、100ml 量筒、试管、滴管、离心管、玻璃棒、洗耳球、100ml容量瓶、比色皿离心机、分光光度计、恒温水箱4。

实验步骤一、取六只比色管向其中加入葡萄糖标液0、0。

2、0。

4、0.6、0。

8、1.0毫升在加入蒸馏水2。

0、1.8、1。

6、1。

4、1.2、1.0毫升，最后向其中各加入DNS试剂1。

5毫升混合均匀后100摄恒温水浴5min，冷却后加入蒸馏水至25ml刻度线，用1号样调零，测其分光度，制得标准曲线。

二、还原糖提取：取3g山芋粉，加入30ml水，搅匀后在50摄水中保温20min，离心，取滤液,用100ml容量瓶定容得还原糖待测液.总糖提取：取0.2克山芋粉，加入试管中吸取5ml HCL溶液，8ml蒸馏水搅匀,100摄下恒温水浴30min，冷却,NaOH调节PH至中性,离心,滤液用100ml容量瓶定容，得总糖待测液.测定时取5支比色管分别加入还原糖0、1。

0、1。

0、0、0毫升，总糖0、0、0、0.5、0。

5毫升,蒸馏水2。

0、1。

0、1。

0、1。

5、1。

5毫升,DNS试剂1.5毫升100摄恒温水浴5min后冷却，稀释至25毫升用一号管调节分光度为0，测总糖和还原糖的分光度.5数据处理葡萄糖标准曲线表管号0 1 2 3 4 5 含糖总量（mg）0 0.2 0。

4 0。

6 0。

8 1 葡萄糖标液(ml）0 0.2 0.4 0。

还原糖和总糖含量的测定（3，5 一二硝基水杨酸比色法）还原糖和总糖含量的测定（3，5一二硝基水杨酸比色法）还原糖和总糖含量的测定（3，5一二硝基水杨酸比色法）作者：佚名文章来源：生物化学实验技术点击数：2132更新时间：2021-5-1311:29:24一、目的植物体内的还原成糖，主要就是葡萄糖、果糖和麦芽糖。

它们在植物体内的原产，不仅充分反映植物体内碳水化合物的运转情况，而且也就是呼吸作用的基质。

还原成糖还能够构成其他物质例如有机酸等。

此外，水果蔬菜中糖量的多少，也就是始终如一其品质的关键指标。

还原成糖在有机体的新陈代谢中起至着关键的促进作用，其他碳水化合物，例如淀粉蔗糖等，经水解也分解成还原成糖。

通过本实验，掌控还原成糖定量测定的基本原理，练比色定糖法的基本操作，热悉分光光度计的采用方法。

二、原理各种单糖和麦芽糖就是还原成糖，蔗糖和淀粉不为还原成糖。

利用溶解度相同，可以植物样品中的单糖、双糖和多糖分别抽取出，再用酸水解法并使没还原性的双糖和多糖全盘水解班莱班县还原性的单糖。

在碱性条件下，还原糖与3，5一二硝基水杨酸共热，3，5一二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原成糖则被水解成糖酸及其他产物。

一定范围内，还原成糖的量与棕红色物质颜色厚薄的程度成一定的比例关系，540nm波长下测量棕红色物质的消光值，收信标准曲线并排序，便可以分别谋出来样品中还原成糖和总糖的含量。

三、仪器、试剂和材料1.仪器（1）刻度试管：25mlx11（2）离心管或玻璃圆柱形x2（3）烧杯：1oomlx1（4）三角瓶：100m1x1（5）容量瓶：100mlx3（6）刻度液体：1mlx1，2m1x4,10mlx1（7）恒温水浴（8）沸水浴（9）离心机（过滤法不用此设备）（10）电子顶载天平（11）分光光度计2.试剂（1）1mg/ml葡萄糖标准液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在80℃烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100ml的容量瓶中，以馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。

《生物化学》实验指导书适用专业：生物科学、食品科学、生物工程、农学、园艺、环境科学孝感学院生命科学与技术学院生物化学实验细则为了保证生物化学实验的顺利进行，培养同学们掌握良好、规范的生物化学基本实验技能，特制定以下实验细则，请同学们严格遵守。

1. 实验前应提前预习实验指导书并复习相关知识。

2. 严格按照生物化学实验分组，分批进入实验室，不得迟到。

非本实验组的同学不准进入实验室。

3. 进入实验室必须穿实验服。

各位同学进入各自实验小组实验台后，保持安静，不得大声喧哗和嬉戏，不得无故离开本实验台随便走动。

绝对禁止用实验仪器或药物嬉耍。

4. 实验中应保持实验台的整洁，废液倒入废液桶中，用过的滤纸放入垃圾桶中，禁止直接倒入水槽中或随地乱丢。

5. 实验中要注意节约药品与试剂，爱护仪器，使用前应了解使用方法，使用时要严格遵守操作规程，不得擅自移动实验仪器。

否则，因非实验性损坏，由损坏者赔还。

6. 使用水、火、电时，要做到人在使用，人走关水、断电、熄火。

7. 做完实验要清洗仪器、器皿，并放回原位，擦净桌面。

8. 实验后，要及时完成实验报告。

目录实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１实验二油脂酸价的测定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．５实验三蛋白质的提取及浓度测定¬(紫外吸收法)．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．７实验四淀粉酶活力的测定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．９实验五酶的激活和抑制作用．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１３实验六氨基酸的分离鉴定――纸层析法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１４实验七基因组DNA的快速提取---碘化钾法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１６实验八琼脂糖凝胶电泳技术――DNA样品检测．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．１８实验一还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比色法一、目的与要求掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。

总糖和还原糖的测定（3,5—二硝基水杨酸法）实验报告前言糖在我们日常生活中随处可见，我们吃的米饭、水果、零食中或多或少都含有一些糖类。

同时，糖也是我们维持机体运动所必不可少的物质，没有了它，就没有了能量的来源。

我们这次便走进实验室探索糖类的奥秘。

本次实验我们将用3,5—二硝基水杨酸法测定总糖和还原糖中的含糖量。

本次实验中，我们除了要掌握还原糖和总糖的测定基本原理还要学习比色法测定还原糖的操作方法以及分光度法测定的原理和方法。

首先，让我们一起来了解一下它们的测定方法吧。

还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。

还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。

利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。

还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。

由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

一、实验目的1、掌握还原糖和总糖的测定的基本原理2、学习比色法测定还原糖的操作方法3、学习分光光度法测定的原理和方法二、实验原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。

还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。

利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。

还原糖和总糖的测定3,5-二硝基水杨酸比色法一、目的掌握还原糖和总糖测定的基本原理，学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。

二、原理还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。

还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。

利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。

还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。

由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

三、实验材料、主要仪器和试剂1. 实验材料小麦面粉；精密pH 试纸。

2. 主要仪器（1）具塞玻璃刻度试管：20mL×11（2）大离心管：50mL×2（3）烧杯：100mL×1（4）三角瓶：100mL×1（5）容量瓶：100mL×3（6）刻度吸管：1mL×1；2mL×2；10mL×1（7）恒温水浴锅（8）沸水浴（9）离心机（10）扭力天平（11）分光光度计3. 试剂（1）1mg/mL 葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。

（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂将6.3gDNS 和262mL 2M NaOH 溶液，加到500mL含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。

实验一3, 5 -二硝基水杨酸法测定总糖和还原糖1、实验目的：掌握还原糖和总糖测定的基本原理掌握比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用。

2、实验原理：在NaOH和丙三醇存在下，3,5-二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。

在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

3、实验步骤：（一）葡萄糖标准曲线制作1. 取6个试管，按下表加入1.0mg/ml葡萄糖标准液和蒸馏水2. 向各试管中分别加入DNS试剂1 ml，充分混合，放入沸水浴中加热煮沸2 min 进行显色，取出试管放入盛有冷水的烧杯中迅速冷却。

3.向各管中分别加入8 ml蒸馏水，充分混合。

4.以空白管（0号管）做对照，于540nm 波长下调0，然后测定各管的OD 值。

5.以光吸收值作为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线。

如果该直线不通过零点，必须重做。

（二）还原糖的制备1. 称取2g玉米粉，把它放入一个100ml的三角瓶中，然后加入20~30ml蒸馏水，搅拌均匀。

2. 把三角瓶放于一个50℃水浴中保温30 min，不时搅拌。

3. 拿出三角瓶，将三角瓶内含物转入50ml的容量瓶中：过滤，定溶，充分混合，滤出液即为还原糖提取液。

(三) 样品总糖的水解和提取1. 取1g玉米粉，放在100ml三角瓶中，加15ml水溶解，再加10ml 6mol/L 盐酸，混匀。

2. 将三角瓶置于沸水浴中加热煮沸30 min。

3.取出1~2滴置于白瓷板上，加1滴I-KI溶液检查水解是否完全。

如已水解完全，则不呈现蓝色。

4.拿出三角瓶，冷却，过滤，滤出液即为总糖提取液。

5.加入3-5滴酚酞指示剂，混匀，用6mol/L的NaOH中和至溶液呈微红色。

将中和后的溶液转入100 ml的容量瓶中定容。

（四）样品中含糖量的测定1. 取5支试管，编号，按下表向每支试管中加入试剂。