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第八章 克隆基因的表达系统 2014

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克隆基因的表达和常见系统的类型

克隆基因的表达和常见系统的类型
克隆基因的表达和常见系 统的类型
克隆基因的表达： 指的是外源基因在宿主细胞中表达。
外源基因 表达载体
重组载体
导入宿主细胞
提取蛋白
在宿主细胞中 表达出蛋白质
宿主细胞：
原核细胞或真核细胞。
一
、 原核生物 大肠杆菌表达系统
常 见
基因表达 系统
芽孢杆菌表达系统 链霉菌表达系统
表
达
系
酵母表达系统
统
真核生物 丝状真菌表达系统
（2）SD序列与起始密码子之间的距离的影响：
SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA 在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处 于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的 前提条件。
在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约7个碱基 处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会 导致翻译起始效率不同程度的降低。
避免前期表达目的产物对菌株生长的影响； 减少细菌蛋白酶对目标基因产物的降解。
诱导型工作的典型例子： 乳糖操纵子模式
乳糖操纵子：乳糖启动子lac，来自大肠杆菌
用乳糖或其类似物IPTG充当诱导物，与阻遏蛋白 结合，解除抑制。
乳糖启动子Plac的可控性：
加入乳糖类似物： 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 （IPTG）诱导作用
的 类 型
基因表达 昆虫表达系统
系统
哺乳动物细胞表达系统
植物生物反应器
二、表达体系的组成： 表达载体 受体细胞
表达载体的构成
启动子 终止子 核糖体结合位点（SD序
列） 筛选标记 复制子（质粒拷贝数） 多克隆位点
启动子 操纵子 S-D序列 目的基因 终止子
1、启动子
启动子是一段提供RNA聚合酶识别和结合 的DNA序列，位于基因的上游，长度因生物 种类而异，具有如下特征：

简述外源基因原核系统克隆表达的基本流程

简述外源基因原核系统克隆表达的基本流程

简述外源基因原核系统克隆表达的基本流程外源基因在原核系统中的克隆表达是通过一系列步骤来实现的。

以下是基本的流程：1. 选择质粒载体（Plasmid Vector）：-选择一个合适的质粒，通常是圆形DNA 分子，具有自主复制的能力。

质粒通常包含选择标记（例如抗生素抗性基因）和表达调控元件（例如启动子、终止子等）。

2. 准备目标基因：-获取外源基因，这可以是从其他生物中克隆得到的DNA 片段。

这个基因应该编码所需的蛋白质或RNA。

3. 限制性内切酶切割：-使用限制性内切酶切割质粒载体和目标基因。

选择适当的酶，以确保两者切口相互兼容。

4. 连接（Ligation）：-将切割后的质粒和目标基因连接在一起，形成重组质粒。

这一步通常涉及DNA 连接酶。

5. 转化（Transformation）：-将重组质粒导入宿主细菌中。

这可以通过热激冲击、电穿孔或其他方法实现。

质粒包含抗生素抗性基因，使得只有带有重组质粒的细菌能够在含有抗生素的培养基中生长。

6. 筛选（Screening）：-鉴定带有正确重组质粒的细菌。

这可以通过PCR、酶切鉴定等技术来进行。

7. 培养：-将筛选出的正常克隆株培养起来，以增大其数量。

8. 表达：-利用宿主细菌的生物机制，使得外源基因在细菌中表达。

这通常涉及到适当的启动子和终止子，以及其他调控元件。

9. 纯化：-如有必要，对表达的蛋白质进行纯化。

这可以通过各种方法，如层析、电泳等来实现。

整个流程的成功依赖于实验室技术的熟练操作和对基因工程原理的深刻理解。

这些步骤的每一步都需要谨慎操作，以确保最终得到具有期望表达产物的克隆。

基因工程的表达系统

基因工程的表达系统

基因工程的表达系统
基因工程是一门研究在实验室中人为操纵和修改生物体遗传材料的学科，从而达到改变或改造生物性能的目的。

其中，表达系统是基因工程的重要技术之一，也是用来实现基因功能分析和基因转录的重要手段。

表达系统是指将外源基因引入宿主菌株，进而在宿主菌株中实现外源基因表达的技术系统。

表达系统包括各种实验技术，如基因克隆、基因表达定位、基因调控、基因表达调控、基因表达产物分离等技术。

基因克隆是在表达系统中要完成的第一步，即将指定的DNA序列导入宿主菌株，这一步可以使用质粒克隆技术或集成克隆技术来实现，这两种技术都简单、快捷、可靠，因此在基因工程的实验中得到了广泛的应用。

定位和调控是表达系统中的第二步，目的是将克隆好的外源基因放置在宿主菌株中能够正常发育和表达的位置，以便获得正确的表达方式，这一步可以使用启动子技术、启动子组装技术、表达调控因子技术等来实现。

表达系统的最后一步是表达产物的分离，也就是将克隆好的外源基因在宿主菌株中表达出来的产物进行分离，这一步可以使用浓缩、沉淀、超滤、离心分离等方法来实现，以获得更高的产物纯度。

总的来说，基因工程的表达系统是一整套实验技术，既可以用于表达和功能分析基因，也可以用于产生新型药物、新型酶、新型农药、新型食品添加剂等多种产品，是基因工程的重要技术手段。

克隆基因的表达系统2014

克隆基因的表达系统2014

(2) SD序列与起始密码子之间的序列的影响
SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译 效率最高；而CCCC或GGGG的翻译效率则分别 是最高值的50%和25%。紧邻AUG的前三个 碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳 的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、 UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍
-1 +1 +30
TTGACA
- 35元件
15~20bp
TATAAT
- 10元件
6bp
CAT
启动子
启动子
PlL PrecA PtraA Ptrp Plac Ptac
-35 区序列
TTGACA
-10 区序列
GATAC T
T T G A T A
T A G A C A T T G A C A T T T A C A T T G A C A
T A T A A T
T A A T G T T T A A C T T A T A A T T A T A A T
Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac
乳糖启动子lac---来自大肠杆菌的乳糖操纵子 色氨酸启动子trp-来自大肠杆菌的色氨酸操纵子 PL和PR启动子 -l噬菌体中得到的一类启动子 比lac启动子的活性高8-10倍，比trp启动子活性高.

-10 区顺序:GATAAT, -35区顺序:TGACTA

tac启动子 由trp 和 lac启动子人工构建的杂合启动 子
2.Shine-Dalgarno（SD）序列

位于翻译起始密码子（AUG)上游5-13bp处 的由3-9个bp组成的核苷酸序列富含嘌呤 核苷酸， 5’ UAAGGAGG 3’，，它通 过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与 之专一性结合，将mRNA定位于核糖体 上，从而启动翻译；

克隆基因表达--原核表达ppt课件

克隆基因表达--原核表达ppt课件
的表达产量高、表达产物稳定、生物
活性高和表达产物容易分离纯化。这
就要求选择合适的宿主细胞，合适的
表达载体和适当的纯化方案。
4
宿主细胞应满足以下要求：
容易获得较高浓度的细胞且利用易得廉价原料 不致病、不产生内毒素 发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态 容易进行DNA重组技术操作和代谢调控 产物的产量、产率高且易于提取纯化
8
大肠杆菌表达体系的特点
• 经过长期的研究，已经掌握了有关大肠杆菌基础生物学、 遗传学以及分子生物学等方面的背景知识，特别是对基 因表达调控的分子机理； • 被发展成为安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的 寄主菌株和不同类型的载体系列；
• 许多克隆的真核基因，如生长素和胰岛素基因等已实现 有效的、高水平的表达； • 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，因此易于进 行工业化批量生产。
9
（一）对外源目的基因的要求
真核基因含有的内含 子，可在基因转录过 真核启动子缺乏结合 程被RNA酶催体系剪 细菌核糖体所必须的 真核基因 mRNA分子 辑删除掉 SD 序列；细菌的 的 5’端帽子和 3’端尾 细菌缺乏对真核基 RNA 聚合酶不能识别 巴结构影响其在原核 （1）利用大肠杆菌表达真核基因存在问题 因的蛋白产物正确 真核启动子 中的稳定性和与核糖 折叠和组装过程， 结构上存在很大的区别 体结合的能力 表达产物要经过复 转译起始信号不同 性异源性蛋 白 mRNA分子结构的不同 原核生物缺乏转译后的修饰过程
细菌的蛋白酶能识别目的蛋白并将其降解
10
（一）对外源目的基因的要求
（2） 外源目的基因的基本要求
不含有内含子结构（cDNA或是mRNA） 不具有5´端非编码区
11
（二）原核生物表达载体

分子生物学：基因克隆及克隆基因的表达

分子生物学：基因克隆及克隆基因的表达

Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
互连后？
GCCTAG+
GATCC G
ATCTAG+GATCTA
Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
5. 不同的酶可以识别同一个序列 同工异源酶（isoschizomer）或同裂酶 能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同的两种酶。
6. 水浴槽
8. 电泳系统
分子克隆常用的有毒试剂
1. 溴化乙锭: （Ethidium bromide，EB）用来染DNA和RNA的染料, 是一种致癌物 质；它是DNA突变的诱变剂，可以嵌入DNA，使DNA发生突变，致癌。 有累积 效应，不要直接接触，但是要注意通过呼吸摄入，故此环境要通风。EB可以被 皮肤吸收。做实验的时候一定要带手套。但是，只要按照标准的操作使不会有问 题的。严禁随便丢弃。因为EB是强致癌性，而且易挥发，挥发至空气中，危害 很大。
2. DEPC：DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质， 是RNA酶的强抑制剂；DEPC是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的 条件下进行，并避免接触皮肤。DEPC毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的， 使用时戴口罩。不小心占到手上注意立即冲洗。
3.苯酚：苯酚又名酚或石碳酸,为高毒类原浆毒物,对人体危害严重。它的浓溶液 对皮肤有强烈的腐蚀性,苯酚所致的急性中毒常常造成死亡。 4. 氯仿：三氯甲烷，侵入途径：吸入、食入、经皮吸收。健康危害：主要作用 于中枢神经系统，具有麻醉作用，对心、肝、肾有损害。吸入或经皮肤吸收引起 急性中毒，初期有头痛、头晕、恶心、呕吐、兴奋、皮肤粘膜有刺激症状，以后 呈现精神紊乱、呼吸表浅、反向消失、昏迷等，重者发生呼吸麻痹、心室纤维性 颤动、并可有肝、肾损害。误服中毒时，胃有烧灼感、伴恶心、呕吐、腹痛、腹 泻以后出现麻醉症状。慢性中毒：主要引起肝脏损害，此外还有消化不良、乏力、 头痛、失眠等症状，少数有肾损害。 5. 十二烷基硫酸钠（SDS）：提取质粒使用的溶液II中含有SDS，对粘膜和上呼 吸道有刺激作用，对眼和皮肤有刺激作用。可引起呼吸系统过敏性反应。。 6. 其它常用的试剂如强酸强碱都有很强的腐蚀性。

基因克隆与表达

基因克隆与表达

基因表达的检测方法
Northern blot：检测mRNA的方法，可用于检测基因的表达水平。
RT-PCR：通过逆转录和PCR技术，检测特定基因的表达水平。
Western blot：检测蛋白质的方法，可用于检测基因的表达产物。 免疫荧光技术：通过抗体与目标蛋白质的结合，利用荧光标记技术进行 检测。
基因克隆与表达的研究流程
同的后代。
克隆技术可以用 于繁殖动物、植 物和微生物，以 及用于生产转基 因生物和基因治
疗。
克隆技术的主要 步骤包括获取供 体细胞的DNA、 将DNA植入受 体细胞、培养产 生的胚胎并使其 发育成新个体。
克隆技术的优点 包括可以快速繁 殖具有优良性状 的动物和植物， 以及可以用于基 因治疗和药物生
产等领域。
生物安全：基因 克隆与表达技术 可用于检测和预 防生物威胁，如 生物武器和病原 体的传播，保障 公共安全。
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克隆技术的应用：克隆技术在医学、农业、生物技术等领域具有广泛的应用价值，例如 用于生产转基因动物、研究动物模型、繁殖濒危物种等。
克隆技术的分类
胚胎干细胞克隆技术 核移植克隆技术 转基因克隆技术 基因克隆技术
克隆技术的应用
添加项标题
克隆动物：通过基因克隆技术可以繁殖出具有相同基因的动物， 用于医学研究、药物筛选和动物模型建立等。
03 基因表达的调控
基因表达的概述
基因表达的定义：基因表达是指基因经过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质的过程。
基因表达的调控方式：包括转录水平的调控、转录后的调控和翻译水平的调控。
基因表达的调控机制：包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA等。
基因表达的生物学意义：基因表达调控对于生物体的生长发育、代谢和环境适应性等方 面具有重要意义。目的基因的获取：通过基因、PCR、基因合成等方法获取目的基因

第八章基因工程电子教案

第八章基因工程电子教案
的遗传信息转移过程 • 转染(transfection): 真核细胞主动摄取或被动
导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。
目的基因的筛选和鉴定
(screening/selection)
• 遗传学方法
– 插入灭活法(insertion inactivation):抗药性标志选择 – 标志补救 表达产物与营养缺陷互补
• 3′→5′外切酶活性 • 5′→3′外切酶活性
3′→5′外 切 酶 活 性
5′
3′
3′
5′
5′→3′外 切 酶 活 性
末端脱氧核 苷酰转移酶 (TDT)
载体 vector
• DNA ，能在宿主细胞中进行自我复制和 表达
• 克隆载体、表达载体 • 原核载体: 质粒(pBR322,pUC…）
Eco RⅠ Hind Ⅲ
氨苄青霉素 抗性基因
(ampr)
Pst Ⅰ
pBR322
Bam HⅠ
Sal Ⅰ
四环素 抗性基因
(terr)
Ava Ⅰ
O ri
Pvu Ⅱ
常用的克隆载体
• λ噬菌体(λphage) • 基因组分三个区域: 左侧区、中间区（非必需
区）、右侧区 • DNA，替换型载体，外源DNA: 9~23kb • 常用: EMBL 系列、 λgt 系列、charon系列 • 粘性质粒(cosmid): λDNA的 cos区+质粒，双链
环状DNA，克隆容量: 40~50kb • M13噬菌体 • 最大优点: 产生单链DNA
特点:
cos:cohesiveend site
RF DNA: replicational form DNA
优点:
表达载体(expressing vector)

大肠杆菌基因表达系统

大肠杆菌基因表达系统

必须用cDNA或者是化学合成的基因。 外源基因不能带有内含子。
除了具备克隆载体具备的条件外，还应具备以下条件： 强启动子、强转录终止子 可诱导性 合适的核糖体结合位点和起始密码ATG等
理想原核表达载体具备的基本特征
1
2
5
4
3
A dividing E. coli
原核或噬菌体启动子
MCS
SD序列
终止子
条件：
组成结构：
必须选择一个有lacI的宿主菌。
tac P
Lac O
S导物： IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）
阻遏物
IPTG
2.分泌型表达载体
如：pIN III系列： 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。 pIN III-A1, pIN III-A2, pIN III-A3,
EcoR I
BamH I
凝血酶
Ile Giu Gly Arg Gly Ile Pro Gly Asn Ser Ser
EcoR I
BamH I
Xa因子
pGEX-3X的插入区：
Sma I
Sma I
其他融合蛋白系统
His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。
细胞质
外膜
内膜
周间质
质粒
染色体
“外排”： 蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。 “分泌”： 蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。
01
碱性氨基酸
Leu、Ile
Arg、Lys
02
N
04
疏水氨基酸核心区
07
AlaGlySer

基因工程中的基因克隆与表达

基因工程中的基因克隆与表达

基因工程中的基因克隆与表达基因工程是一门涉及分子生物学、遗传学、生物化学等多个学科的综合性科学。

其中，基因克隆和基因表达是基因工程研究的两个重要方面。

本文将就基因克隆和基因表达的原理、方法及应用进行探讨。

一、基因克隆1.原理基因克隆是指将目标基因从其天然基因组或其他来源中分离出来，并将其插入到另一个载体（如质粒）中，使其能够在宿主细胞内复制和表达。

基因克隆的原理是基于DNA序列特异性杂交的方法，利用限制性内切酶切割目标DNA和载体DNA，然后将它们黏合在一起，形成重组DNA。

通过转形或感染，使重组DNA 进入宿主细胞内，并复制和表达。

2.方法基因克隆的方法主要有限制性酶切与黏合（RE-Mediated Ligation）、PCR（聚合酶链反应）、TA克隆和基因文库等。

限制性酶切与黏合是一种常用的基因克隆方法。

该方法利用限制性内切酶切割DNA，然后通过T4 DNA连接酶黏合在一起。

这种方法操作简单、效率高，但存在限制内切酶的局限性，无法应用于不同酶切位点的DNA。

PCR是用于复制DNA片段的重要方法，也可以用于基因克隆。

PCR方法可以在不使用限制酶的情况下，从任何源提取DNA片段，扩增需要的基因段，并使用酶切和连接技术插入到载体中。

TA克隆是指用于从PCR产物中克隆DNA的一种方法。

该方法利用了Taq聚合酶不完全特异性合成3'-末端斜伸的性质，使产生的末端序列与T自带的A进行互补配对，从而使PCR产物能够被直接连接到TA克隆载体上。

基因文库是一种重要的基因克隆技术，可以将许多目标基因同时克隆入同一载体中。

基因文库分为cDNA文库和基因组文库。

通过荧光筛选或选择性培养，可以从文库中筛选出感兴趣的基因。

3.应用基因克隆技术广泛应用于基因工程、疫苗制备、药物研发、作物改良、动物遗传改良、环境污染治理等领域。

例如，利用基因克隆技术可以创造出超级细菌、工业用酶、新型药物、高产优质作物等。

二、基因表达1.原理基因表达是指基因通过转录和翻译的过程，将DNA序列转化为蛋白质的过程。

第八章目的基因的表达

第八章目的基因的表达

1. 外源基因在原核细胞中表达必须满足的条件： 通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导
宿主菌的酶系统合成外源蛋白；
外源基因不能带内含子，必须用cDNA，而不能 用基因组DNA；
利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件 控制外源基因的表达；
外源基因与表达载体连接必须形成正确的开放 阅读框架；
影响翻译效率的因素主要有：
1) SD序列与rRNA的16S亚基3’端 序列的互补程度，是影响翻译效率的 主要因素。
2) 起始密码AUG与SD序列之间的距离以 及SD序列的核苷酸组成也影响翻译能力。
连接在SD序列后面的4个碱基成分的改 变也会对转译效率发生很大的影响。如果 这个区域是由4个A(T)碱基组成，其转译 作用最为有效；而当这个区域是由4个C碱 基或4个G碱基组成，其转译效率只及最高 转译效率的50％或25％。
克隆基因末端的转录终止区的存在，可避免 以下几种不利现象：
①若干非必须的转录本的合成，会使细胞消 耗巨大的能量用于制造大量非必须的蛋白质；
②在转录本上有可能形成一些不期望其出现 的二级结构，从而降低了转译的效率；
③偶然会出现启动子阻塞现象，即克隆基因 启动子所开始的转录干扰另一个必要的基因或调 节基因的转译。
3) 通过融合表达为蛋白纯化提供便利：
将外源目的基因与一段“亲和手柄”的编码序 列相连接，这段“亲和手柄”可以与亲和层析柱 上的配基特异性地结合，这样所表达的融合蛋白 可以用亲和层析的方法快速而简便地纯化出来。
所得到的融合蛋白经化学方法或酶法切割开来 之后，混合产物再上同一亲和柱，充作“亲和手 柄”的一段多肽或蛋白以及尚未被切开的融合蛋 白被吸附于柱上，而重组目的产物则处于流动相 中。这样，经过比较简单的几步即得到较高纯度 的重组目的蛋白。

生物技术中基因克隆和表达系统的优化和开发

生物技术中基因克隆和表达系统的优化和开发

生物技术中基因克隆和表达系统的优化和开发生物技术是一门涵盖广泛的学科，其研究范围涉及到生物学、化学、物理学、工程学等。

其中，基因克隆和表达系统是生物技术中的重要组成部分。

在生物工程领域中，基因克隆和表达系统的优化和开发是非常重要的，因为这两个方面的研究有助于增强生物体内目标基因的表达，从而实现外源蛋白质的高效生产。

在本文中，将简单谈论一下基因克隆和表达系统的优化和开发。

一、基因克隆的优化基因克隆是指将外源基因插入到宿主细胞内，使其表达特定蛋白的过程。

在进行基因克隆的时候，需要用到一些基础技术，如PCR（聚合酶链式反应）、限制酶切割和连接等。

在基因克隆的过程中，可能会出现一些问题，例如选错启动子、选择错误的质粒载体、或者使用了过期的限制酶等。

这些问题都会导致基因克隆的失败，从而影响到后续的表达实验。

为了避免这些问题，需要进行基因克隆的优化。

其中一些优化措施包括：1. 选择合适的启动子：启动子是一段DNA序列，它能够介导特定基因在宿主细胞内的表达。

为了实现最佳的表达效果，需要选择合适的启动子，比如说强启动子或者特异性启动子。

此外，还需要对启动子进行研究，了解它们的活性和可控制性。

2. 选择适当的质粒载体：质粒是一种能够携带外源DNA序列的小环状DNA分子。

在进行基因克隆时，需要选择合适的质粒载体，以确保外源基因能够被正确稳定地保留在宿主细胞中。

3. 选择正确的限制酶：限制酶是一种能够切割特定DNA序列的酶类。

在进行基因克隆时，需要选择正确的限制酶来切割DNA分子，从而实现合成质粒载体和外源基因的连接。

4. 稳定可靠的化学方法：最近对基因克隆中所用化学方法的问题更为关注。

比如常用的T4 DNA酯酶和RNA酯酶操作容易带来污染和失效，现在已经有很多酶来代替这些具有问题的化学酶。

其中包括Pfu酶，Q5酶，Luna酶等。

二、表达系统的开发表达系统是指将基因转录成mRNA，再转译成蛋白的过程。

在生物技术中，外源蛋白的表达是非常重要的，因为它涉及到生物大分子制备与分析，如疫苗制备、生物药制品生产等。

基因克隆和表达技术及其应用研究

基因克隆和表达技术及其应用研究

基因克隆和表达技术及其应用研究在现代生物技术领域，基因克隆和表达技术被广泛应用于生物医药、农业生产、环境保护等多个领域，是一项重要的研究方向。

本文将介绍基因克隆和表达技术的原理、工具和应用，旨在深入探讨该技术在现代生物科技领域中的应用价值。

一、基因克隆的原理与工具基因克隆是指将目标DNA片段放入载体中，通过复制和传递，获得大量相同的DNA分子的过程。

基因克隆需要用到一系列工具和分子生物学技术。

其基本的步骤包括：DNA提取、限制酶切割、连接和转化等。

DNA提取是指从细胞中获取目标DNA，一般从细胞核中提取DNA样品。

限制酶切割是一种利用特定的限制酶将DNA切割成不同长度的碎片的技术。

连接是指将目标DNA片段与载体DNA进行配对，在适当的连接条件下会形成一个大的DNA分子，也称作重组DNA。

最后的转化是将重组DNA重新引入一个宿主细胞，使其进行繁殖。

这些步骤组成了一个典型的基因克隆工作流程。

在基因克隆中，一些关键工具也是必不可少的。

例如，限制酶和DNA连接酶是进行酶切和连接的酶类；载体是将目标DNA载入的载体分子。

当然，在实验设计过程中，也需要考虑到多种子序列的选择，以获得最优的结果。

二、基因表达技术基因表达技术是指将克隆好的基因转录和翻译为蛋白质的过程。

基因表达技术所涉及的核心部分主要为转染和转录。

转染是指将载体转化到目标细胞中的过程。

转染可以分为多次批量的直接转染和、转染载体的两种方式。

对于细胞质和细胞核分离的情况，病毒载体或质粒载体也可以被用来介导转录。

质粒载体在转录的时候需要被移入到细胞的核中，由此促进了 DNA 受体和 RNA聚合酶之间的相互作用。

另一种重要的基因表达技术是转录，也称作转录调节。

转录调节可以分为两类：正调节和负调节。

正调节是指通过上调特定基因的表达、促进特定转录的过程；负调节是指通过下调特定基因的表达、抑制特定转录的过程。

转录调节受到多种因素的影响，例如转录因子和超融合酶等分子的运作。

第八章克隆基因表达系统2014年

第八章克隆基因表达系统2014年

二、 外源基因在真核细胞中的表达
真核细胞做宿主表达系统的优点 ➢ 能够识别和除去外源基因中的内含子,剪接加工形
成成熟的mRNA,包括5’端加帽和3’-端加尾 ➢ 真核细胞将表达的蛋白质糖基化 缺点: ➢ 选择标记及选择系统只有少数几个 ➢ 转化效率低,只有10-6~10-4 ➢ 外源基因转移并整合到细胞染色体DNA上带有一
1、阅读框架：指基因的编码区，包含从起始密码 子至翻译终止密码子之间的cDNA序列。
2、顺式作用元件 顺式作用元件对基因转录起始的调控 ➢ 启动子 ➢ 增强子 ➢ 沉默子 顺式作用元件对转录终止的调控 ➢ 终止子 ➢ 衰减子
启动子
是RNA聚合酶识别,结合并起始转录的一段 DNA序列,长度随生物种类不同而异.主要 特征:
分泌型表达载体----pINIII-ompA1
lac
3. 融合蛋白表达载体系统----pGEX系列
表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌 体蛋白连接在一起的。
优点： 可诱导高效表达 载体内含有lacI阻遏蛋白基因 融合蛋白的分离和纯化方便 使用凝血酶和Xa因子可以从表达的融合蛋白中
启动子 :是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始 mRNA合成的序列 ,是基因表达不可缺少的序列.
保守序列
-10区（Pribnow框）也称TATA-box,TATAAT
-35区（Sextama框）TTGACA,是RNA聚合酶σ 亚基的识别与结合位点
-1 +1
+30
TTGACA
15~20bp TATAAT
终止密码子对翻译的效率有很大影响. UAA,UAG,UGA
4 表达系统对表达产物的影响
表达载体和受体细胞共同组成了外源基因 的表达系统.

克隆基因表达与常见系统类型

克隆基因表达与常见系统类型

如：pIN III系列：
pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3,
分泌信号 肽外膜蛋 白基因
Ipp lac P lac O S-D/ATG ompa 插入位点
克隆基因的表达和常见系统的类型
3）. 融合蛋白表达载体：如pGEX系列 表达出的外源基因产物蛋白是与质粒
载体表达出的外源基因蛋白质不与细 菌的任何蛋白质融合在一起。
S-D序列 ATG-外源基因-TAG
优点： 产物结构接近于真核细胞体内的
蛋白质结构。 缺点：
容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。 克隆基因的表达和常见系统的类型
克隆基因的表达和常见系统的类型
2）. 分泌型表达载体
载体表达出的外源蛋白质与细菌的分 泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细 胞周质中。
克隆基因的表达和常见系统的类型
2、大肠杆菌表达外源基因的劣势：
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能； 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统； 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白；
周质内含有种类繁多的内毒素。
克隆基因的表达和常见系统的类型
3、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位
1）. 细胞质中表达 表达蛋白常以包涵体（inclusion body）
在这
啊！
结构，存于细胞质或细胞周质中，
无正确的空间构象，一般无生物
活性。
、包涵体表达形式的优点： 外源基因表达产物易于分离纯化； 能在一定程度上保持表达产物的结构稳定； 能表达对宿主有毒或有致死效应的目标蛋白。
克隆基因的表达和常见系统的类型
、包涵体型蛋白表达形式的缺点： §、包涵体用变性溶剂溶解、复性后， 不 一定能恢复生物学活性，回收的蛋白 生物活性差 ； §、复性成本较高。
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第八章 克隆基因的表达
目的基因分离后，对研究者来 说最重要的就是了解基因的功能。 只有当一个基因能正常表达时， 我们才能了解基因的内幕。
基因的表达:指遗传信息从DNA到RNA再到 蛋白质的过程
Operator promoter Structural gene terminator
G1
G2
G3
一、影响外源基因表达的因素
-1 +1 +30
TTGACA
- 35元件
15~20bp
TATAAT
- 10元件
6bp
CAT
启动子
启动子
PlL PrecA PtraA Ptrp Plac Ptac
-35 区序列
TTGACA
-10 区序列
GATAC T
T T G A T A
T A G A C A T T G A C A T T T A C A T T G A C A
终止密码子对翻译的效率有很大影响. UAA,UAG,UGA
4 表达系统对表达产物的影响

表达载体和受体细胞共同组成了外源基因 的表达系统.
二、外源基因在原核细胞中的表达
Operator promoter
Structural gene
terminator
G1
G2
G3
(一)、原核生物基因表达的特点

二、 外源基因在真核细胞中的表达
真核细胞做宿主表达系统的优点 能够识别和除去外源基因中的内含子,剪接加工形 成成熟的mRNA,包括5’端加帽和3’-端加尾 真核细胞将表达的蛋白质糖基化 缺点: 选择标记及选择系统只有少数几个 转化效率低,只有10-6~10-4 外源基因转移并整合到细胞染色体DNA上带有一 定的自发性和盲目性,整合的拷贝数和位置还不能 控制 细胞培养和细胞挑选的要求比较高

-10 区顺序:GATAAT, -35区顺序:TGACTA

tac启动子 由trp 和 lac启动子人工构建的杂合启动 子
2.Shine-Dalgarno（SD）序列

位于翻译起始密码子（AUG)上游5-13bp处 的由3-9个bp组成的核苷酸序列富含嘌呤 核苷酸， 5’ UAAGGAGG 3’，，它通 过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16S rRNA 3’端区域3’ AUUCCUCC 5’并与 之专一性结合，将mRNA定位于核糖体 上，从而启动翻译；
1、阅读框架：指基因的编码区，包含从起始密码 子至翻译终止密码子之间的cDNA序列。 2、顺式作用元件 顺式作用元件对基因转录起始的调控 启动子 增强子 沉默子 顺式作用元件对转录终止的调控 终止子 衰减子
启动子
是RNA聚合酶识别,结合并起始转录的一段 DNA序列,长度随生物种类不同而异.主要 特征: 序列特异性: 方向性:结构一般是不对称的，正反两个 方向只有一种具有启动功能 位置特异性 种属特异性:
(2) SD序列与起始密码子之间的序列的影响
SD序列下游的碱基若为AA率则分别 是最高值的50%和25%。紧邻AUG的前三个 碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳 的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、 UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍

内在终止子 依赖ρ 因子的终止子
（intrinsic terminator)

(ρ - dependent terminator ）
4.衰减子

指在某些前导序列中带有控制蛋白质合成 速率的调节区。能够与mRNA作用形成独 特的结构，终止转录。
原核生物的选择标记基因

Amp, Tet, St 等
(二)、原核生物基因表达的调控序列

原核生物基因表达的调控序列主要涉及启 动子,S-D序列,终止子,衰减子等序列
1.原核生物启动子结构
启动子 :是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始 mRNA合成的序列 ,是基因表达不可缺少的序列.
保守序列

-10区（Pribnow框）也称TATA-box,TATAAT -35区（Sextama框）TTGACA,是RNA聚合酶σ 亚 基的识别与结合位点
mRNA上一段同核糖体16S RNA3’末端碱基互补的序列，叫 Shine-Dalgarno（S-D）序列
原核表达系统的注意事项




通过表达载体将外源基因导入宿主菌,并指导 宿主菌酶系统合成外源蛋白 外源基因不能带有内含子,必须用cDNA或全 化学合成基因 外源基因与表达载体连接后形成正确的开放 阅读框架(open reading frame)。 必须利用原核细胞的调控原件（启动子等） 防止外源基因产物对宿主细胞的毒害
(3) SD序列与起始密码子之间的距离的影响：
SD序列与起始密码子之间的距离是影响mRNA转译成
蛋白的主要因素之一。在很多情况下，SD序列位于
AUG之前大约七个碱基处。在此间隔中少一个碱基 或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降 低
3.终止子结构
在一个基因的3’端或是一个操纵子的3’端往往有一特定的核 苷酸序列,有终止转录的功能,这一序列称为转录终止子, 简称终止子. 转录终止过程包括: DNA聚合酶停留在DNA模板上不再前进，RNA的延伸停止； 完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来； RNA聚合酶从模板上释放出来。 特点:有一段富含A/T的区域和一段富含G/C的区域,G/C区 域又具有回文对称结构,转录后形成的RNA具有茎环结构, 并且有与A/T富含区对应的一串U.





只有一种 RNA 聚合酶，识别原核细胞的启动子，催化所 有的RNA合成。 以操纵子为单位，数个相关的结构基因与其调控区结合 形成一个表达的协同单位 转录和翻译偶联、连续进行。 不含内含子，缺乏转录后的加工系统 调控主要在转录水平上 mRNA的核糖体结合位点上含有一个转译起始密码子及 同16S核糖体RNA末端互补的序列,即Shine-Dalgarno （S-D）sequence
分泌型表达载体----pINIII-ompA1
lac
3. 融合蛋白表达载体系统----pGEX系列
表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌 体蛋白连接在一起的。 优点： 可诱导高效表达 载体内含有lacI阻遏蛋白基因 融合蛋白的分离和纯化方便 使用凝血酶和Xa因子可以从表达的融合蛋白中 切下所需的蛋白质和多肽 用EcoRI从rgt11载体中分离的基因可直接插 入Pgex-1rT中
pIN III系列：pINIII comA1-3





强启动子：Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子 调节基因：lac I S-D序列和起始密码ATG 分泌信号肽 大肠杆菌外膜蛋白基因ompa 插入位点区（多克隆位点）。 Ipp---lac-----lacO----S-D/ATG—ompa----插入位点 pIN III-comA1 以pBR322为基础构建的 调节基因不必借助于宿主的lacI.

P
如pKK223-3 载体
S-D
结构基因
TAG
pKK223-3 载体
强启动子: tac（trp-lac） 操纵基因：乳糖操纵子系统。 调节基因：宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统， 如JM105 终止子：rrnB核糖体RNA的强终止子 S-D序列和插入位点区 载体的其余部分：来自pBR322质粒 表达诱导物IPTG（乳糖的类似物，不会被降 解） 必须选择一个有lacI的宿主菌

2.分泌型表达载体- pIN III系列


除了在细胞内表达外，还可让表达的蛋白分 泌到细胞外或细胞周质区中。这种表达方式 可避免细胞内蛋白酶的降解，或使表达的蛋 白正确折叠，或去除 N-- 末端的甲硫氨酸， 从而达到维护目标蛋白活性的目的。 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号 肽连在一起。

(五)、提高外源基因表达水平的策略





选择强启动子序列，如tac 等 调整S-D序列与AUG碱的距离，一般为5-9bp 改变起始密码下面的几组密码子 增加mRNA的拷贝数和稳定性 减轻宿主细胞的代谢负荷 提高表达产物的稳定性
减轻宿主细胞的代谢负荷
常用的方法有: 诱导表达:使细菌的生长与外源基因的表 达分开.一般用温度或药物诱导 表达载体的诱导复制:将宿主菌的生长和 表达质粒的复制分开
翻译是mRNA指导多态链合成的过程,包括 多态链合成的起始,延伸和终止过程 翻译起始对基因表达的影响
原核生物起始密码子(AUG),SD,SD序列与起始密码之间的 距离保持在9±3个核苷酸;真核生物的5’端帽子结构,起始密 码子周边共有序列,有效的ORF是翻译所必需


密码子偏爱的影响 翻译终止的影响
增强子
远距离调节启动子并提高转录效率的一段DNA序列, 由多个元件组成,每个元件可与一种或多种转录调 控因子结合.最早在SV40中发现,作用方式特点: 双向作用 提高转录效率 无位置效应 远距离作用 组织特异性:只能在特定组织中增强与其相连的 启动子的活性 无基因特异性
沉默子
(三)、几种常用的原核表达载体
1.
2.
3.
pkk233-3:非融合型表达蛋白载体； PIN III: 分泌型克隆表达载体； pGEX:融合蛋白表达载体。
1.非融合型表达载体
载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的 任何蛋白质融合在一起 优点:产物结构接近于真核细胞体内的蛋白 质结构,其表达产物的生物学功能也就更 接近生物体内天然蛋白 缺点:容易被细菌蛋白酶所破坏.

Foreign DNA P SD
融合型表达载体
融合基因
启动子：tac 操纵基因：lacO， 调节基因：lacI S-D序列， ori：pBR322 ori， S-D下游融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶） lacI--Ptac----lacO---S-D/ATG---GST---基因插 入位点---TGA