引物探针设计原则

两种定量分析方法的比较及Taqman探针、引物设计原则遗传物质DNA首先要把所携带的遗传信息转录成为信使RNA（mRNA）,携带遗传信息的mRNA从细胞核进入到细胞质中与核糖体结合，在核糖体中mRNA携带的遗传信息被翻译成为多肽，多肽经过进一步加工后变成蛋白质，至此遗传物质DNA完成了表达过程。

期间的转录过程是基因表达中非常重要的调节步骤，所转录的mRNA的多少直接影响着相关最终蛋白质的多少，所以通过对细胞内某条基因mRNA含量多少的分析，就能大致判断出该条基因的表达是否活跃。

定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置，PCR扩增和检测同时进行；在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。

该技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR 相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。

定量PCR常用的三个常用概念扩增曲线、荧光阈值、Ct值扩增曲线：反映PCR循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR仪每次轮PCR扩增都会自动记录荧光强度的变化荧光阈值：样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99。

CT值：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

C(t) value扩增曲线阈值及CT值荧光定量PCR的数学原理理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0* (1+Ex)n（n：扩增反应的循环次数；X：第n次循环后的产物量；X0：初始模板量；Ex：扩增效率）在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量，在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:log M=log X0 (1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得:log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3)由此可见，log X0浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的该基因的初始模板量。

实时荧光Taqman 探针设计的几个要点实验室很多同学都要做Real time PCR实验，实验室的师兄师姐都会有很多宝贵意见，不过也有实验室前没有做过的，查找了下资料和大家分享下关于实时荧光Taqman探针设计、实时荧光PCR探针的选择、引物的设计及评价。

荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。

目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标Molecular Beacon。

广泛使用的TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。

探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。

当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’ 荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光)。

随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会将切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。

也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。

(请注意，该图显示的不是普通的Taqman探针法，而是Taqman MGB探针法)Taqman探针检测的是积累荧光。

常用的荧光基团有FAM，TET，VIC，HEX等等。

当探针完整的时候，由于3′端的荧光淬灭基团在吸收5′端报告基团所发射的荧光能量，本身会发射波长不同的荧光而导致本底高，因此TaqMan探针近来又有新的发展——TaqMan MGB探针。

引物探针设计原则引物探针是分子生物学和遗传学研究中广泛应用的工具，它们用于检测给定的DNA序列并在其特定的位置与其结合。

引物探针有许多种类型，但设计它们的原则是大致相同的。

本文将介绍引物探针设计的原则。

1. 引物探针应当特异性。

引物探针的最初设计原则是确保其特异性，即只在目标DNA序列上结合，而不在其他DNA序列上结合。

特异性可通过许多方式实现，如控制探针长度或通过选择引物的位置来避免与其他DNA序列的结合。

特异性也是确保引物探针的准确性和可靠性的关键。

引物探针长度对于其正确结合和探测目标DNA序列至关重要。

长引物比短引物更具特异性，因为它们有更多的机会与目标DNA序列结合。

此外，长引物对于特异性的保持和探测的灵敏度也更好。

3. 引物探针的选择应当优先考虑其3'端。

引物探针的3'端是其结合目标DNA序列的关键区域。

由于DNA聚合酶在扩增反应过程中是从3'端往5'端进行合成的，因此引物探针的3'端需要与目标DNA序列上的互补碱基配对。

在引物设计过程中，选择具有良好稳定性的3'端可以提高反应的特异性和酶活性。

4. 引物探针应当遵循PCR特定的设计规则。

在PCR（聚合酶链式反应）中，引物对于扩增反应的成功非常重要。

因此，在设计PCR 反应时需要考虑许多特定的因素。

例如，引物长度和序列，引物间的距离（扩增产物的大小）以及熔解温度等。

PCR反应的成功与否往往取决于如何正确地设计引物。

5. 引物探针应当特异地结合到目标DNA序列上。

良好的引物探针应当具有明确的探针特异性，在其结合目标DNA序列时表现出特异性。

因此，对于特定实验需要，探针的选择需要进行优化。

方法包括，评估引物和探针的特异性，交叉验证引物和探针与基因组的互补性，并对引物进行最佳的化学修饰和结构设计。

结论引物探针对于许多分子生物学研究非常重要。

在设计引物探针时，需要考虑许多因素，如特异性、长度、优先考虑3'端、PCR特定的设计规则和特异地结合目标DNA序列。

Taqman设计总结⼀、单重Taqman引物探针设计：（为了确保引物和探针的特异性，最好将设计好的序列在www.ncbi.nlm.nih/blast中核实⼀次）1、探针：探针的设计应该在引物的设计之前①长度：18~35（18~30之间最好、最常见），最长37；太长淬灭效果不好。

② TM值：Primer Express软件计算出来的Tm值在66~72℃之间（最常见68~70℃），最好为70℃，确保探针的Tm值要⽐引物的Tm值⾼出5~10℃，GC含量在30~80%（最好40%~70%），因此探针最好是富含GC的保守⽚段；（Primer Express：Do not expand the Tm range by more than 2 °C from the default range）。

③探针位置：尽可能地靠近上游引物,上游引物的3' 端离探针的5' 端为1-20bp（⼀般10个以内），最好是探针的5'端离上游引物的3' 有1个碱基。

④5'端应避免使⽤碱基G，5' G会有淬灭作⽤，即使被切割下来这种淬灭作⽤也还会存在；如果选择FAM-dye在5'端第⼆个序列也不能为G（G in the second position on the 5' end in FAM dye-labeled probes can reduce fluorescent normalized reporter signal）。

⑤可选：整条探针中，碱基C的含量要明显⾼于G的含量，G的含量多于C会降低反应效率，这时就应选择配对的另⼀条链作为探针。

要同时考虑在正反两条链上设计引物与探针。

若找不到完全保守的⽚段，也只能选取有⼀个碱基不同的⽚段，且这个不同的碱基最好在探针的中间，且最好为A或T。

⑥Repeating oligonucleotides：a. 避免探针中同⼀碱基重复过多，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现，即≦3（Avoid runs of identical nucleotides. If repeats are present, there must be fewer than four consecutive G residues.）；b. 避免连续的6个A出现（Consecutive A residues：Avoid six consecutive A residues anywhere in the probe.Consecutive A residues can cause a high No Template Control (NTC) signal）；c. 避免探针的中间区域含有2个或以上的CC dinucleotides（Avoid two or more CC dinucleotides in themiddle of the probe, which can sometimes reduce signal）。

定量PCR引物探针设计原则定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种用于测量DNA分子数量的技术。

在进行定量PCR实验时，合理设计引物和探针非常重要，下面将探讨一些定量PCR引物和探针设计的原则。

1.引物设计原则：1.1引物长度：引物的长度一般在18-30个碱基对之间，过短的引物可能导致非特异性扩增，而过长的引物可能导致扩增效率降低。

1.2引物的GC含量：引物的GC含量应在40-60%之间，过高或过低的GC含量都可能导致非特异性扩增。

1.3引物的熔解温度（Tm）：引物的熔解温度应在50-60摄氏度之间，可以通过计算引物序列的碱基组成和长度来预测引物的Tm值。

1.4引物的特异性：引物的特异性是设计引物时最关键的考虑因素之一、引物的特异性可以通过检查与该引物匹配的靶标序列在基因组或转录组中的唯一性来评估。

可以使用生物信息学工具，如BLAST（基本局部序列比对）来分析引物的特异性。

此外，还可以使用引物的3'末端碱基序列的特异性来提高引物的特异性。

2.探针设计原则：2.1探针的长度：探针的长度一般在20-30个碱基对之间。

2.2探针的熔解温度（Tm）：与引物类似，探针的Tm值也应在50-60摄氏度之间。

2.3探针的特异性：与引物一样，探针的特异性也是设计探针时需要考虑的重要因素。

探针的特异性可以通过生物信息学工具来分析，如BLAST。

此外，还可以设计探针的3'末端碱基序列来提高其特异性。

2.4探针的化学修饰：在实验中，通常使用荧光标记的探针来实现定量PCR。

探针可以通过荧光基团，如FAM、VIC、HEX等进行标记。

此外，还可以在探针的两端引入磷酸酯键或磷酸二酯键等化学修饰，以提高探针的稳定性和特异性。

总结起来，定量PCR引物和探针的设计需要考虑引物长度、GC含量、熔解温度和特异性等因素。

在设计引物和探针时，可以使用生物信息学工具来分析其特异性，并通过化学修饰来提高其稳定性和特异性。

多重荧光定量pcr引物和探针设计方法多重荧光定量PCR（Multiplex qPCR）是一种利用多组引物和探针同时扩增和检测多个靶标序列的技术。

它具有高通量、高灵敏度、高特异性和高精确性的优点，广泛应用于基因表达定量、基因突变检测、病毒感染检测等领域。

为了设计适用于多重荧光定量PCR的引物和探针，需要考虑以下几个方面。

1. 靶标选择与设计首先，需要选择适合于多重荧光定量PCR的靶标序列。

靶标序列应具有明显的差异性，能够有效区分不同的样本。

此外，还应该考虑靶标序列的长度，推荐长度在100-200bp之间。

最好通过生物信息学工具进行靶标序列的选择和设计。

2. 引物设计在多重荧光定量PCR中，每个靶标序列需要设计一对引物。

引物的设计应遵循以下原则：（1）引物长度：引物长度一般在18-24个碱基之间，尽量保持相似的长度。

（2）引物Tm值：引物的熔解温度（Tm）应相似，通常应在55-65℃之间。

（3）引物特异性：引物应具有较高的特异性，避免与非靶标序列发生非特异性扩增。

（4）引物相互作用：不同引物之间应避免相互作用，特别是避免引物间的二聚体形成。

（5）GC含量：引物的GC含量应在40-60%之间，以保证扩增效果和特异性。

3. 探针设计多重荧光定量PCR中可以选择使用探针进行定量分析。

探针的设计应遵循以下原则：（1）探针长度：探针长度通常在16-30个碱基之间，最好控制在20个碱基左右。

（2）探针Tm值：探针的Tm值应相似，通常要比引物的Tm 值高2-5℃。

（3）探针结构：选择合适的探针结构，常用的有TaqMan探针、MGB探针、Scorpion探针等。

根据实验需求选择合适的探针结构，以提高灵敏度和特异性。

4. 引物和探针的检测验证在设计引物和探针后，需要进行实验验证。

可以通过单引物和单探针PCR进行验证，检测目标序列的特异性和效果。

如果存在非特异性扩增或效果不理想，需要对引物和探针进行修改和优化。

总的来说，多重荧光定量PCR引物和探针的设计需要考虑靶标选择与设计、引物设计、探针设计以及引物和探针的检测验证等方面。

定量P C R引物探针设计原则Document serial number【NL89WT-NY98YT-NC8CB-NNUUT-NUT108】定量PCR引物、探针设计原则自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR 要求。

当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。

一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。

第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBIgenbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。

第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：总体原则先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。

所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。

建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。

扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。

PCR和定量PCR的引物和探针设计PCR（聚合酶链反应）是一种用于扩增特定DNA序列的技术。

引物和探针是PCR中的关键组成部分，它们的设计对PCR的灵敏度和特异性至关重要。

引物是专门设计用于扩增目标DNA序列的两个短链DNA片段。

对于PCR反应的成功与否，引物的设计是至关重要的。

在引物设计中，以下几个因素需要考虑：1.引物长度：引物通常由18-24个碱基组成。

引物过短可能导致非特异扩增，而引物过长可能导致特异扩增低下。

2.引物序列：引物的序列应与目标DNA序列互补，以确保引物与目标序列之间的碱基配对。

避免引物序列中存在重复和寡聚核苷酸，以防止非特异扩增。

3.引物Tm值：引物的熔解温度（Tm）是引物与模板DNA断裂的温度。

引物的Tm值应相似，通常在50-65℃之间。

4.引物之间的互补性：引物之间应避免自身互补或与对方互补，以防止引物形成二聚体或无特异性扩增。

探针是一种带有荧光标记的SSO（特异性杂交寡核苷酸）或DSA（二链特异性杂交寡核苷酸），它能够检测到靶序列的扩增。

探针分为两类：探针（Hydrolysis Probes）和探针（Molecular Beacon Probes）。

1. 探针（Hydrolysis Probes）：这种探针包含一个与靶序列互补的引物和一个结合到引物上的荧光染料和一个淬灭器。

当DNA扩增反应进行时，引物与靶序列结合，使荧光染料与淬灭器距离远离，并发出荧光信号。

这种探针的设计需要考虑引物和探针之间的互补性，以确保特异性扩增和信号产生。

2. 探针（Molecular Beacon Probes）：这种探针是一段独特的DNA 或RNA序列，两端固定一个荧光染料和一个淬灭器。

当探针与靶序列结合时，形成一个折叠的结构，将荧光染料和淬灭器分开。

这种探针的设计需要考虑探针序列的互补性和结构的稳定性。

在引物和探针设计中1.特异性：引物和探针应与目标DNA序列具有高度特异性的互补性，避免与非目标DNA序列发生杂交。

定量P C R引物探针设计原则TTA standardization office【TTA 5AB- TTAK 08- TTA 2C】定量P C R引物、探针设计原则自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。

当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。

一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。

第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBI genbank序列以及DNAstar 等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。

第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：总体原则先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。

所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。

建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。

扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。

引物设计原则：1．上下游引物要保守为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100-200片段进行PCR 扩增。

所以引物的选取也要非常的保守。

2．上下游引物的长度一般为18-30bp之间，且Tm值在58-62℃之间，上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃。

3．确保引物中GC含量在30-80%。

应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。

引物的3’端最好不为G或/和C。

引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。

4．避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构，同时也应避免引物间配对形成引物二聚体。

5．跨外显子设计引物，用于区别或消除基因组DNA的扩增。

探针设计的基本原则：1.保守：探针要绝对的保守，有时分型就仅仅依靠探针来决定。

理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。

2.Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出5-10℃，这样可保证探针在退火时先于引物与目的片段结合。

3.确保探针中GC含量在30-80%。

4.避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基5.探针的5’端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。

6.Taqman探针应靠近上游引物，即Taqman探针应靠近与其在同一条链上的上游引物。

两者的距离最好是探针的5’端离上游引物的3’有一个碱基。

7.避免探针与引物之间形成二级结构。

8.对于多重定量PCR，例如SNP分型检测时，SNP位点应设计在探针的中间位置，并且两种探针的Tm值应相近。

引物探针设计原则张远涛Ph.D.Sr Field Application Scientist Hotline: 800 820 8982cnmcbsupport@定量PCR开发流程选择目标基因/ SNP位点设计探针和引物筛选引物、探针，优化各组分浓度验证完成选择目的基因/SNP位点序列查找引物探针设计两种实验设计策略•正向策略–修改反应条件–适应PCR引物•反向策略–设计引物适应反应条件–确定标准的化学–确定标准的程序–设计标准的扩增产物探针设计指南•先设计探针，后设计引物•探针的5'端第一个碱基不能是G•基因表达探针Tm值：68-70°C；基因分型探针Tm值：65-67°C •TaqMan-MGB探针长度在13-25bp，TaqMan探针长度13-30bp •避免同一碱基重复过多，特别是连续4个或更多的G•C比G多的探针效果更好，如果C少于G，选择其互补链•多态位点应尽量位于探针中央，可以±3个碱基为什么要C比G多？反义链：11 C / 3 G正义链：3 C / 11 GNN N N N N N N N N N N N N N N N N NpolymorphismTry to position the polymorphism here (central third)If necessary, put the polymorphism here (region of MGB)DO NOTPLACE HERE基因多态位点探针中的位置基因表达、cDNA定量研究中，特别设计探针跨过两个外显子，以增强扩增特异性3'RQ TaqMan 探针Exon 1Exon 3Exon 2用于基因表达的探针设计报告荧光(7500)~670CY-5报告荧光(7500)~610TEXAS Red参比荧光~610ROX报告荧光(7500)~580CY-3报告荧光~580NED淬灭荧光~580TAMRA报告荧光~550VIC报告荧光~550JOE报告荧光~520SYBR Green I报告荧光~5206-FAM用途最大发射峰(nm)荧光染料荧光标记基团的选择引物设计指南•引物尽可能地接近探针，但是不可与探针重叠•引物长度9-40bp，最优20bp，GC含量保持在30-80%之间•避免同一碱基重复过多，特别是连续4个或更多的G •引物Tm值在58-60°C之间，上下游引物Tm不要超过2°C •引物3’端的倒数5个碱基中，G和C加起来不要超过2个•引物3’端不要是碱基A，避免出现3个以上相同碱基•避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对•避免引物自身形成环状发卡结构•扩增片段的长度在50-150bp间primertemplatepolymerisation 3'5'为什么要减少引物3’端的G和C？引物3’端过多的G、C会导致暂时性错误复性，并很快就会被DNA酶稳定下来Primer Express v3.0软件引物探针设计常用工具设计软件：Primer Express、Beacon Desinger、Primer5网络免费资源：//realtimedesign/MFold（http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/mfold-simple.html）•引物和扩增产物二级结构的预测•二级结构的稳定性(delta G) 和融解温度(T m)NCBI•BLAST扩增特异性•/Blast.cgi反应试剂优化mM3.5~10MgCl 2U/μl 0.03~0.05TaqmM 0.15~0.20dUTPmM 0.15~0.20dCTPmM 0.15~0.20dGTPmM 0.15~0.20dATPμM 0.15~0.20探针3μM 0.20~0.30引物2μM 0.20~0.30 引物1mM 50~100KClmM 10~50Tris-HCl（pH 8.3 ）反应浓度成分引物浓度优化的数据判定N高浓度/高效率高浓度/低效率低浓度/高效率N:产物数量n:循环数n热循环程序激活Taq灭活UNGUNG反应退火延伸检测。

精心整理定量PCR引物、探针设计原则自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。

当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。

一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→配置反应体系→反应参数→重复实验，优化条件→获得曲线数据，比对标准曲线→再重复验证。

第一步：在第一步目的基因查找比对过程中可以利用NCBIgenbank序列以及DNAstar等软件完成目的DNA或者RNA的查找与比对——这在分析测序报告的时候相信很多人操作过，这一步需要注意的就是要保证所分析的序列在一个contig（重叠群，即染色体的一些区域中毗邻DNA片段重叠的情况）内。

第二步：如果其它条件一致，那么这个第二步——引物探针的设计就可以说是定量PCR成败的关键了，通过各方面经验的总结有以下几个基本的原则：总体原则先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。

所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。

建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。

扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。

较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。

保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。

引物探针设计原则引物设计原则●选择合适的靶序列–根据需要选择保守、特异碱基分布均匀的区域；–荧光PCR扩增产物不宜过长；●引物长度：15～30bp●Tm值：一般在55～60℃，上下游尽可能一致●（G+C）含量：一般为40～60％●碱基的随机分布–4种碱基的分布随机–不存在聚嘌呤和聚嘧啶–3’端不应超过3个连续的G或C引物设计原则●引物的特异性：–与非特异序列的同源性不超过70％或有连续8个互补碱基；●引物不存在连续4个碱基以上的互补序列，尤其避免3’末端的互补；●引物之间不应有互补性，避免3’端的互补重叠；●尽量避开扩增片断的引物互补区域存在二级结构；●引物的3’端不能进行任何修饰；●引物的5’端可以根据特殊要求进行修饰：–加入酶切位点、生物素、荧光素、地高辛；●密码子兼并：扩增编码区域，引物的3’端不终止于密码子的第三位，因为密码子的第三位易发生兼并。

Taqman探针设计原则●探针与扩增产物间有完全互补的序列；●序列不易形成二级结构；●Tm值高于引物（10℃）；●探针的5’端第一个碱基不能是鸟嘌呤（G）；●避免同一碱基重复过多，特别是连续4个或更多的G；●检测SNP或突变时，区分位点尽量位于探针中央；●引物尽可能地接近探针；●……NN N N N N N N N N N N N N N N N N NpolymorphismTry to position the polymorphism here (central third)If necessary, put the polymorphism here (region of MGB)DO NOTPLACE HERESNP或基因突变位点在MGB探针中的位置3'RQ TaqMan 探针Exon 1Exon 3Exon 2探针设计技巧●基因表达：探针设计跨过两个外显子标记探针的荧光分子的选择荧光染料最大发射波长(nm)用途FAM~520报告荧光JOE~550报告荧光VIC~550报告荧光TAMRA~580淬灭荧光NED~580报告荧光CY-3~580报告荧光(7500)ROX~610参比荧光Texas Red~610报告荧光(7500)CY-5~670报告荧光(7500)Primer Express v3.0软件谢谢！周煜ZHOU YuApplication Specialistyu.zhou@。

定量PCR 引物、探针设计原则自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。

当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。

一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→目的DNA第二步：保持GC）?典型的引物18到24个核苷长。

引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。

但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。

较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。

Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%引物之间的TM相差避免超过2℃引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。

Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp?引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。

?探针设计原则探针位置尽可能地靠近上游引物探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp)，以保证结合特异性检测探针的DNA折叠和二级结构Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），GC含量在40%－70%探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。

整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。

定量PCR引物探针设计原则1.引物长度：最好控制在18-25个碱基对之间。

过短的引物会导致特异性降低，而过长的引物则会增加杂交的机会，影响PCR的特异性。

2.引物序列：引物应与目标基因序列高度匹配，避免引物与非特异性DNA结合。

引物的GC含量应在40-60%之间，以确保适当的结合力。

3.引物互补性：引物设计时，互补性不应超过3个碱基对。

互补性太高可能会导致杂交产物增多，影响PCR的特异性。

4.引物Tm值：引物的熔解温度（Tm）应在55-65°C之间。

Tm值过高可能导致引物与非特异性DNA杂交，而Tm值过低可能导致引物无法精确结合目标DNA。

5.引物的位置：引物应设计在目标基因的保守区域，避免设计在多态性位点或重复序列区域。

1.引物-探针互补性：引物和探针应该具有很高的互补性，以确保探针与引物结合后能够产生一个稳定的引物-探针结合物。

2.探针设计：探针通常由一个荧光染料和一个QSY抑制剂构成。

荧光染料的选择应是稳定的、不受PCR反应条件的影响的。

QSY抑制剂充当了探针的标记基团，它通过修饰荧光染料对荧光信号进行猝灭。

3.探针-引物适配性：探针和引物之间应该是完全互补的，以确保引物和探针都能够准确结合目标DNA，并且防止任何非特异性杂交的发生。

4.简并位点：在设计探针时应避免引物和探针设计在简并位点上，这样可以确保在PCR过程中特异性扩增。

5.荧光信号强度：探针设计时还应考虑荧光信号的强度。

一般而言，较强的荧光信号会导致更高的检测灵敏度，但较低的信号可能会增加误差。

总而言之，定量PCR引物和探针的设计需要遵循一系列原则，以确保可靠性和准确性。

这些原则包括引物长度、序列、互补性和Tm值的控制，引物的位置选择以及荧光染料和QSY抑制剂的合理选择和设计。

通过遵循这些原则，可以提高定量PCR的特异性和灵敏度，并准确测量样本中的目标基因表达水平。

总体原则•先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。

•所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率，而且还会阻碍酶的扩增。

建议先进行二级结构检测，如果不能避免二级结构，那么就要相应提高退火温度。

•扩增长度应不超过400bp，理想的最好能在100-150bp内，扩增片段越短，有效的扩增反应就越容易获得。

较短的扩增片段也容易保证分析的一致性。

•保持GC含量在20％和80％之间，GC富含区容易产生非特异反应，从而会导致扩增效率的降低，以及出现在荧光染料分析中非特异信号。

•为了保证效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是G（不能有4个连续的G）•将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发卡结构的形成。

引物设计原则•序列选取应在基因的保守区段•避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构•典型的引物18到24个核苷长。

引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。

但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。

较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。

•Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%•引物之间的TM相差避免超过2℃•引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基•为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。

•Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp•引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。

探针设计原则•探针位置尽可能地靠近上游引物•探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp)，以保证结合特异性•检测探针的DNA折叠和二级结构•Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），GC含量在40%－70%•探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。

引物探针设计总结报告引言引物探针设计是分子生物学研究中常用的实验手段，用于检测、分析和定量目标DNA或RNA序列的存在与表达水平。

准确、高效的引物探针设计是实验成功的关键。

在本报告中，我们将总结引物探针设计的基本原则和常用策略，并讨论一些优化方法，以期帮助研究人员在进行引物探针设计时取得更好的实验效果。

基本原则引物探针设计的准确性和可靠性至关重要，以下是一些基本原则可以用来指导引物探针设计的过程。

1. 特异性：引物探针应具有较高的目标序列特异性，以避免与非目标序列杂交，导致假阳性结果。

这可以通过在引物和探针序列中加入一些特异性碱基或序列来实现。

2. 稳定性：引物和探针应具有适当的碱基组成和长度，以提高稳定性。

引物和探针长度通常在15到30个碱基对之间，GC含量约为40%-60%。

3. Tm值：引物和探针的熔解温度（Tm值）应该相似，以确保它们可同时在同一温度下进行PCR反应。

Tm值计算可以使用公式Tm = 2(A+T) + 4(C+G)，其中A、T、C、G分别代表引物或探针序列中相应碱基的个数。

4. 避免互补和二聚体形成：引物和探针之间以及引物自身之间的互补性碱基对和二聚体形成应该尽量避免。

这可以通过使用特殊的软件工具进行分析和预测来实现。

常用策略在引物探针设计过程中，有一些常用的策略可以提高设计的效果。

1. 引物设计：PCR反应中常用的引物设计策略包括：提取目标序列的保守区域进行设计，避免重复序列或多态性位点，避免SNP位点，避免GC-rich或AT-rich 区域等。

引物长度通常在18到30个碱基对之间。

2. 探针设计：探针设计是用于检测靶标物的存在，并进行定量分析。

设计可以基于一种原理如荧光探针、近红外探针、分子信标探针等，或者结合多种原理来设计多功能探针。

切忌设计过长或过短的探针，避免非特异结合和背景信号干扰。

3. 引物探针设计工具：现在有许多在线的引物探针设计工具可以帮助研究人员完成设计。

PCR和定量PCR的引物和探针设计PCR（聚合酶链反应）和定量PCR（实时荧光定量聚合酶链反应）是现代分子生物学中常用的实验技术，用于扩增和检测DNA序列。

在 PCR和定量 PCR 中，引物（primers）和探针（probes）的设计是非常重要的，因为它们直接影响到实验的灵敏度和特异性。

引物是一对短的DNA分子，通常由15-30个核苷酸组成，它们会被限制性酶切割出位于目标序列两端的DNA片段。

引物的设计需遵循以下几个原则：1.引物的碱基组成：引物应具有合适的碱基组成。

GC含量较高的引物有更强的互补性和比特性，但也更容易形成二聚体，影响PCR反应的特异性和效率。

通常引物的GC含量应在40%-60%之间。

2.引物的长度：引物的长度应在18-28个碱基对之间。

引物过短会导致扩增产物的非特异性，引物过长会降低扩增效率。

3. 引物的 Tm 值： Tm 值（熔解温度）是指引物与模板 DNA 结合时解链的温度。

引物的 Tm 值应保持一致，一般在55°C - 65°C 之间。

在设计扩增子（amplifier）时，引物的 Tm 值差异应在1°C 以内，以确保扩增的特异性。

探针是一种特殊的分子，它包含一个与目标序列完全互补的引物序列和一个荧光染料分子。

探针的设计需遵循以下几个原则：1. 荧光染料的选择：选择一个与实验设备所能感测的波长相适应的荧光染料。

常见的荧光染料有荧光素（Fluorescein）、荧光素异硫氰酯（FITC）以及羧基甲基罗damine（ROX）等。

2. Quencher 的选择：设定探针的Quencher。

一般使用的Quencher是BHQ1，或者参考其他文献上的Quencher的讯息。

3.引物和探针的序列：引物和探针的序列应与目标序列完全互补。

引物和探针的设计应尽量避免任意位置出现连续的鸟嘌呤（G）或者鸟嘧啶（C），以避免互结和三聚体的形成。

4.引物和探针的位置：引物和探针的位置非常重要。

精心整理定量PCR引物、探针设计原则自90年代Taqman探针诞生以来，虽然荧光探针（引物）不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，Taqman探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，Taqman探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，Taqman探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求。

当然Taqman定量方法由于还是要合成探针，也给实验操作带来了挑战。

一般Taqman定量PCR实验过程为：目的基因查找比对→探针与引物设计→探针与引物合成→的DNA保持GC典型的引物18到24个核苷长。

引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。

但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。

较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。

Tm值在55－65℃（因为60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%引物之间的TM相差避免超过2℃引物的3’端避免使用碱基A，引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。

Taqman探针技术要求片段长度在50bp－150bp引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过2个的G和C。

探针设计原则探针位置尽可能地靠近上游引物探针长度应在15-45bp（最好是20-30bp)，以保证结合特异性检测探针的DNA折叠和二级结构Tm值在65-70℃，通常比引物TM值高5-10℃（至少要5℃），GC含量在40%－70%探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤——因为5'G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用。

整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量——G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。