冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理

冷冻切片常见问题与解决方法叶敏;刘尽国;赵兰香;张杰【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2013(029)009【总页数】2页(P1030-1031)【关键词】冷冻切片;取材;包埋;发白;染色【作者】叶敏;刘尽国;赵兰香;张杰【作者单位】上海市胸科医院病理科,200030;上海市胸科医院病理科,200030;上海市胸科医院病理科,200030;上海市胸科医院病理科,200030【正文语种】中文【中图分类】R361.2术中冷冻切片是目前临床病理检查中最常用的快速制片方法之一。

其是在低温下将新鲜组织冷冻至一定硬度，然后再进行切片的制片方法。

由于低温时组织细胞会损伤、组织细胞着色力差及短时间内快速出片等因素的影响，制片过程中常会出现空洞和冰晶、组织细胞变形和皱缩、切片染色背景不清晰、颜色对比不协调、发白等问题。

现将上述问题及处理方法讨论如下。

1 常见问题与解决方法［1］1.1 冷冻切片出现空洞和冰晶现象(图1) (1)原因:组织内有过多水分，脱水不过关、取材时遇到水，冷冻时间过长，组织冷冻的温度过低。

(2)对策:①取材大小、厚薄要适宜，过大、过厚影响冷冻速度。

②新鲜组织应避免遇水，取材器械干燥洁净，若组织本身带水或血较多，用滤纸把水或血吸干。

取材后需用合成胶水或OCT 作组织块包埋剂，进行包埋。

合成胶水和OCT 均具有黏稠性和渗透性，能将组织牢固地固定在冷冻头上。

③冷冻时间要短，只有速冻才能减少组织内冰晶的形成，最好将速冻头压在组织上，冻好后便可切片，对容易形成冰晶的肌肉、脑组织应采取干冰或液态氮冷冻，以减少冰晶形成。

④以冷冻切片机设置的温度(冷冻头OT 为－25 ℃，CT 为－20 ℃)为宜。

温度太低，组织容易变脆、变硬，切片易出现空洞现象。

1.2 组织破碎或形成空洞现象(图2) (1)原因:组织冷冻时间过长;组织比较硬、脆。

(2)对策:可用手贴在组织上或用嘴向组织哈气稍加温使其软化即可切出完整的切片。

冷冻切片常见问题分析与预防骆新兰收稿日期:1998 03 30作者单位:广东省人民医院病理科,广州 510080作者简介:骆新兰,男,30岁,技师冷冻切片是借助低温使组织冻结达到一定的硬度进行切片的一种方法。

它是术中诊断的一种重要方法。

但由于各种原因,影响冷冻切片的质量,拖延病理报告发出的时间,直接影响着病理诊断的及时性、准确性,间接影响着病人的预后。

归结起来有以下几方面。

1 切片不全或不能切片切片不全是指切出的切片组织切面不完整、有缺损现象;不能切片是指组织块的温度过高或过低不能制作一张完整的切片。

切片不全直接影响着冷冻报告切片的准确性。

导致切片不全或不能切片的常见的原因有几下几方面。

1 1 组织内含过多的脂肪或坏死组织 脂肪或坏死组织较一般的组织冷冻的温度要低些,当活组织达到所需的温度时,其还比较软,从而影响切片的完整性和拖延冷冻报告发出的时间。

1 2 组织块过冷 组织冷冻过度易致切片破碎或呈粉沫状,不能制作一张完整的切片。

1 3 组织块冷冻不均匀 在配合使用液氮时,组织块放入液氮时不能保持水平状态且液氮量不足的情况下,可产生此现象。

1 4 冻头的温度不足 冷冻切片时要求冻头的温度保持在-25 ~-30 左右,冻头的温度达不到要求时,组织很快回软,也不能保证切片的完整。

1 5 组织块过大 预防与处理: 注意组织的性质。

冷冻切片的组织除了要保持新鲜外,还应注意避免组织内含过多的脂肪(脂肪组织除外)及坏死组织。

!组织大小要适中。

冷冻切片机内切片刀移动的范围有一定的限制,超出其范围时,易致切片不全。

一般情况下,冷冻切片的组织块大小1cm ∀1cm ∀0 3cm,但卵巢肿瘤及脂肪组织可稍为大些。

另外,包埋时,应将组织平放在冻头的中央。

#掌握好冷冻时间。

根据组织块的大小、性质,确定冷冻时间,一般13~17s(使用液氮者),若组织较大或脂肪组织时间可适当长些,而甲状腺、脑组织和淋巴结等冷冻的时间相对要短些。

术中冷冻切片的规范化操作及常见问题分析摘要】目的：优化冰冻切片技术，提高术中病理诊断的准确率。

方法：收集2014～2015年期间本院病理科冰冻切片2000余例，重新阅片，分析讨论发现的问题及原因。

结果：不规范的冰冻切片操作严重影响冰冻切片。

结论：规范化操作可以提高病理诊断的科学性、可靠性。

【关键词】冰冻切片；规范化操作；病理诊断【中图分类号】R636 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）06-0205-02术中冷冻切片是目前病理科最为常用的快速制片方法之一，它是借助低温冷冻将手术切除标本的组织块快速冷冻达到一定硬度进行切片的一种方法[1]。

高质量的冷冻切片对于确保术中病理诊断的科学性、可靠性具有极其重要的作用，从而有效降低术中病理诊断的风险。

1.材料与方法1.1 取材送检标本要及时、新鲜，不能沾水和放入固定液，特别是脑组织避免用生理盐水纱布包裹。

取材时尽量避开组织坏死出血区，剔除不必要的脂肪组织、毛发及钙化物等。

细小组织全取材，大组织的取材大小在1.5cm×1.5cm×0.2cm，以厚度不超过0.3cm为宜。

1.2 包埋包埋冻头使用后应用纸巾擦干净后放在冷冻切片机的冷冻台上预冷。

根据组织的特性及医生要求来确定包埋方向，囊壁组织可卷曲成团，皮肤和管腔样组织应立埋。

包埋剂应适量，大块组织可直接放置于滴加包埋剂的组织托上，再用冷冻锤压在组织块上，使其上下一起迅速制冷，既缩短冷冻的时间，又使组织块十分平整，利于切片。

小组织（如穿刺、切缘等组织）包埋时应先滴加少许包埋剂在组织托上，等包埋剂渐渐发白，再将小组织放在组织托上，再用冷冻锤压，避免应切片不完整而导致病理漏诊。

1.3 切片包埋后组织的冷冻是整个冷冻切片十分关键的步骤之一，冷冻的好坏直接影响到切片的质量。

在实践中，我们总结了不同组织的最佳冷冻温度（表1）。

冻好的组织块应先进行粗修，暴露组织的最大面后再进行切片，切片时用力均匀。

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一、实验前准备清理实验台及仪器。

开启冷冻切片机并将冷冻切片机预降至所需温度（- 15~-20 ℃*）。

准备好处理好的载玻片、刀片、胶水以及药品。

二、取材解剖之后迅速取出所需的新鲜组织，用干纱布或滤纸擦干后不需固定直接取材（24×24×2mm*）,以防形成冰晶造成切片中形成形状不一的空泡,使细胞内结构移位。

（注：取材中目的标本既要明确也要确保其结构的完整性，应避免不必要的脂肪及坏死组织附着;要尽量剔除毛发、硬骨或钙化物;保乳手术切缘由于脂肪组织较多,取材厚度最好不要超过3mm，厚者冰冻费时，大者难以切完整。

甲状腺及淋巴结组织要带全组织被膜并除去多余的脂肪组织。

）三、冷冻切片1、取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上冰冻，用吸热器压住组织，至包埋剂与组织冻结成白色冰体即可切片（1~3分种）。

2、将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。

3、调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10μm间。

4、调好防卷板。

制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。

切片时，以切出完整、平滑的切片为准。

切好的组织在干净的玻片上黏附时顺着一个方向稍微用力轻轻一带,可避免组织摊片过程中皱折,保证组织结构的完整及切片的美观。

注：①包埋剂的选用：包埋剂是对冷冻切片质量一重要影响因素，包埋剂用量要适宜，过多或过少都会影响标本冷冻质量。

常用的有三种包埋剂OCT剂、B超藕合剂以及普通胶水。

B超藕合剂适用于细胞丰富质地较嫩的组织,普通胶水或OCT剂适用于纤维丰富质地偏硬组织。

（OCT包埋剂骤冷时固化，其冷冻速度和软硬韧度与组织相近，其还具有水溶性，不影响染色等优点。

）②组织块过小：先将少量胶挤在托架上预先放在冰冻机中冷冻,约30秒钟左右待胶凝固时将小组织放上,组织周围再加一些胶,再次置于冷冻机中冷冻,这样组织被垫高,就能快速切出高质量的切片。

冰冻切片免疫组化染色步骤引言冰冻切片免疫组化染色是一种常用的实验方法，用于研究细胞和组织的分子表达。

它结合了冷冻样本的切片技术和免疫组织化学染色的原理，能够可视化特定分子在组织中的位置，从而帮助我们理解生物过程和疾病机制。

本文将介绍冰冻切片免疫组化染色的步骤和注意事项。

步骤一：样本制备1.收集组织样本，根据需要进行切割和处理。

2.快速冷冻组织样本，可用液氮或乙醚等方法冷冻，并保存在低温环境中。

步骤二：切片制备1.取出冷冻样本，将其置于切片机或切片冷冻器中。

2.进行组织切片，通常厚度为5-10微米，利用切片刀或者切片冷冻器的微调装置。

3.将切片收集在清洁的载玻片上，可以使用专门的载玻片来增强切片与载玻片间的附着力。

步骤三：固定和脱水1.将载玻片上的切片放入4%的中性缓冲福尔马林缓冲液中固定细胞和蛋白质。

2.固定15-30分钟后，用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将福尔马林去除。

3.将切片脱水，使用逐渐浓度的乙醇和脱水溶液，如70%乙醇、95%乙醇和100%乙醇。

步骤四：抗原修复1.对于有些抗原，如细胞核抗原，需要进行抗原修复。

这可以通过热、酸或酶消化等方法进行。

2.一种常用的抗原修复方法是将切片置于高温或高压下进行热诱导抗原修复。

步骤五：阻断和孵育1.使用蛋白质阻断剂，如牛血清蛋白、BSA等，在切片上进行孵育，以防止非特异性结合。

2.孵育时间通常为30分钟至1小时。

步骤六：一抗孵育1.加入一抗，即特异性抗体，与切片上的靶分子结合。

2.一抗浓度和孵育时间根据实验需要和抗体质量进行优化。

步骤七：洗涤1.使用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将未结合的一抗去除。

2.洗涤时间和次数根据实验要求和抗体特性进行优化。

步骤八：二抗孵育1.加入荧光标记的二抗，与一抗结合形成复合物。

2.二抗可以识别一抗的种类，常见的二抗有荧光标记的抗鼠IgG、抗兔IgG等。

步骤九：洗涤1.使用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将未结合的二抗去除。

冰冻切片制作及质量控制冰冻切片是一种在生物组织学研究中广泛应用的技术，它可以制备出细胞和组织的高质量切片，用于后续的染色、免疫组化和显微镜观察等研究。

为了获得高质量的冰冻切片，制作过程中需要严格控制各个环节，包括样本取材、固定、冻结和切片等步骤。

同时，质量控制也是制作高质量冰冻切片的重要环节之一、下面将详细介绍冰冻切片制作及质量控制的相关内容。

1.样本取材样本取材是制作高质量冰冻切片的第一步，样本的选择和处理对后续切片的质量有重要影响。

通常情况下，应选择代表性的组织，样本必须新鲜，不宜暴露在空气中过长时间，以避免氧化和细胞坏死的发生。

此外，为了使切片更容易涂抹和切割，样本应具有一定的硬度，可以根据需要使用组织固定剂、切片缓冲液等进行处理。

2.组织固定组织固定是为了保持组织的形态结构和细胞的生物学特性，同时防止样本在切片过程中的损伤和变形。

常用的固定方法包括冷醇固定、中性缓冲福尔马林固定等。

固定时间和温度的选择需要根据不同的样本和研究要求进行优化。

3.冻结冻结是制作冰冻切片的关键步骤，它能够快速、有效地固定组织并保持组织的形态。

冻结样本时应使用冷冻剂，如液氮、干冰-酒精混合物等。

在冻结过程中，要避免组织在冻结过程中受到机械或化学损伤，因此可以使用特制的冷冻模具和刀片。

4.切片5.质量控制质量控制是确保冰冻切片质量的关键环节之一、常用的质量控制指标有切片厚度、切片完整性、目标细胞或结构的保存等。

切片厚度的一致性对于后续的显微镜观察和数据分析具有重要影响，可以使用显微镜或数字软件测量切片厚度。

切片完整性是指组织切片的连续性和无碎片断裂等情况，可以通过显微镜观察和染色评估。

目标细胞或结构的保存是评价冰冻切片质量的重要指标，可以通过免疫组化染色、细胞核染色等方法进行评估。

综上所述，制作高质量的冰冻切片需要控制好样本取材、组织固定、冻结和切片等环节，并通过质量控制手段来评估切片质量。

只有在每个环节都进行精细操作和严格控制的情况下，才能制备出适合后续研究的高质量冰冻切片。

冰冻切片制作方法与注意事项一、固定：固定即借助化学试剂是组织和细胞中的有机和无机成分凝固或沉淀，停止发生死后组织变化，尽量保持其活体状态的过程。

固定的方法有浸泡固定法，注射、灌注固定法，蒸汽固定法，本实验用的是注射、关注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难流入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定，就可采用灌注或灌流固定法。

固定时将固定液直接注入动物的血管，经血管分支到达整个组织或全身，从二十只得到充分固定。

固定液分为单纯固定液和混合固定液。

单纯固定液有甲醛、乙醇、氯化汞、醋酸、苦味酸等，混合固定液包括Bouin液、Zenker液、Carnoy液、中性甲醛液等。

本实验用的固定液为4%甲醛（10%福尔马林）。

固定后的处理：用水配制的固定液固定后应用流水冲洗，可是组织中的固定液随时溢出和随时洗去。

对小动物和脑组织等，应以浸泡为主，即能达到冲洗的目的，又不损害组织。

【注意事项】1.固定要及时。

2.组织块的大小要合适。

3.应有足够的固定液，一般与组织块的比例为20:1，容器勿过小，组织勿过多。

4.固定时间要合适，甲醛固定液一般固定两天左右，第一天要更换一次固定液。

5.要进行促使固定，在固定期间轻轻地搅动组织或摇动容器使组织移动有利于固定液的渗透，适当提高温度也可缩短固定时间。

6.选择合适的固定液。

7.一次取材数量过多时，应对取材部位和顺序进行编号，并及时做好记录。

二、脱水脱水就是用某些溶剂逐步将组织块内的水分置换出来的过程，使用的试剂称为脱水剂。

脱水剂有非石蜡溶剂的脱水剂如乙醇、丙酮等，和脱水兼石蜡的脱水剂如正丁醇等。

本实验所用的是乙醇脱水。

乙醇是最常用的脱水剂，其优点是脱水能力强，即能与水相混合，又能与透明剂相混，并可使组织硬化，便于切片。

缺点是穿透组织的速度快，且容易使组织收缩、变脆。

为克服这一缺点，在一般脱水中，应采用循序渐进的方法，逐步升级，经一系列不同浓度的乙醇，使组织中的水分逐渐被乙醇代替。

冰冻切片技术经验总结冰冻切片技术是一种常用于生物学研究中的技术方法，通过将生物样本或细胞固定后进行冰冻处理，并利用切片机将样本切成非常薄的薄片，从而便于观察细胞结构和组织构成等。

以下是我对冰冻切片技术的经验总结，包括样本处理、切片技巧、切片后的处理等方面。

首先，在进行冰冻切片之前，样本的处理非常重要。

首先需要选择合适的组织或细胞样本，确保其新鲜和活性，并尽量避免器官或细胞的变性和破坏。

此外，为了避免切片过程中的冷冻伤害，样本需要进行预处理。

如利用缓冲液进行洗涤、固定和去除不需要的化合物；或者使用免疫金或染色技术标记所需的组分，以便更好地观察和分析。

因此，在进行冰冻切片之前，样本处理的质量和细致程度对最终结果的影响极大，应仔细操作。

其次，切片技巧也至关重要。

冰冻切片需要使用专用的切片机械设备，该设备可以在极低的温度下将样本切割成非常薄的切片。

在进行切片操作之前，需要调整和准备切片机的各项参数，例如切片速度、角度和切片厚度等等。

合理地设置这些参数可以保证薄片的质量，减少切削过程中的机械创伤和拉伸现象，从而更好地保留细胞和组织的结构。

此外，还需要掌握适当的刀片冷却和切片角度的操作技巧，以避免切片时产生的静电和其他意外。

再次，在进行冰冻切片之后，需要进行相应的处理。

一般来说，在切片结果中，细胞和组织可能会出现不同程度的变形和染色偏移等问题。

因此，需要进行以下处理步骤来提高切片结果的质量。

首先，可以使用染色剂（如溴化乙锭）进行染色，以增加切片的对比度和可视性。

染色后，切片需要用缓冲液进行冲洗以去除多余染料。

然后，可以使用透明剂（如苯基醚、苯酚和聚丙烯醇）进行透明化，使切片更清晰透明。

最后，在将切片装载到显微镜载玻片上之前，需要使用封片剂固定和封存切片，以防水和保护切片。

总结起来，冰冻切片技术在生物学研究中扮演着重要的角色，因为它可以提供高分辨率的细胞和组织结构图像。

在进行冰冻切片之前，样本处理的质量和细致程度对最终结果的影响极大；切片技巧则需要合理地调整和准备切片机的各项参数；切片后还需要进行相应的处理步骤，以提高切片结果的质量。