实验五 底物浓度

实验10 影响酶活力的因素——正交实验法（碘量法测定酶活力）四个班，每班分16组两个同学一组目的要求：初步掌握正交实验设计法（简称正交法）的使用，运用正交法测定底物浓度、温度和pH这三种因素对酶活力的影响。

实验原理：酶反应受到多种因素的影响，如底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂和抑制剂等都能影响酶的反应速度。

这种多因素的实验可通过正交法即用—特制的表格——正交表来安排试验，计算和分析实验结果。

这样就能通过少量实验取得较好的效果。

实践证明正交法是一个多、好、快、省的方法，目前已广泛用于农业生产和科学实验中。

本实验运用正交法测定酶浓度、温度、PH值这三个因素对酶活性的影响，并求得在什么样的底物浓度、温度和pH值时酶的活性最大。

酶活力用硫代硫酸钠滴定法测定。

过氧化氢酶能把过氧化氢分解成水和氧，其活力大小以一定时间内一定量的酶所分解的过氧化氢量来表示。

被分解的过氧化氢量可用碘量法间接测定。

当酶促反应进行一定时间后，终止反应，然后以钼酸铵做催化剂，使未被分解的过氧化氢与碘化钾反应放出游离碘，再用硫代硫酸钠滴定碘。

其反应为：H2O2+2KI+H2SO4→I2+K2SO4+2H2OI2+Na2S2O4→2NaI+Na2S4O6反应完后，以样品溶液和空白溶液的滴定值之差求出被酶分解的过氧化氢量，即可计算出酶的活力。

实验器材：试管15毫升试管9*16=144支吸管1毫升2*16=32支吸管5毫升2*16=32支吸耳球16个漏斗1个研钵（或者搅碎机）1个（1台）恒温水浴锅3台铁架台16个蝴蝶夹16个酸碱两用滴定管16个100毫升的三角烧瓶3*16=48个烧杯500毫升18个（装好水放到恒温水浴锅里）实验所需药品：1. 0.01 mol/L 的过氧化氢溶液每组消耗50毫升，每班需16ⅹ50=800毫升1.1毫升过氧化氢溶液，用蒸馏水定容至1000毫升。

（用带盖白色试剂瓶分装10瓶。

分装1000毫升即可，其余3000用白色大试剂瓶装好备用）2. 1.8 mol/L 的硫酸溶液（每组消耗50毫升，每班需16ⅹ50=800毫升）共配4000毫升95毫升浓硫酸，用蒸馏水定容至1000毫升。

实验五固体发酵纤维素酶米氏常数Km的测定一、目的了解纤维素酶的种类和测定原理，掌握其活力的测定方法。

二、原理纤维素酶在一定温度和pH条件下，将纤维素底物(滤纸)水解，释放出还原糖。

在碱性、煮沸条件下，3，5一二硝基水杨酸(DNS试剂)与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖(以葡萄糖计)含量成正比。

通过在540 run测其吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的滤纸酶活力。

以此代表纤维素酶的酶活力。

酶活定义以滤纸为底物，在一定反应条件（50℃，pH4.8，恒温1h）下，以水解反应中每小时催化底物水解形成1μmol葡萄糖的酶量为一个单位（U）。

三、试剂和溶液(一) 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。

1 DNS试剂称取3，5一二硝基水杨酸(10士0. 1)g，置于约600 mL水中，逐渐加入氢氧化钠log，在50℃水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200 g、苯酚(重蒸)2g和无水亚硫酸钠5g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至I 000mL，过滤。

贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。

2柠檬酸缓冲液，0. 05 mol/L pH 4.8(适用于酸性纤维素酶)称取一水柠檬酸4.83 g，溶于约750 mL水中，在搅拌情况下，加入柠檬酸三钠7.94g，用水定容至1000 mL。

调节溶液的pH到(4.8士0.05)备用。

注:也可采用pH4.8乙酸缓冲溶液:称取三水乙酸钠8. 16 g，溶于约750 ml，水中，加入乙酸2.31 ml，用水定容至1 000 ml.调节溶液的pH到(4.810.05)备用3葡萄糖标准贮备溶液（4mg/ml）同实验四上述系列浓度应根据需要自行调整。

.5快速定性滤纸(杭州新华一号滤纸)沪15 cm(每批滤纸，使用前用标准酶加以校正)。

(二) 仪器除普通实验室仪器外，还应有:1分光光度计2酸度计精度10.01 pH 3恒温水浴(50士0.l)0C4分析天平感量0.1 mg 5磁力搅拌器6秒表或定时钟7沸7k洛(可用800W申炉和高脚烧杯、楠夸量杯或茸楠奔器切成) 8具塞刻度试管25 mL四、操作步骤4.1绘制标准曲线按表A. l规定的量，分别吸取葡萄糖标准使用溶液(A.2.5)、缓冲溶液(A.2.2或A.2.3)和DNS试剂(A.2.1)于各管中(每管号平行作3个样)，混匀。

酶活性实验探究不同底物浓度对酶反应速率的影响酶是生物体内一类能够催化化学反应的蛋白质，对于许多生物体内的代谢过程起着至关重要的作用。

而酶反应速率是衡量酶活性的重要指标之一。

本实验旨在探究不同底物浓度对酶反应速率的影响。

【实验材料与方法】1. 实验材料：- 酶底物（如蔗糖、淀粉等）- 酶溶液（如淀粉酶、蔗糖酶等）- 盐水（用于配制各种底物的不同浓度）- 试管、滴管和计时器等实验器材2. 实验方法：- 步骤一：准备不同底物浓度的溶液。

根据实验需求，配制一系列不同浓度的底物溶液，可通过加盐水控制浓度。

确保每个浓度组设置重复3次，以保证数据准确性。

- 步骤二：制备反应体系。

在不同的试管中分别加入相同量的酶溶液和不同浓度的底物溶液。

将试管放置在相同的温度和时间下进行酶反应。

- 步骤三：测定反应速率。

使用计时器，记录每个底物浓度下的酶反应起始时间，并观察酶反应的变化。

通常可以通过测定剩余底物浓度的变化来确定酶反应的速率。

- 步骤四：数据处理与分析。

将每个底物浓度下的酶反应速率数据进行整理和分析。

可以绘制曲线图或者柱状图，以直观地表示不同底物浓度对酶反应速率的影响。

【实验结果与讨论】根据实验的数据和分析结果，我们可以得出以下结论：首先，酶活性受到底物浓度的影响。

通常情况下，随着底物浓度的增加，酶反应速率也会相应增加。

然而，当底物浓度过高时，可能出现酶反应达到饱和的情况，即无论底物浓度如何增加，酶反应速率都达到了最大值。

其次，酶反应速率的变化趋势并非线性关系。

在底物浓度较低时，随着底物浓度的增加，酶反应速率快速增加。

但当底物浓度处于一定范围内时，酶反应速率的增加逐渐减缓，并最终趋于稳定。

最后，酶底物浓度和酶反应速率之间存在一定的最佳匹配关系。

当底物浓度接近或等于最佳浓度时，酶反应速率会达到最大值。

超过这个最佳范围，则酶反应速率会逐渐下降。

【实验应用与展望】酶活性实验对于生物学和医学研究具有重要意义。

通过探究不同底物浓度对酶反应速率的影响，可以更好地理解酶的特性及其在生物过程中的作用机制。

实验报告酶的底物浓度与反应速率的实验研究实验报告：酶的底物浓度与反应速率的实验研究摘要：本实验旨在研究酶的底物浓度对于反应速率的影响。

通过进行一系列实验，我们观察和记录了在不同底物浓度下酶催化反应的速率变化。

结果表明，底物浓度与反应速率呈正相关关系，随着底物浓度的增加，反应速率也随之增加。

这一实验结果对于深入理解酶催化反应机制以及优化酶催化反应工艺具有重要意义。

1. 引言酶是一类能够加速生化反应速率的生物催化剂。

在许多生物过程中，酶起着至关重要的作用，而其催化效率和底物浓度之间的关系则成为了科学家们关注的焦点。

本实验将通过调节底物浓度，研究其对酶催化反应速率的影响，以期增进对酶功能与催化机制的理解。

2. 材料与方法2.1 实验材料- 酶溶液- 底物溶液- 缓冲液- 反应容器- 显微镜- 实验记录表格2.2 实验方法2.2.1 实验前准备a) 根据实验要求，准备所需的酶溶液、底物溶液和缓冲液，并确保其纯度和浓度符合要求；b) 清洗好所用的实验容器，以避免杂质对实验结果的影响。

2.2.2 实验步骤a) 在一系列标准反应管中，分别加入不同浓度的底物溶液，保持酶浓度和其他条件不变；b) 将相同体积的酶溶液加入到每个标准反应管中，并迅速混合；c) 将每个反应管放置在恒温环境中，以符合酶催化反应所需的最适温度；d) 按照预定的时间点，取出少量反应液滴在显微镜片上，并在显微镜下观察反应进程；e) 记录实验数据并统计各反应体系的反应速率。

3. 结果与讨论在实验过程中，我们观察到随着底物浓度的增加，反应速率也呈现出增加的趋势。

这与我们的预期结果相符，即酶催化反应的速率与底物浓度呈正相关关系。

相关实验数据表明，随着底物浓度的增加，酶分子与底物之间的碰撞频率增加，从而加速了反应速率的提高。

此外，在一定范围内，反应速率可能随着底物浓度的增加而逐渐饱和，即增加底物浓度对于进一步提高反应速率的作用逐渐减弱。

这可能是由于底物浓度达到一定程度后，酶分子中的活性位点已经全部饱和，并且无法再催化更多的底物分子。

v = Km + [S ]v ：反应初速度（微摩尔浓度变化/min)V ：最大反应速度（微摩尔浓度变化/min)[S]：底物浓度（mol/L)Km：米氏常数（mol/L)此方程表明，当已知Km及V时，酶反应速度与底物浓度之间的定量关系。

3.4 双倒数作图法测定Km值：1 Km 1 1v V [S] V1/v对1/[S]作图可得一条曲线，其斜率为Km/Vmax，截距为1/Vmax 。

若将直线延长与横轴相交，则该交点在数值上等于-1/Vmax。

本实验采用最适pH、最适温度下，测定不同浓度时酶活性。

再根据林贝法作图求出Km值。

3.5 纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3，5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其3mLDNS反应终止→沸水浴5min →定容至25ml→测定OD540吸光值G 作双倒数图求Km4.3 实验注意事项本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结果，应尽量减少实验操作中带来的误差。

底物溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的准确性。

严格控制准确的酶促反应时间。

反应温度准确，酶液准确稀释。

不同pH所用酶液用对应pH缓冲液稀释试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；移液管使用时量取精准，保证结果可靠准确。

精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；由图-1/Km=-7,可得出：Km=0.143 mg/ml(g/L)/(2×104)=0.715×10-5mol/L。

6、分析与讨论：米氏常数（Km）是酶的一个特征性物理量，其大小与酶的性质有关。

Km 值随测定的底物种类、反应的温度、pH 及离子强度而改变。

因此，对某一酶促反应而言，在一定条件下都有特定的Km 值，可用来鉴别酶，例如对于不同来源或相同来源但在不同发育阶段，不同生理状况下催化相同反应的酶是否属于同一种酶[1]。

实验五：血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳（验证性；4学时）【实验目的】1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。

2.熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作过程。

3.了解聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点和应用范围。

【实验原理】1．聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺（Acrylamide简写为Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（N，N¹-methylene-bisacrylamide，简写Bis）在催化剂（过硫酸胺或核黄素）的作用下，聚合成含有酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的两个链通过甲叉桥交联形成就具有三维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶。

为了加速聚合，在合成凝胶时还加入四甲基乙二胺作为加速剂。

聚丙烯酰胺凝胶具有三维网状结构，能起分子筛作用。

用它作电泳支持物，对样品的分离不仅取决于各组分所带电荷的多少，也与分子大小有关。

凝胶网孔的大小主要受成胶物的总浓度及Acr和Bis的比例的影响。

一般电泳采用成胶物质总浓度为7.5%，此浓度称为标准凝胶浓度。

如果改变总胶浓度，也应相应改变Acr和Bis的比例。

2．不连续聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳的原理根据凝胶各部分缓冲液的种类及pH值，孔径大小是否相同等，可分为连续系统和不连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。

连续系统是指电泳槽内缓冲液的pH值与凝胶中的相同，不连续系统则不同。

不连续圆盘电泳一般是在小玻璃管内进行的。

把三种性质不完全一样的聚丙烯酰胺凝胶重叠起来。

上层为样品胶，中间为浓缩胶，这两层胶的凝胶浓度为3%是大孔胶，应用Tris-HCl 缓冲液，其pH6.7。

下层是分离胶，此层凝胶总浓度为7.5%，是小孔胶，也用Tris-HCl缓冲液，pH8.9。

上下电泳槽缓冲液是Tris-甘氨酸缓冲液，pH=8.3。

由于凝胶的孔径和缓冲液的pH值不同，产生浓缩效应、电荷效应和分子筛效应，使电泳的灵敏度、分辨率提高。

（1）浓缩效应：无论哪种电泳方式，要想得到良好的分离效果，电泳开始前必须使样品中各种成分同处于同一起跑线上。

实验一底物浓度对酶促反应的影响实验一：底物浓度对酶促反应的影响一、实验目的本实验旨在探究底物浓度对酶促反应的影响，了解不同底物浓度下酶促反应速率的变化规律，为进一步研究酶的性质和反应机制提供实验依据。

二、实验原理酶促反应是指酶作为催化剂参与的化学反应。

底物浓度对酶促反应具有显著影响，底物浓度的改变会导致酶促反应速率的改变。

本实验将通过改变底物浓度，观察不同浓度下酶促反应速率的差异，并绘制速率与底物浓度的关系曲线。

三、实验步骤1.准备实验材料：0.5 mg/mL的淀粉溶液、0.01 mol/L的磷酸缓冲液、0.01mol/L的NaOH溶液、淀粉酶溶液。

2.设定实验组和对照组：分别设立不同底物浓度的实验组（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL），以及不含底物的对照组。

3.添加淀粉溶液：将不同浓度的淀粉溶液分别加入各试管中，并记录各试管中淀粉溶液的体积。

4.添加淀粉酶溶液：将等体积的淀粉酶溶液分别加入各试管中，使酶与底物充分接触。

5.计时：从加入淀粉酶溶液的时刻开始计时，记录各试管中反应所需时间。

6.测量实验数据：记录各试管中溶液的颜色变化和浑浊程度，根据颜色变化和浑浊程度判断反应的速率。

7.数据整理：整理实验数据，绘制速率与底物浓度的关系曲线。

四、实验结果与数据分析1.实验结果：通过计时观察和颜色变化判断，不同底物浓度下酶促反应速率存在明显差异。

随着底物浓度的增加，反应速率逐渐加快。

当底物浓度达到一定值时，反应速率达到最大值，继续增加底物浓度，反应速率不再增加。

2.数据分析：根据实验数据，可以得出以下结论：（1）底物浓度对酶促反应速率具有显著影响。

随着底物浓度的增加，反应速率逐渐加快。

（2）当底物浓度达到一定值时，酶促反应速率达到最大值。

继续增加底物浓度，反应速率不再增加，甚至可能降低。

这是因为过高的底物浓度可能抑制酶的活性，导致反应速率降低。

（3）在底物浓度较低时，酶促反应速率与底物浓度呈线性关系。

底物浓度及抑制剂对酶促反应速度的影响一、实验目的：1、学习和掌握Km的测定原理和实验方法。

2、掌握竞争性抑制剂对酶活性的影响及竞争性抑制剂表观Km’的测定。

二、实验原理：1.酶的底物浓度和酶促反应速度的关系一般情况下符合米-曼氏方程：式中：v为反应初速度；Vmax为最大反应速度；[S]为底物浓度；Km为米氏常数，其单位为mmol/L。

Km值是酶的特征性常数，一般来说，Km可以近似地表示酶与底物的亲和力。

测定Km值是酶学研究中的一个重要方法。

Lineweaver-Burk作图法（双倒数作图法，图1）是用实验方法测定Km值的最常用的比较简单的方法。

Lineweaver-Burk将米氏方程改写成双倒数形式：1/ v = Km/ Vmax×1/[S] + 1/ Vmax以1/v－1/[S]作图得一个斜率为Km/ Vmax的直线，将直线外推与横轴相交，其横轴截距为-1/Km ,纵轴截距为1/Vmax ，因此实验时，选择不同的[S]，测定相应的v，依L－B双倒数方程作图，即可求得Km 和Vmax；在抑制剂存在时，即可求得表观Km 和 Vmax，竞争性抑制的动力学特点见图2。

2.本实验以碱性磷酸酶（AKP）为例，磷酸苯二钠为底物，磷酸氢二钠为其竞争性抑制剂，茶碱为其非竞争性抑制剂。

AKP催化磷酸苯二钠水解产生游离酚和磷酸盐。

酚与酚试剂应用液在碱性溶液中生成蓝色的衍生物。

根据蓝色的深浅可测出酚的含量，从而算出相应的酶促反应速度(v)。

再根据Lineweaver—Burk法作图，计算其Km 值及抑制剂存在时表观Km值的改变。

三、实验步骤：1.米氏常数测定按下表操作：2.抑制剂对酶促反应速度的影响按下表操作：3.计算以1/A660－1/[S]作图，求出Km及表观Km。

四、结果与分析：实验数据处理表格：1.米氏常数Km测定管号0 1 2 3 4 5[S](mmol/L) 2 2 3 4 6 8A6600.206 0.318 0.412 0.496 0.5532.抑制剂存在时表观Km测定管号0 1 2 3 4 5[S](mmol/L) 2 2 3 4 6 8A6600.170 0.185 0.275 0.376 0.389作图：计算：1.Km计算：由直线方程y=7.0999x+0.9662知，当y=0时，x=-0.1361，即-1/Km=-0.1361，所以Km=7.35mmol/L，纵截距为0.96622.表观Km计算：由直线方程y=10.895x+0.9662知，当y=0时，x=-0.08868，即-1/Km=-0.08868，所以Km=11.28mmol/L，纵截距为0.9662表观Km>Km,，且纵截距相等，所以抑制剂是竞争性抑制剂。

一、实验目的1. 探究影响酶活性的因素；2. 分析不同因素对酶活性变化的影响规律；3. 了解酶活性的调控方法。

二、实验原理酶是一种生物催化剂，具有高效、专一和可调节的特点。

酶活性受多种因素的影响，如温度、pH值、底物浓度、酶浓度、抑制剂和激活剂等。

本实验通过观察和分析不同因素对酶活性的影响，揭示酶活性的调控规律。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：淀粉酶、可溶性淀粉、碘液、斐林试剂、硫酸铜、氢氧化钠、盐酸、蒸馏水等；2. 仪器：恒温水浴锅、试管、移液器、滴定管、pH计、比色计等。

四、实验方法与步骤1. 实验一：探究温度对酶活性的影响（1）将淀粉酶溶液分别置于不同温度的水浴锅中，如0℃、25℃、37℃、50℃、65℃等；（2）将等量的可溶性淀粉溶液分别加入上述水浴锅中的淀粉酶溶液，混合均匀；（3）记录混合溶液的颜色变化，观察淀粉酶对淀粉的水解效果；（4）重复上述步骤，分析不同温度对酶活性的影响。

2. 实验二：探究pH值对酶活性的影响（1）将淀粉酶溶液分别置于不同pH值的缓冲溶液中，如pH 3.0、5.0、7.0、9.0、11.0等；（2）将等量的可溶性淀粉溶液分别加入上述缓冲溶液中的淀粉酶溶液，混合均匀；（3）记录混合溶液的颜色变化，观察淀粉酶对淀粉的水解效果；（4）重复上述步骤，分析不同pH值对酶活性的影响。

3. 实验三：探究底物浓度对酶活性的影响（1）将淀粉酶溶液分别置于等量的可溶性淀粉溶液中，浓度分别为0.1g/mL、0.2g/mL、0.4g/mL、0.6g/mL、0.8g/mL等；（2）记录混合溶液的颜色变化，观察淀粉酶对淀粉的水解效果；（3）重复上述步骤，分析不同底物浓度对酶活性的影响。

4. 实验四：探究酶浓度对酶活性的影响（1）将不同浓度的淀粉酶溶液分别置于等量的可溶性淀粉溶液中；（2）记录混合溶液的颜色变化，观察淀粉酶对淀粉的水解效果；（3）重复上述步骤，分析不同酶浓度对酶活性的影响。