冰冻切片制作及质量控制共38页文档

冰冻切片的要求
冰冻切片的要求主要包括以下几个方面：
1. 温度控制：冰冻切片的温度控制十分重要，需要将温度设置在适当的范围，一般为-20℃至-30℃。

温度过高或过低都会影响切片的品质。

2. 刀具选择：切片刀需要锋利，以一次性刀片为佳，一般一个刀口切5-6个组织后即应更换，以免影响切片的平整度和光滑度。

3. 切片厚度：冰冻切片的厚度一般需要控制在2-3mm，过厚或过薄都会影响病理医生的诊断结果。

4. 切片技巧：切片时用力要均匀，避免转速不稳，防止组织产生卷曲或皱褶。

切片后应及时观察切片的质量，如有问题应及时调整。

5. 组织处理：进行冰冻切片前，需要对组织进行处理，如清洗、固定等。

处理后的组织应平整、无气泡、无杂质，以保证切片的准确性和可靠性。

6. 注意事项：在进行冰冻切片时，需要注意防止组织过硬或过软，避免损坏刀刃或影响切片质量。

如发现组织变脆，可将冷冻的组织取出，于室温中停留片刻，再行切片。

此外，切片时还需注意防卷板的位置和角度，以保证切片的平整度。

总之，冰冻切片是一项技术性较强的工作，需要严格控制温度、选择适当的刀具、掌握正确的切片技巧和注意事项，才能获得高质量的切片，为病理诊断提供可靠的依据。

冰冻切片的制作方法一、概述所谓冰冻法（Freezing method），就是先将组织块进行冰冻，水分成为包埋介质，组织块在一定温度和时间内变硬，然后使用切片机进行薄片切割的一种方法。

(一) 冰冻切片法分类一般冰冻切片机：用Co2气、液氮等，通过制冷的气体或液体冰冻组织块与切片刀，因受周围环境的影响，夏季不易操作。

半导体制冷切片机，通过半导体材料的制冷原理，使组织块和刀冷冻，并需要循环水降除半导体材料的高热，夏季不易操作。

恒冷箱式切片机，不受外界温度的影响，不需要循环水，四季都能切成非薄的切片，操作方便用时间短，用途广泛是目前最为理想的切片机。

（二）恒冷箱式切片机及切片法机器构造：（1）制冷室：有轮转式切片机，切片机的手轮在室的右外侧壁；组织托台放组织托用；速冰冷锤，是铸铁圆块，能迅速吸取组织中热量，起速冻作用。

（2）开关：电源开关；温度设定调节键；时钟键；除霜时间设定键；半导体速冻键；（按此健在十分钟里提高温度-4摄氏度）。

（3）切片机调节系统：有快慢进或退键，修整组织块时可快或慢进退机头。

组织接近刀刃时要慢进键，并不停的旋转手轮，组织修平后，松开进机头键开始切片。

恒冷箱式切片机最大的优点不受外界温度变化的影响，操作很方便，5¡ª10分钟内可切出满意的薄片，是外科病理快速诊断；酶化学的新鲜组织切片；组织化学脂质染色；免疫组化，特别是免疫荧光等技术开展必备的仪器。

（三）冷冻切片需要温度及时间在零下15——20摄氏度之间，大部分组织均能切出良好的切片。

各器官组织切片的最适温度及时间见下表：各器官组织冷冻切片的最适温度及时间表组织温度时间新鲜固定后皮肤及脂肪-26摄氏度-28摄氏度3~5min 5~8min胃肠、食管、膀胱-18摄氏度-20摄氏度3~5min 5~6min子宫、卵巢-20摄氏度-22摄氏度3~4min 4~5min腮腺、肌肉-17摄氏度-19摄氏度3~4min 4~5min脾、淋巴结、甲状腺-16摄氏度-18摄氏度2~3min 4~5min脑组织-15摄氏度-17摄氏度2~3min 4~5min注：表中温度及时间指组织厚度0.3-0.4 cm（四）冷冻温度及时间的关系制冷温度数越大对组织冰硬的时间越短，但往往是欲速越不达，组织冻过切片呈碎屑状，得不到完整切片；并出现冰晶，改变组织应有的形态，细胞呈现脂肪样细胞状态，特别是脑组织肾透明细胞癌组织最明显。

实验技术：组织切片的制备点击次数：350 发布日期：2009-11-9 来源：长沙赢润仅供参考，谢绝转载，否则责任自负组织切片的制备二）切片方法-细节注意1 切片方法的选择光镜和免疫组化研究的切片一般为5μm，而神经组织切片为20-100μm，有利于追踪神经纤维的走行。

1.1 冰冻切片是免疫组织化学中最常用的一种切片方法，能够最大量的保存抗原、操作简便，主要适用于不稳定的抗原（如检测细胞膜的某些抗原成分），但标本来源受限。

冰冻切片时,组织中水分易形成冰晶,影响抗原定位。

冰晶小而多，对组织结构损害大。

因此可采用以下措施减少冰晶的形成：①速冻，缩短组织从-33～-43℃的时间。

具体方法是：⑴干冰-丙酮（乙醇）法：将150-200ml丙酮（乙醇）装入小保温杯内，逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干冰不冒气泡时，温度可达-70℃。

用一小烧杯（50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧杯缓慢置入干冰丙酮（乙醇）饱和液内，至异戊烷温度达-70℃时即可使用。

将组织（约1cm×0.8cm×0.5cm）t投入异戊烷内速冻30-60s后取出，置-80℃低温保存或置恒冷冰箱内以备切片；⑵液氮法：将组织块平放于软塑料瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾。

此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。

取出组织块后立即置入-80℃冰箱贮存或作恒冷切片。

②将组织置于20%-30%蔗糖溶液中1-3天，利用高渗吸收组织中水分，减少组织含水量。

冰冻切片一般用恒冷切片机。

切片后如不染色，必须将切片吹干，贮存于低温冰箱内，进行短暂预固定干燥后贮存于低温。

【目的】组织标本必须首先被制成组织切片，再经过染色处理，然后才能在显微镜下进行临床诊断和科学研究。

【原理】苏木素染色结合伊红染色是常规组织学染色技术，也称为H & E染色。

冰冻切片制片实验步骤及注意事项冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。

因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。

冰冻切片制片实验步骤1、组织固定：新鲜组织固定于4%多聚甲醛24h以上。

将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整。

2、脱水：将修切好的组织放于15%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底后转入30%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底。

3、OCT包埋：将脱好水的组织取出用滤纸将表面水稍吸干后切面朝上放于包埋台上，组织周围滴上OCT包埋剂，将包埋台放在冰冻切片机的速冻台上速冻包埋，OCT变白变硬后即可进行切片。

4、切片：将包埋台固定于切片机上，先粗切将组织面修切平整后即可开始切片，切片厚°8-10μm。

将干净的载玻片平放于切出的组织片上方即可将组织贴于载玻片上。

-20°保存备用。

注意事项1、组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的骤冷剂有：① CO2气（-78℃）② 丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（-80℃）③ 液氮（-190℃）④ 液氮冷却的丙烷（-19℃）。

液氮适用于组织化学，较安全。

缺点：组织块易发生龟裂。

2、为防止水解酶和其他物质的移位、弥散，常用4℃、24小时的甲醛固定能很好地保存酶类。

但对许多脱氢酶和转移酶能灭活。

故不宜使用，低温，冷甲醛短时间固定（10分钟左右）固定，可显示琥珀酸脱氢酶。

3、电镜出现后，需要保存细胞的超微结构，以4%缓冲戊二醛（25%戊二醛16ml；0.1M二甲胂酸（pH7.）84ml；蔗糖8g）固定较好。

这些固定液主要用于水解酶，而不适于许多氧化还原酶和转移酶。

高于20Λg mL甚至30Λg mL仍无任何不良发应,另一些人血药浓度低于10Λg mL就有良好的治疗效果,这是由于许多因素影响患者对氨茶碱的敏感性,它与患者对药物的反应性、敏感性、病理生理状态、年龄、吸烟、饮食、药物相互作用、遗传等因素有关,即治疗范围本身也存在个体差异,所以氨茶碱疗效的判断、剂量的调节等应将血药浓度与临床效果结合起来才客观科学。

参考文献:[1]　梁德荣.紫外分光光度法测定血浆氨茶碱浓度的改进[J].华西医大学报,1987,18(3):2562258.[2]　徐叔云.临床药理学[M].第1版.北京:人民卫生出版社,1989:54261.[3]　吴莱文.治疗药物监测[M].北京:人民卫生出版社,1989:295.[4]　李　.实用临床药物动力学[M].成都:四川大学出版社,1997:1572172.[5]　刘晓明.影响氨茶碱血药浓度的因素[J].中国医院药学杂志,1997,17(11):516.[6]　彭天吉.培氟沙星和氧氟沙星对氨茶碱药动学的影响[J].药学进展,1999,23(2):109.(收稿日期:2004202218)制作临床快速冰冻切片的质量控制袁永辉,张韵风(华中科技大学同济医学院基础医学院,湖北武汉430030)[摘　要]目的:探讨冰冻切片的制作、H E染色和免疫组化的标准化实验方法,达到质量控制标准。

方法:详细介绍了冷冻切片的方法、影响因素、标准化与质量控制及其在临床快速病理诊断的H E和免疫组织化学染色方法。

结果:经此方法制备的冷冻切片组织结构完整、细胞染色清晰、境界清楚、核质分明、对比度好,无刀痕、皱折、重叠、冰晶、切片平整、厚薄均匀一致等。

结论:可为临床快速病理诊断的H E染色、脂肪黏液染色、酶组织化学、免疫组织化学、免疫荧光、核酸原位杂交以及原位PCR等病理诊断与研究提供优质冷冻切片。

[关键词]冰冻切片;H E染色;免疫组化;质量控制[中图分类号]R446.8　[文献标识码]A　[文章编号]1671-5098(2004)06A-0846-02The Qua l ity Con trol of M ak i ng Frozen Section s i n Cl i n ic Pa thology D i agnosisYUAN Yong2hu i,ZHAN G Yun2feng(T ongj i M ed ical Colleg e,H uaz hong U niversity of S cience and T echnology,W uhan,H ubei430030,Ch ina)Abstract:O b je c tive To exp lo re a standard experi m ental m ethod fo r m ak ing frozen secti ons and staining of hem atoxylin eo sin(H&E)and i m m unoh istochem istry,the secti ons w ere to m eet the quality contro l dem and in clinic patho logy tests.M ethods T h is article described a series of secti oning,affective facto rs,standardizati on and quality contro l in m ak ing frozen slices and its staining m ethods of H&E and i m m unoh istochem istry in clinic patho logy diagno sis.Re sults T he frozen secti ons by th is m ethod revealed m arkedly characteristic contrast,mo re detail and clear structure of tissues and cells,w ithout the blade trace,fo ld,ice crystals and the phenom enon of th ickness and th inness,and w ere suitable fo r m icropho tography.Conclusion T h is m ethod can p rovide frozen secti ons superi o r in quality fo r clinic patho logy diagno sis and research in stains of H&E,fat,m ucus,enzym e h istochem istry,i m m unoh istochem istry,i m m unofluo rescence,in situ hybridizati on and in situ PCR as w ell.Key W ords:F rozen secti on;H&E stain;I mm unoh istochem istry;Q uality contro lΞ 冷冻切片是病理科室最常用的快速制片方法之一,它是借助低温使组织达到一定的硬度进行切片的一种方法。

一、实验前准备清理实验台及仪器。

开启冷冻切片机并将冷冻切片机预降至所需温度（- 15~-20 ℃*）。

准备好处理好的载玻片、刀片、胶水以及药品。

二、取材解剖之后迅速取出所需的新鲜组织，用干纱布或滤纸擦干后不需固定直接取材（24×24×2mm*）,以防形成冰晶造成切片中形成形状不一的空泡,使细胞内结构移位。

（注：取材中目的标本既要明确也要确保其结构的完整性，应避免不必要的脂肪及坏死组织附着;要尽量剔除毛发、硬骨或钙化物;保乳手术切缘由于脂肪组织较多,取材厚度最好不要超过3mm，厚者冰冻费时，大者难以切完整。

甲状腺及淋巴结组织要带全组织被膜并除去多余的脂肪组织。

）三、冷冻切片1、取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上冰冻，用吸热器压住组织，至包埋剂与组织冻结成白色冰体即可切片（1~3分种）。

2、将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。

3、调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10μm间。

4、调好防卷板。

制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。

切片时，以切出完整、平滑的切片为准。

切好的组织在干净的玻片上黏附时顺着一个方向稍微用力轻轻一带,可避免组织摊片过程中皱折,保证组织结构的完整及切片的美观。

注：①包埋剂的选用：包埋剂是对冷冻切片质量一重要影响因素，包埋剂用量要适宜，过多或过少都会影响标本冷冻质量。

常用的有三种包埋剂OCT剂、B超藕合剂以及普通胶水。

B超藕合剂适用于细胞丰富质地较嫩的组织,普通胶水或OCT剂适用于纤维丰富质地偏硬组织。

（OCT包埋剂骤冷时固化，其冷冻速度和软硬韧度与组织相近，其还具有水溶性，不影响染色等优点。

）②组织块过小：先将少量胶挤在托架上预先放在冰冻机中冷冻,约30秒钟左右待胶凝固时将小组织放上,组织周围再加一些胶,再次置于冷冻机中冷冻,这样组织被垫高,就能快速切出高质量的切片。

冰冻切片制作及质量控制冰冻切片是一种在生物组织学研究中广泛应用的技术，它可以制备出细胞和组织的高质量切片，用于后续的染色、免疫组化和显微镜观察等研究。

为了获得高质量的冰冻切片，制作过程中需要严格控制各个环节，包括样本取材、固定、冻结和切片等步骤。

同时，质量控制也是制作高质量冰冻切片的重要环节之一、下面将详细介绍冰冻切片制作及质量控制的相关内容。

1.样本取材样本取材是制作高质量冰冻切片的第一步，样本的选择和处理对后续切片的质量有重要影响。

通常情况下，应选择代表性的组织，样本必须新鲜，不宜暴露在空气中过长时间，以避免氧化和细胞坏死的发生。

此外，为了使切片更容易涂抹和切割，样本应具有一定的硬度，可以根据需要使用组织固定剂、切片缓冲液等进行处理。

2.组织固定组织固定是为了保持组织的形态结构和细胞的生物学特性，同时防止样本在切片过程中的损伤和变形。

常用的固定方法包括冷醇固定、中性缓冲福尔马林固定等。

固定时间和温度的选择需要根据不同的样本和研究要求进行优化。

3.冻结冻结是制作冰冻切片的关键步骤，它能够快速、有效地固定组织并保持组织的形态。

冻结样本时应使用冷冻剂，如液氮、干冰-酒精混合物等。

在冻结过程中，要避免组织在冻结过程中受到机械或化学损伤，因此可以使用特制的冷冻模具和刀片。

4.切片5.质量控制质量控制是确保冰冻切片质量的关键环节之一、常用的质量控制指标有切片厚度、切片完整性、目标细胞或结构的保存等。

切片厚度的一致性对于后续的显微镜观察和数据分析具有重要影响，可以使用显微镜或数字软件测量切片厚度。

切片完整性是指组织切片的连续性和无碎片断裂等情况，可以通过显微镜观察和染色评估。

目标细胞或结构的保存是评价冰冻切片质量的重要指标，可以通过免疫组化染色、细胞核染色等方法进行评估。

综上所述，制作高质量的冰冻切片需要控制好样本取材、组织固定、冻结和切片等环节，并通过质量控制手段来评估切片质量。

只有在每个环节都进行精细操作和严格控制的情况下，才能制备出适合后续研究的高质量冰冻切片。

冰冻切片制作方法与注意事项一、固定：固定即借助化学试剂是组织和细胞中的有机和无机成分凝固或沉淀，停止发生死后组织变化，尽量保持其活体状态的过程。

固定的方法有浸泡固定法，注射、灌注固定法，蒸汽固定法，本实验用的是注射、关注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难流入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定，就可采用灌注或灌流固定法。

固定时将固定液直接注入动物的血管，经血管分支到达整个组织或全身，从二十只得到充分固定。

固定液分为单纯固定液和混合固定液。

单纯固定液有甲醛、乙醇、氯化汞、醋酸、苦味酸等，混合固定液包括Bouin液、Zenker液、Carnoy液、中性甲醛液等。

本实验用的固定液为4%甲醛（10%福尔马林）。

固定后的处理：用水配制的固定液固定后应用流水冲洗，可是组织中的固定液随时溢出和随时洗去。

对小动物和脑组织等，应以浸泡为主，即能达到冲洗的目的，又不损害组织。

【注意事项】1.固定要及时。

2.组织块的大小要合适。

3.应有足够的固定液，一般与组织块的比例为20:1，容器勿过小，组织勿过多。

4.固定时间要合适，甲醛固定液一般固定两天左右，第一天要更换一次固定液。

5.要进行促使固定，在固定期间轻轻地搅动组织或摇动容器使组织移动有利于固定液的渗透，适当提高温度也可缩短固定时间。

6.选择合适的固定液。

7.一次取材数量过多时，应对取材部位和顺序进行编号，并及时做好记录。

二、脱水脱水就是用某些溶剂逐步将组织块内的水分置换出来的过程，使用的试剂称为脱水剂。

脱水剂有非石蜡溶剂的脱水剂如乙醇、丙酮等，和脱水兼石蜡的脱水剂如正丁醇等。

本实验所用的是乙醇脱水。

乙醇是最常用的脱水剂，其优点是脱水能力强，即能与水相混合，又能与透明剂相混，并可使组织硬化，便于切片。

缺点是穿透组织的速度快，且容易使组织收缩、变脆。

为克服这一缺点，在一般脱水中，应采用循序渐进的方法，逐步升级，经一系列不同浓度的乙醇，使组织中的水分逐渐被乙醇代替。

冷冻切片方法及注意事项冷冻切片是一种常用的组织学研究方法，它能够帮助研究人员观察和分析生物组织的结构和功能。

下面将详细介绍冷冻切片的方法及注意事项。

1.组织采集：首先需要选择适当的生物组织样本，可通过手术切取、尸检或动物献体等方式获得。

2.组织处理：取出组织样本后，应立即进行处理，以防止样本脱水和坏死。

可将组织放入理化盐水或生理盐水中，避免干燥、坍塌或变形。

3.固定组织：使用适当的固定剂对组织进行固定，以保持组织结构的完整性。

常用的固定剂有福尔马林、戊二醛、乙醛等。

固定时间应根据组织大小和厚度进行调节，较小的组织可以固定2-4小时，而较大的组织可能需要24小时以上。

4.预冷冻：固定后的组织应在冷冻前进行预冷冻处理，以提高冷冻切片的质量。

预冷冻的方法包括放入冷冻剂中（如液氮、干冰等）或将其放入冰盒中进行冷藏，使组织完全冷却。

5.冷冻切片：使用冷冻切片机将预冷冻的组织切成薄片。

为了获得更好的切片结果，刀片的角度和厚度需要进行适当的调整。

同时，切制时需要快速而轻柔地移动切片机，以防止组织被拉伸或损坏。

6.切片收集：将切片收集在玻片上，通常使用细长形的切片夹或切片板来收集切片。

确保切片不受损并保持平整。

7.切片保存：将切片放入适当的保存溶液中，如PBS（磷酸盐缓冲液）或甘油等，以防止切片干燥和变形。

可以根据需要选择冷藏或冷冻保存。

冷冻切片需要注意以下事项：1.样本质量：选择新鲜、完整的组织样本，避免坏死、变性或损伤的组织。

2.固定剂选择：选择适当的固定剂进行组织固定，以保持组织结构的完整性。

3.冷冻速度：组织应尽快冷却，以避免组织脱水或破坏。

冷冻速度过慢可能会导致晶体形成，影响切片质量。

4.切片机状态：保持切片机的良好状态，定期检查刀片的锋利度和调整角度，以确保切片的质量。

5.切片技巧：需要轻柔、均匀地切片，避免组织被拉伸或扭曲。

同时，切片过程中需要快速操作，以减少冰晶对组织的破坏。

6.切片收集：收集切片时要避免切片叠加或悬浮，以免影响切片的观察和分析。

冰冻切片的步骤及注意事项嘿，友友们！今天咱来唠唠这冰冻切片的那些事儿，可别小看它哟，这里头的步骤和注意事项那可不少呢！
先说这第一步，取材那可是相当关键呐！就好比你要做一道超级美味的菜，原料得新鲜吧！取材的时候就得眼疾手快，别磨蹭，不然那材料都不新鲜啦！而且取的位置也得准，不然切出来的片子可就不地道喽。

然后就是速冻啦，这就像是给材料来个急速冰镇。

嘿，可别慢悠悠的，得赶紧把它冻得邦邦硬，不然切片的时候可就不好玩啦。

想象一下你切个软不拉几的玩意儿，那能成啥样！
接着就是切片啦，这可是个技术活。

就跟咱削苹果似的，你得手法稳，不然切出来那一片片厚的厚，薄的薄，那可不行！我跟你说，这时候就得开启“大师模式”，每一刀都得恰到好处，别整那些歪七扭八的片子出来。

哎呀，这过程中可得注意好多事儿呢。

比如说温度得控制好，太高了不行，太低了也不行。

温度不对，那切出来的片子不是皱皱巴巴就是碎成渣，这可不是咱想要的结果嘛。

还有呢，切片机也得爱护好，就跟咱的宝贝似的，不然它捣乱起来，你可就有的愁喽。

有时候啊，这冰冻切片就跟一场战斗似的，你得和各种因素斗智斗勇。

一不小心哪里出点差错，那片子可不就给你颜色看啦！但咱也不能怕呀，就得勇敢面对，慢慢摸索，找到最佳的方法。

我还记得刚开始接触冰冻切片的时候，那真叫一个手忙脚乱啊。

不是这儿出问题就是那儿不行，简直让我哭笑不得。

不过呢，随着经验的积累，现在咱也能轻松应对啦。

总之呢，冰冻切片虽然有些麻烦，但只要咱掌握了步骤和注意事项，加上那么一点点的耐心和细心，就一定能把它搞定！友友们，加油干吧，让我们在冰冻切片的世界里闯出一片天！。

冰冻切片组织的制备:固定将组织置于4%多聚甲醛固定液中，4℃摇床过夜。

漂洗将固定后的标本用1X PBS漂洗三次，每次15分钟。

脱水将组织置于30%蔗糖溶液中，4℃摇床过夜。

第二天观察是否脱水完全，判断的标准是，当管竖直时，组织是否沉到蔗糖溶液的底部，若组织已完全沉降到蔗糖溶液的底部，平放或震荡后仍能沉降，则可判断组织已脱水完全。

包埋将组织倒入培养皿中，用眼科刀将脑和脊髓根据切片切面的需要在不同的部位切开，并做好头尾端的标记。

之后将组织置于包埋盒中，用滤纸吸干组织周围多余的蔗糖溶液，滴加OCT（optimal cutting temperature compound）到包埋盒中，用移液枪头小心的将组织周围的O.C.T混匀，切忌起气泡，静止10分钟，以防切片时脱片。

重新取一个包埋盒，将组织移入到包埋盒中，倒入OCT，再次用移液枪头将组织与O.C.T混匀，将组织按切片需要方向摆放于包埋盒的底部，迅速置于干冰与酒精的混合物中。

在包埋盒上做好标记，用保鲜膜和锡纸包好后放入-80℃冰箱贮藏待切。

切片：切片前先将切片机的箱体温度及刀头温度均设为-20℃，把包埋盒从-80℃冰箱取出置于切片机中平衡半小时左右。

之后将包埋块用O.C.T固定在样品托上，然后将样品托固定在样品头上，调整合适的位置，以使样品与刀头处于平行位置。

手动切片。

用细毛笔将切片均匀整齐地平铺在明胶包被的载玻片上，室温下晾片30min-1h后进行免疫组化染色。

冰冻切片的快速染色法冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分钟后即可染色。

以往，为了防止切片脱落，当切片附贴于载玻片后，即用电吹风吹干后再固定。

根据实验对比认为这种做法欠妥未经固定的切片，强热作用后，蛋白发生变性，核内含有的物质由于热的作用融合在一起，染色后镜下分辨不出核内的各种物质。

冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，这样可以使切片中细胞内各种物质都在没有任何变化的情况下被固定起来，核染色质清晰，核仁明显，其他物质都完好保存。