基因克隆讲义与表达

起始密码子及其5端若干密码子的影响：
90%以AUG为起始密码子，少数UUG、GUG。
AUG右侧的几个密码碱基组成也有影响，不能与 mRNA的5’端非编码区形成茎环结构。
4. 生物体对密码子的偏爱性：
简并密码子使用频率在不同 不
同蛋白质翻译时不同，具有偏
➢外源基因密码子在大肠杆菌细胞中获得
最佳表达：
简单，便于基因操作和分析。
（2）多数细胞内有质粒或噬菌体，便于构建相应
表达载体， 目标基因表达水平高。
（3）代谢途径和基因表达调控机制比较清楚 （4）繁殖迅速、培养简单、操作方便 （5）被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
（三）外源基因在大肠杆菌中表达的原理 启动子 终止子 核糖体结合位点 表达载体的必要元件 密码子 质粒拷贝数
3、控制目的基因的过量表达 使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程
度 使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的
拷贝数 4、优化基因工程菌的培养工艺 培养基组成:限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 培养温度：较低的效表达外源基因？ 大肠杆菌作为基因工程受体菌的优缺点是什么？ 什么是RBS位点，如何影响基因表达？ 什么是包涵体？其形成机理是什么？ 融合蛋白、寡聚型异源蛋白 基因工程菌的遗传不稳定性的主要机制是什么？
➢ DNA体内重组的基本原理：同源序列依赖型
染色体DNA的两个同源区之间可发生同源重组， 其频率与细菌种类、同源程度、两个同源区之间 距离有关。
➢同源重组有整合和交换两种形式，前者只
需要一个断裂位点，后者有两个断裂位点。
标记基因
目的基因
同源交换
标记基因
目的基因
三、基因工程菌的遗传不稳定性及其对策

5’3’-
5’3’-
GAATTC CTTAAG
G AATTC CTTAA G
-3’ -5’
-3’ -5’
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（4）粘性末端的意义 ①连接便利
i）不同的DNA双链： 只要粘性末端碱基互补就可以连接。 这比连接两个平齐末端容易的多。
ii）同一个DNA分子内连接： 通过两个相同的粘性末端可以连接成环 形分子。
pBR322质粒
pBR322质粒是由三个不同来源的部分组成的：第 一部分来源于pSF2124质粒的氨苄青霉素抗性基 因（ampr）；
第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基因 （tetr）；
第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的DNA
复制起点（ori）。
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PstI
ScaI
Ampr
HindIII BamHI
④ lacZ的a肽互补 1）a-肽（ lacZ’ ）：
b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断 （11-41氨基酸），该段基因序列连接到 pUC载体上。
受体菌基因组的b-半乳糖苷酶基因的 缺失a肽（氨基端有缺失），不能形成 活性酶，不能分解Xgal
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⑤ 载体lacZ’与a互补
pUC质粒载体上的lacZ’ 编码a肽与这个 缺失突变的b-半乳糖苷酶“互补”，又 能分解Xgal。产生蓝色物质。
15
16
2. DNA 连接酶 3.1 DNA连接酶（ligase)的发现
从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能 把两条DNA双链连接到一起的酶。
DNA复制一定有断口。 17
3.2 DNA ligase的特点
1. 两种DNA连接酶
（1）大肠杆菌连接酶 只能连接粘性末端。
（2）T4噬菌体的连接酶 不但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。

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结果分析
蛋 白 样 品 距 加 样 端 迁 移 距 离 （ c m ） 相 对 迁 移 率 =
溴 酚 蓝 区 带 中 心 距 加 样 端 距 离 （ c m ）
以每个蛋白标准的分子量对数对 它的相对迁移率作图得标准曲线， 量出未知蛋白的迁移率即可测出其 分于量。
标难曲线只对同 一块凝胶上的样品 的分子量测定才具 有可靠性。
基本原理
SDS-PAGE技术是根据SDS能使蛋白质变性解聚 成肽链并与肽链侧链以一定比例结合成SDS—肽链复 合体，从而掩盖了肽链本身所带电荷（SDS带负电） ，并消除了蛋白质分子间的形状差异，再结合 PAGE技术（根据分子的形状、电荷、分子量综合差 异来分离不同分子的技术）来分离不同分子量蛋白 质或测定定蛋白质分子量的实验技术。
• T7RNA聚合酶基因插入由大肠杆菌lacUV5启动子控制、λDE3溶原
状态下的大肠杆菌染色体上。
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T7 表达系统
转录调控的机理 化学诱导型
噬菌体 DE3 是 l 噬菌体的衍生
株，一段含有 lacI、lacUV5 启
动子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其 int 基因中
质粒具有自主复制和 转录能力，能在子代细 胞中保持恒定的拷贝数 ，并表达所携带的遗传 信息。
基因组DNA
质粒DNA
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ⅰ质粒DNA提取方法： 碱裂解法、煮沸法、 SDS法等
ⅱ 碱裂解法原理：
在碱性条件下，双连DNA氢键断裂，结构
破坏变性，环状超螺旋质粒不充分变性。在中 性条件下变性质粒恢复原来构型，而线性大 分子细菌DNA不能复性呈不溶物而经离心除 去。

强启动子是能维持高频率转录的启动子， 通常控制那些细胞需要其大量转译产物的基因 转录；而弱启动子具有相对较低的转录效率， 指导那些仅需要其少量转译产物的基因转录。
利用基因工程技术，可将由弱启动子所控 制的基因放在强启动子的下游，从而获得高效 表达。
两个保守区之间的DNA对启动子的功能也 有影响，各启动子都需要一些最适的间隙，通 常认为间隙为17 bp的启动子功能较强。
2. 真核细胞启动子中可以找到三个保守区：
(1) 位于12至32 bp之间的TATA框，序列为 TATAATATA，其功能可能为DNA双链开始解 开并决定转录的起点位置。
(2) 位于70至80 bp区域的CAAT框，序列为 GGTCAATCT，其主要作用可能与RNA聚合酶 的结合有关。
(3) 位于更上游约70至100 bp处的GC框，序列 为GGGCGG，也称为增强子（enhancer），其 作用为促进基因的转录，对基因的表达可产生 显著的增强作用。增强子有时位于基因3’端下 游区或在内含子中。
由RNA聚合酶催化的转录过程可分为起始、 延长和终止三个步骤。
7.3.1.1 启动子 标志基因转录起始的位点称启动子。在大
肠杆菌中，启动子被RNA聚合酶的因子所识 别。启动子是一段DNA序列，常位于基因或 操纵子编码顺序的上游，RNA聚合酶结合在上 面。
1. 原核细胞的启动子 原核细胞的启动子在转录起始点的上游有
(2’ω)组成，分子量约46万。完整的RNA聚 合酶，即2’ ω ，称为全酶(holoenzyme)； 没 有 亚 基 的 RNA 聚 合 酶 称 为 核 心 酶
(coreenzyme)。亚基(因子)容易同核心酶解离，
其功能是使核心酶能稳定地结合到DNA的启动
子上，故又称为起始因子。

CTG GAC 连接酶 CTGATT GACTAA
ATT TAA
GAATTC CTTGGA
内切酶和连接酶是基因克隆实验中两种 重要的工具酶，它们如同分子生物学家剪刀
和针线，可以任意地将感兴趣的基因片段进
行切割和连接，实现DNA序列的重组。
质粒(plasmid)和载体(vector)有什么区别？
质粒是指细菌细胞质中的小型环状DNA分子，是
2686 bp
P(LAC) O RI
A pa LI (1121)
A pa LI (178)
P(BLA)
A pa LI (2367)
ALPHA
E co RI (397) A va I (413) X m aI (413) Sm a I (415)
EcoR I
Hind III
PCR扩增
AP r
pU C 19
co coli
DNA连接酶
DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的，最初是在大
肠杆菌细胞中发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助
ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5’-PO4与另一DNA 链的3’-OH生成磷酸二酯键将两条紧邻DNA链连接起来。
G CTTGG 连接酶
AATTC A
质粒的重要特征
（1） 是染色质外的环形双链DNA分子； （2）能自主复制，是能独立复制的复制子；
（3）质粒对宿主生存并不是必需的；
（4）质粒上常带有耐抗生素基因； （5）质粒DNA上有多个酶切位点。
限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）:是从细菌中分离 出来的一种识别并切割特异的双链DNA序列的内切核酸酶。 目前已从多种细菌中分离出超过400种，识别各自不同的核苷 酸顺序。

Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
互连后？
GCCTAG+
GATCC G
ATCTAG+GATCTA
Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
5. 不同的酶可以识别同一个序列 同工异源酶（isoschizomer）或同裂酶 能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同的两种酶。
6. 水浴槽
8. 电泳系统
分子克隆常用的有毒试剂
1. 溴化乙锭: （Ethidium bromide，EB）用来染DNA和RNA的染料, 是一种致癌物 质；它是DNA突变的诱变剂，可以嵌入DNA，使DNA发生突变，致癌。 有累积 效应，不要直接接触，但是要注意通过呼吸摄入，故此环境要通风。EB可以被 皮肤吸收。做实验的时候一定要带手套。但是，只要按照标准的操作使不会有问 题的。严禁随便丢弃。因为EB是强致癌性，而且易挥发，挥发至空气中，危害 很大。
2. DEPC：DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质， 是RNA酶的强抑制剂；DEPC是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的 条件下进行，并避免接触皮肤。DEPC毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的， 使用时戴口罩。不小心占到手上注意立即冲洗。
3.苯酚：苯酚又名酚或石碳酸,为高毒类原浆毒物,对人体危害严重。它的浓溶液 对皮肤有强烈的腐蚀性,苯酚所致的急性中毒常常造成死亡。 4. 氯仿：三氯甲烷，侵入途径：吸入、食入、经皮吸收。健康危害：主要作用 于中枢神经系统，具有麻醉作用，对心、肝、肾有损害。吸入或经皮肤吸收引起 急性中毒，初期有头痛、头晕、恶心、呕吐、兴奋、皮肤粘膜有刺激症状，以后 呈现精神紊乱、呼吸表浅、反向消失、昏迷等，重者发生呼吸麻痹、心室纤维性 颤动、并可有肝、肾损害。误服中毒时，胃有烧灼感、伴恶心、呕吐、腹痛、腹 泻以后出现麻醉症状。慢性中毒：主要引起肝脏损害，此外还有消化不良、乏力、 头痛、失眠等症状，少数有肾损害。 5. 十二烷基硫酸钠（SDS）：提取质粒使用的溶液II中含有SDS，对粘膜和上呼 吸道有刺激作用，对眼和皮肤有刺激作用。可引起呼吸系统过敏性反应。。 6. 其它常用的试剂如强酸强碱都有很强的腐蚀性。

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③ 由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的， 也是连续进行的。
原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，转 录成mRNA后，可直接在胞浆中与核糖体结合翻 译形成蛋白质。在翻译过程中，mRNA可与一定 数目的核糖体结合形成多核糖体。两个核糖体之 间有一定长度的间隔，为裸露的mRNA。每个核 糖体可独立完成一条肽链的合成，即这种多核糖 体可以同时在一条mRNA链上合成多条肽链，大 大提高了翻译效率。
在原核生物表达系统中，通常使用的可调控的 强启动子有lac (乳糖启动子)、trp (色氨酸启动子)、 PL和PR(λ噬菌体的左向和右向启动子)以及tac（乳糖和
色氨酸的杂合启动子)等。
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2．S-D序列
mRNA在细菌中的转译效率依赖于是否有核糖 体结合位点的存在，即S-D序列以及S-D序列与起 始密码子AUG之间的距离。在原核细胞中，当 mRNA结合到核糖体上后，翻译或多或少会自动 发生。细菌在翻译水平上的调控是不严格的，只 有RNA和核糖体的结合才是蛋白质合成的关键。
pGEX系统由Pharmacia公司构建，载体的组 成成分基本上与其他表达载体相似，含有启动子 tac及lac操纵基因、S-D序列、lacI阻遏蛋白基因 等。
这类载体与其他表达载体不同之处在于S-D 序列下游是谷胱甘肽巯基转移酶基因，而克隆的 外源基因则与谷胱甘肽巯基转移酶基因相连。当 进行基因表达时，表达产物为谷胱甘肽巯基转移 酶和目的基因产物的融合体。
含原核细胞多肽的融合蛋白是避免细菌 蛋白酶破坏的最好措施。另外为表达产物的 分离纯化等提供了极大的方便。
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基因工程的载体有克隆载体和表达载体 之分。
克隆载体中都有一个松弛型复制子， 能带动外源基因在受体细胞中复制扩增， 这类载体已经作过介绍。

载体的种类
质粒
1.大肠杆菌质粒 2.革兰氏阳性菌的质粒
噬菌体 真核细胞为宿主的克隆载体
1.酵母为宿主的载体 2.植物细胞为宿主的载体 3.DNA病毒载体
反转录病毒载体
大肠杆菌的质粒
pBR322质粒：它是由4361个核苷酸组成，属于松弛型质粒， 可以用抗氨苄西林和抗四环素基因作为标记，具有多种常用 内切酶的切点。
基因表达产物的鉴定
基因表达：指某基因在细胞中转录为mRNA继而翻译 成蛋白质的过程。
DNA
RNA
Protein
转录
翻译
研究基因表达的手段
1、RT-PCR (RNA) 2、Northern blot (RNA) 3、Western blot (蛋白质） 4、免疫组化 （蛋白质）
1、RT-PCR
基因的克隆 -----ＤＮＡ重组技术。
克隆：是用无性繁殖的方法产生一组遗传上相同的细 胞或生物群体的过程，而这些细胞或个体均来自无性 繁殖的单一原型细胞。
基因的克隆:用ＤＮＡ重组技术使一个基因或ＤＮＡ片 段产生出很多相同拷贝的过程。
基因克隆的技术路线的大体步骤
得出结论
步骤三： 步骤二： 步骤一：
多 克 隆 位 点
X-gal ：5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷
表示 外源 基因 插入 编码 半乳 糖苷 酶的 基因 区段
带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落
不对 能照 是目 培的 养基 基因 变本 色身
使用含Amp+X-Gal的琼脂糖平板筛选克隆，可能出现三种情况。 1 . 载体自身环化，产生蓝色菌落； 2 带有正确插入目的基因序列的菌落，白色菌落。 3 未转化的细胞，不能生长。
目的基因插入 到抗四环素基 因的位置，则 导入菌体后的 菌株则不能在 有四环素的培 养基上生长

Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
互连后？
GCCTAG+
GATCC G
A
+GATCT
TCTAG
ALOGO
Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
5. 不同的酶可以识别同一个序列 同工异源酶（isoschizomer）或同裂酶 能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同的两种酶。
LOGO
聚合酶链式反应
Polymerase Chain Reaction, PCR
体外高效特异性的扩增目的DNA片段
LOGO
LOGO
LOGO
LOGO
LOGO
PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
3’
3’
5’
上游引物、5’ 引物、Sense primer
PCR反应扩增的就是一对引物之间的DNA片段，PCR反应 成功扩增的关键在于引物的正确设计。
引物设计的总原则——提高引物与模板结合的特异性。
LOGO
PCR引物设计的基本原则： 1.引物与模板的序列要紧密互补。 2.引物自身、引物之间不应存在互补序列。 3.引物不能在模板的非目的位点引发PCR。
LOGO
分子生物学关键的技术突破： DNA重组技术
1972年， 世界上第一个重组DNA分子诞生
1980年， 获诺贝尔化学奖
猿猴病毒DNA
噬菌体DNA
限制性内切酶
限制性内切酶
DNA连接酶 重组DNA分子

码的片段各自均无酶活性，但它们可以互补
形成具有酶学活性的蛋白质。这种现象称为α
互补。
基因克隆与基因体外表达
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基因克隆与基因体外表达
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（二） 免疫学方法 如果克隆基因的产物是已知的，并且
在菌落或噬菌斑中表达，因而可用相应的 抗血清或单克隆抗体，通过放射免疫、化 学发光或显色反应进行筛选。
基因克隆与基因体外表达
基因克隆与基因体外表达
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3. 逆转录酶（reverse transcriptase）
是一种RNA依赖的DNA聚合酶，即以 RNA为模板合成DNA， 合成方向为5ˊ→3ˊ 延伸，无3ˊ→5ˊ外切酶活性。
用于以m14
基因克隆与基因体外表达
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4. T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase）
T4 DNA连接酶催化双链DNA一端3ˊOH 与 另 一 双 链 DNA 的 5 ˊ 端 磷 酸 根 形 成 3ˊ→5ˊ磷酸二酯键，使具有相同黏性末端 或平端的DNA两端连接起来。
基因克隆与基因体外表达
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基因克隆与基因体外表达
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5. 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase） 能去除DNA或RNA 5ˊ端的磷酸根。制
基因克隆与基因体外表达
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二、其他常用的工具酶
1. DNA聚合酶Ⅰ (DNA polymerase I)
有聚合酶活性 有3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性 有5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性
基因克隆与基因体外表达
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基因克隆与基因体外表达
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基因克隆与基因体外表达
酶Ⅰ大片段
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定基因向克克隆与隆基因体外表达

25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
பைடு நூலகம்
基因克隆与克隆基因的表达
16、人民应该为法律而战斗，就像为 了城墙 而战斗 一样。 ——赫 拉克利 特 17、人类对于不公正的行为加以指责 ，并非 因为他 们愿意 做出这 种行为 ，而是 惟恐自 己会成 为这种 行为的 牺牲者 。—— 柏拉图 18、制定法律法令，就是为了不让强 者做什 么事都 横行霸 道。— —奥维 德 19、法律是社会的习惯和思想的结晶 。—— 托·伍·威尔逊 20、人们嘴上挂着的法律，其真实含 义是财 富。— —爱献 生
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚