冰冻切片制作及质量控制

提高脑组织冰冻切片质量的几点体会一、本文概述脑组织冰冻切片技术是一种广泛应用于神经科学研究的重要实验手段，其质量直接影响到后续的实验结果和数据分析。

然而，由于脑组织结构的复杂性和特殊性，冰冻切片过程中往往面临着诸多挑战，如切片厚薄不均、组织变形、细胞结构破坏等问题。

本文旨在分享在脑组织冰冻切片实践中积累的经验和体会，探讨提高切片质量的关键环节和操作技巧。

通过对冰冻切片前处理、切片过程、切片后处理等关键步骤的详细阐述，本文旨在为神经科学研究者提供一套行之有效的脑组织冰冻切片方法，以期提高切片质量，为后续实验提供可靠的基础。

二、脑组织冰冻切片的基本原理和技术要点脑组织冰冻切片是一种在低温条件下对脑组织进行快速冷冻，然后进行切片的技术。

其基本原理是利用低温使组织迅速固化，保持组织的原始结构和细胞形态，以便后续的观察和分析。

这一技术广泛应用于神经科学研究、病理学诊断和药物研发等领域。

技术要点方面，选择合适的固定液对脑组织进行固定是至关重要的。

常用的固定液如4%的多聚甲醛可以有效地固定脑组织，保持其结构稳定。

快速而均匀的冷冻过程也是关键。

这通常通过使用液氮或冷冻机实现，以最大程度地减少冰晶形成对组织结构的破坏。

在切片过程中，选择适当的切片厚度和温度也是非常重要的。

一般来说，切片厚度在10-50微米之间，而切片温度则需要在-20℃到-30℃之间。

对切片进行后处理，如染色、封片等，也是提高切片质量的重要步骤。

脑组织冰冻切片技术需要严格的操作流程和精确的控制，以确保切片的质量和准确性。

通过不断地优化技术和积累经验，我们可以进一步提高脑组织冰冻切片的质量，为神经科学研究和病理学诊断提供更可靠的支持。

三、提高脑组织冰冻切片质量的措施脑组织冰冻切片是神经科学研究中的一项重要技术，其质量直接影响到后续的实验结果和数据分析。

为了提高脑组织冰冻切片的质量，我们采取了一系列措施，并取得了显著的成效。

在取材过程中，我们严格控制取材时间，确保脑组织在死亡后尽快被取出并处理。

冰冻切片制片实验步骤及注意事项冰冻切片（frozen section）是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。

因其制作过程较石蜡切片快捷、简便，而多应用于手术中的快速病理诊断。

冰冻切片制片实验步骤1、组织固定：新鲜组织固定于4%多聚甲醛24h以上。

将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整。

2、脱水：将修切好的组织放于15%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底后转入30%的蔗糖溶液内4°冰箱脱水沉底。

3、OCT包埋：将脱好水的组织取出用滤纸将表面水稍吸干后切面朝上放于包埋台上，组织周围滴上OCT包埋剂，将包埋台放在冰冻切片机的速冻台上速冻包埋，OCT变白变硬后即可进行切片。

4、切片：将包埋台固定于切片机上，先粗切将组织面修切平整后即可开始切片，切片厚°8-10μm。

将干净的载玻片平放于切出的组织片上方即可将组织贴于载玻片上。

-20°保存备用。

注意事项1、组织尽可能新鲜、骤冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的骤冷剂有：① CO2气（-78℃）② 丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（-80℃）③ 液氮（-190℃）④ 液氮冷却的丙烷（-19℃）。

液氮适用于组织化学，较安全。

缺点：组织块易发生龟裂。

2、为防止水解酶和其他物质的移位、弥散，常用4℃、24小时的甲醛固定能很好地保存酶类。

但对许多脱氢酶和转移酶能灭活。

故不宜使用，低温，冷甲醛短时间固定（10分钟左右）固定，可显示琥珀酸脱氢酶。

3、电镜出现后，需要保存细胞的超微结构，以4%缓冲戊二醛（25%戊二醛16ml；0.1M二甲胂酸（pH7.）84ml；蔗糖8g）固定较好。

这些固定液主要用于水解酶，而不适于许多氧化还原酶和转移酶。

高于20Λg mL甚至30Λg mL仍无任何不良发应,另一些人血药浓度低于10Λg mL就有良好的治疗效果,这是由于许多因素影响患者对氨茶碱的敏感性,它与患者对药物的反应性、敏感性、病理生理状态、年龄、吸烟、饮食、药物相互作用、遗传等因素有关,即治疗范围本身也存在个体差异,所以氨茶碱疗效的判断、剂量的调节等应将血药浓度与临床效果结合起来才客观科学。

参考文献:[1]　梁德荣.紫外分光光度法测定血浆氨茶碱浓度的改进[J].华西医大学报,1987,18(3):2562258.[2]　徐叔云.临床药理学[M].第1版.北京:人民卫生出版社,1989:54261.[3]　吴莱文.治疗药物监测[M].北京:人民卫生出版社,1989:295.[4]　李　.实用临床药物动力学[M].成都:四川大学出版社,1997:1572172.[5]　刘晓明.影响氨茶碱血药浓度的因素[J].中国医院药学杂志,1997,17(11):516.[6]　彭天吉.培氟沙星和氧氟沙星对氨茶碱药动学的影响[J].药学进展,1999,23(2):109.(收稿日期:2004202218)制作临床快速冰冻切片的质量控制袁永辉,张韵风(华中科技大学同济医学院基础医学院,湖北武汉430030)[摘　要]目的:探讨冰冻切片的制作、H E染色和免疫组化的标准化实验方法,达到质量控制标准。

方法:详细介绍了冷冻切片的方法、影响因素、标准化与质量控制及其在临床快速病理诊断的H E和免疫组织化学染色方法。

结果:经此方法制备的冷冻切片组织结构完整、细胞染色清晰、境界清楚、核质分明、对比度好,无刀痕、皱折、重叠、冰晶、切片平整、厚薄均匀一致等。

结论:可为临床快速病理诊断的H E染色、脂肪黏液染色、酶组织化学、免疫组织化学、免疫荧光、核酸原位杂交以及原位PCR等病理诊断与研究提供优质冷冻切片。

[关键词]冰冻切片;H E染色;免疫组化;质量控制[中图分类号]R446.8　[文献标识码]A　[文章编号]1671-5098(2004)06A-0846-02The Qua l ity Con trol of M ak i ng Frozen Section s i n Cl i n ic Pa thology D i agnosisYUAN Yong2hu i,ZHAN G Yun2feng(T ongj i M ed ical Colleg e,H uaz hong U niversity of S cience and T echnology,W uhan,H ubei430030,Ch ina)Abstract:O b je c tive To exp lo re a standard experi m ental m ethod fo r m ak ing frozen secti ons and staining of hem atoxylin eo sin(H&E)and i m m unoh istochem istry,the secti ons w ere to m eet the quality contro l dem and in clinic patho logy tests.M ethods T h is article described a series of secti oning,affective facto rs,standardizati on and quality contro l in m ak ing frozen slices and its staining m ethods of H&E and i m m unoh istochem istry in clinic patho logy diagno sis.Re sults T he frozen secti ons by th is m ethod revealed m arkedly characteristic contrast,mo re detail and clear structure of tissues and cells,w ithout the blade trace,fo ld,ice crystals and the phenom enon of th ickness and th inness,and w ere suitable fo r m icropho tography.Conclusion T h is m ethod can p rovide frozen secti ons superi o r in quality fo r clinic patho logy diagno sis and research in stains of H&E,fat,m ucus,enzym e h istochem istry,i m m unoh istochem istry,i m m unofluo rescence,in situ hybridizati on and in situ PCR as w ell.Key W ords:F rozen secti on;H&E stain;I mm unoh istochem istry;Q uality contro lΞ 冷冻切片是病理科室最常用的快速制片方法之一,它是借助低温使组织达到一定的硬度进行切片的一种方法。

冰冻切片制作方法与注意事项冰冻切片是一种常见的制备生物组织切片的方法，其原理是将生物组织迅速冷冻并切割成极薄的切片，用于研究组织的形态结构和组织学变化。

下面是冰冻切片的制作方法和注意事项。

一、冰冻切片的制作方法：1.组织采集：选择需要研究的组织，如动物器官或植物部位，通常用组织固定剂进行固定处理，以保持组织的形态结构。

2.组织预处理：将固定的组织转移到含有蔗糖或蔗糖与聚乙二醇的冰冻液中，浸泡一定的时间使组织与冷冻液充分均匀接触，便于组织快速冷冻。

3.冰冻：使用液氮或刀片冷冻架等快速冷冻设备，将组织迅速冷冻至-20℃以下，使组织中的水分迅速形成冰晶，避免组织的形态结构变化。

4.切割：将冷冻的组织置于切片机或切片微波机上，用冷冻刀片将组织切割成薄片，通常厚度为10-30μm。

5.将切割好的切片用刷子或微型镊子移至载玻片上，通常用蛋白质固定剂或聚甲醛进行固定处理，以保持切片的形态结构。

6.干燥：将固定好的切片置于干燥器中，用适当的温度和时间干燥切片，使其充分固定在玻片上。

7.染色：根据需要可对切片进行染色处理，常见的染色方法有HE染色、银染色、免疫组化染色等。

二、冰冻切片的注意事项：1.快速冷冻：为了保持组织的形态结构和避免变形，必须采用快速冷冻的方法，将组织迅速冷冻至-20℃以下。

液氮和刀片冷冻架是常用的设备。

2.切片设备：选择适合的切片设备，如切片机或切片微波机。

刀片的选择也十分重要，常见的冰冻刀片有钢刀、玻璃刀和蜡刀，选择合适的刀片可以提高切片质量。

3.切片厚度：切割时要控制好切片的厚度，通常为10-30μm。

切片太薄容易导致组织切面不完整，切片太厚则不能得到清晰的显微镜图像。

4.切片技巧：切片技巧也很重要，需要稳定的手部技巧和耐心。

在切割时要保持刀片的稳定，避免划伤或碎裂组织。

5.切片保存：切好的切片需要妥善保存，可以用普通干燥器或冷冻干燥器进行干燥，避免切片变形和水分损失。

6.染色方法：根据需要选择合适的染色方法。

剂的稳定性达标，才可用于血液筛查工作。

检出限是可检测出的最低分析物的浓度，本室采用将弱阳性质量控制物倍比稀释的方法进行验证。

这种验证方法只能说明在对样本进行稀释状态下的最低检出限，并不代表最低检出限低的试剂其检出能力就一定好于最低检出限高的试剂[2]。

同时，CNAS ⁃CL02⁃A004：2018建议，弱阳性质量控制物作为外对照监控实验的有效性，浓度宜在2~4倍临界值左右。

对ELISA 试剂的检出限进行测定后，可以此为依据，对弱阳性质量控制物浓度进行调整，有利于室内质量控制。

符合率的验证可采用国家标准血清盘或临床诊断明确的阴阳性样本[2]，因血清盘一般不易获得，且价格昂贵，故在进行符合率验证时选择了往年国家卫生健康委员会临床检验中心对室间质量评价。

酶联免疫吸附试剂的敏感度和特异性亦是需要重点考察的指标，可以有效防止弱阳性标本漏检和阴性标本误判为阳性[3]。

依据CNAS ⁃CL02⁃A004：2018文件要求，当采用手工操作或同一项目使用2套及以上检测系统时，应进行实验室内部比对，包括人员和不同检测系统间的比对。

因此，当实验室有1套以上全自动加样仪、1套以上全自动酶免分析仪进行ELISA 检测时，应进行全自动加样仪比对、全自动酶免分析仪比对。

倘若某仪器不能正常运行时，可将该项目检测转移至其他自动加样仪或全自动酶免分析仪中，其结果亦可信。

人员比对验证表明，在全自动加样仪或全自动酶免分析仪运行发生故障时，不同工作人员手工操作ELISA 后续步骤的结果与仪器操作时结果相一致。

此外，CNAS ⁃CL02⁃A004：2018对实验室设备故障修复后，如果影响了方法学性能，应进行合适的方式进行相关的验证，我们结合文件要求与本室工作实际，也进行了相应的验证，以确保设备维修前、后试验结果的一致性。

自2016年以来，我室通过以上方法验证酶联免疫试剂共15次，调整弱阳性质量控制浓度4次，保证了试剂的品质和室内质量控制水平。

术中快速冰冻切片的规范及程序１.冰冻切片的制备１.１打开照明开关，打开冰冻切片机的玻璃箱盖。

１.2选择冻头，在冻头滴上冰冻切片机包埋剂适当。

１.3 待组织完全冷冻后，将冻头移到切片刀口的冻口内，扭紧冻头，进行切片，切片时有节奏的来回推动摇手柄，切得完整且较薄的切片（厚度8-9um），即可贴在玻璃片上。

１.4 将切好的片子用95%的乙醇固定，然后进行染色、封片、镜检（同石蜡切片H-E染色步骤）。

１.5工作完毕后将冻头上组织取出，放回送检的标本袋内，用10%的中性甲醛固定液固定。

１.6清扫切冰冻切片机箱，将冻头擦干后放回冰冻切片机内。

１.7关好冰冻切片机的玻璃箱盖，关闭照明电源。

２.冰冻切片机须24h开机，长假或节假日前检查切片机箱内的结冻情况，必要时关机，化霜，清洁冰冻切片机。

３.注意事项３.1 制作冷冻切片所需的试剂和设备等应处于随时可供使用状态。

３.2 切取的组织块大小适宜（厚度<2mm），并尽快置于冷冻组织切片机上制备切片。

３.3 调节冷冻程度，试切合合适时便迅速切片。

冷冻不足无法切片，冷冻过度切片易碎。

３.4 冷冻切片固定液95%乙醇50ml４.单体标本的冰冻制片应在１５min内完成。

术中快速冰冻诊断的规范及程序１.临床医师在术前向患者或近亲属告知术中快速病理诊断的局限性，签署术中快速病理诊断知情同意书。

２.从标本接收到发出报告的时间，应在病理申请单上注明。

３.有条件的由两位中／高级称职的病理医师共同签署快速活检的病理诊断意见。

对于病变疑难、手术切除范围广泛和会严重致残的手术中快速活检，应由两位高级称职的病理医师共同签署会诊意见。

主检病理医师签名的字迹应能辨认。

４.快速活检诊断意见一般在收到送检标本后３０min内发出；同一时间段内相继收到的多例患者标本或是同一例患者的多次标本，其发出报告的时间依次类推。

对于疑难病变，可酌情延时报告。

５.对于难以即时快速诊断的病变（例如病变不典型、交界性肿瘤病变或送检组织不足以明确诊断等），主检病理医师应向手术医师说明情况，恰如其分地签发病理诊断意见或告知需要等待常规石蜡切片进一步明确病理诊断。

冰冻切片制作及质量控制冰冻切片是一种在生物组织学研究中广泛应用的技术，它可以制备出细胞和组织的高质量切片，用于后续的染色、免疫组化和显微镜观察等研究。

为了获得高质量的冰冻切片，制作过程中需要严格控制各个环节，包括样本取材、固定、冻结和切片等步骤。

同时，质量控制也是制作高质量冰冻切片的重要环节之一、下面将详细介绍冰冻切片制作及质量控制的相关内容。

1.样本取材样本取材是制作高质量冰冻切片的第一步，样本的选择和处理对后续切片的质量有重要影响。

通常情况下，应选择代表性的组织，样本必须新鲜，不宜暴露在空气中过长时间，以避免氧化和细胞坏死的发生。

此外，为了使切片更容易涂抹和切割，样本应具有一定的硬度，可以根据需要使用组织固定剂、切片缓冲液等进行处理。

2.组织固定组织固定是为了保持组织的形态结构和细胞的生物学特性，同时防止样本在切片过程中的损伤和变形。

常用的固定方法包括冷醇固定、中性缓冲福尔马林固定等。

固定时间和温度的选择需要根据不同的样本和研究要求进行优化。

3.冻结冻结是制作冰冻切片的关键步骤，它能够快速、有效地固定组织并保持组织的形态。

冻结样本时应使用冷冻剂，如液氮、干冰-酒精混合物等。

在冻结过程中，要避免组织在冻结过程中受到机械或化学损伤，因此可以使用特制的冷冻模具和刀片。

4.切片5.质量控制质量控制是确保冰冻切片质量的关键环节之一、常用的质量控制指标有切片厚度、切片完整性、目标细胞或结构的保存等。

切片厚度的一致性对于后续的显微镜观察和数据分析具有重要影响，可以使用显微镜或数字软件测量切片厚度。

切片完整性是指组织切片的连续性和无碎片断裂等情况，可以通过显微镜观察和染色评估。

目标细胞或结构的保存是评价冰冻切片质量的重要指标，可以通过免疫组化染色、细胞核染色等方法进行评估。

综上所述，制作高质量的冰冻切片需要控制好样本取材、组织固定、冻结和切片等环节，并通过质量控制手段来评估切片质量。

只有在每个环节都进行精细操作和严格控制的情况下，才能制备出适合后续研究的高质量冰冻切片。

冰冻切片制作及质量控制冰冻切片是一种常用的组织学研究方法，广泛应用于生物医学研究领域。

它可以保持组织的原始形态和结构，适用于光镜、电镜和免疫组化等多种研究方法。

在进行冰冻切片制作时，需要注意一些关键步骤和质量控制措施，以确保获得高质量的切片材料。

1.样品准备样品准备是冰冻切片制作的第一步。

样品可以是动物组织或细胞，也可以是植物组织。

在样品准备过程中，需要注意以下几点：-样品的自然纹理：对于动物组织，应将样品固定在适当的溶液中，以保持其自然纹理。

对于植物组织，应注意保持组织的形态和结构。

-样品的尺寸：样品的大小应适合冰冻切片仪的切片室大小。

过大的样品可能无法完全冻结，导致切片质量降低。

2.样品冷冻将样品冷冻是冰冻切片制作的关键步骤之一、样品冷冻的目的是在不损坏样品的情况下将其冷冻成脆性，以便后续切片。

以下是几种常用的样品冷冻方法：-空气冷冻：样品通过将其放置在冷冻剂中（如液氮或酒精等）迅速冷冻，使其变得脆性。

这种方法适用于较小的样品。

-次凝胶冷冻：将样品浸入液体凝胶中，使其均匀冷冻。

这种方法适用于较大的样品。

-快速冷冻机冷冻：使用快速冷冻机将样品超快速冷冻。

这种方法可以快速冷冻样品，并保持其形态和结构。

3.样品切片样品冷冻后，可以使用冰冻切片机将其切成薄片。

以下是一些注意事项：-选择合适的切片机：合适的切片机应具有良好的冷冻性能和切割能力。

切片机的刀片应尖锐，以便切割样品。

-控制切片厚度：切片厚度直接影响到后续研究结果的准确性。

根据实验需求选择合适的切片厚度，并保持在一定范围内的一致性。

-控制切片速度：切片速度应适中，过快可能导致切片不均匀，过慢可能导致切片丢失或拉长。

-冷藏切片：在切片过程中，应将切好的切片放入冷冻盒中，以防止其变形或融化。

冷藏过程中应注意避免切片受压。

4.质量控制为了确保冰冻切片的质量，需要进行一定的质量控制措施：-内外标准：在切片中加入内外标准物质，以确保切片的准确性和可比性。

冰冻切片制作方法与注意事项一、固定：固定即借助化学试剂是组织和细胞中的有机和无机成分凝固或沉淀，停止发生死后组织变化，尽量保持其活体状态的过程。

固定的方法有浸泡固定法，注射、灌注固定法，蒸汽固定法，本实验用的是注射、关注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难流入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定，就可采用灌注或灌流固定法。

固定时将固定液直接注入动物的血管，经血管分支到达整个组织或全身，从二十只得到充分固定。

固定液分为单纯固定液和混合固定液。

单纯固定液有甲醛、乙醇、氯化汞、醋酸、苦味酸等，混合固定液包括Bouin液、Zenker液、Carnoy液、中性甲醛液等。

本实验用的固定液为4%甲醛（10%福尔马林）。

固定后的处理：用水配制的固定液固定后应用流水冲洗，可是组织中的固定液随时溢出和随时洗去。

对小动物和脑组织等，应以浸泡为主，即能达到冲洗的目的，又不损害组织。

【注意事项】1.固定要及时。

2.组织块的大小要合适。

3.应有足够的固定液，一般与组织块的比例为20:1，容器勿过小，组织勿过多。

4.固定时间要合适，甲醛固定液一般固定两天左右，第一天要更换一次固定液。

5.要进行促使固定，在固定期间轻轻地搅动组织或摇动容器使组织移动有利于固定液的渗透，适当提高温度也可缩短固定时间。

6.选择合适的固定液。

7.一次取材数量过多时，应对取材部位和顺序进行编号，并及时做好记录。

二、脱水脱水就是用某些溶剂逐步将组织块内的水分置换出来的过程，使用的试剂称为脱水剂。

脱水剂有非石蜡溶剂的脱水剂如乙醇、丙酮等，和脱水兼石蜡的脱水剂如正丁醇等。

本实验所用的是乙醇脱水。

乙醇是最常用的脱水剂，其优点是脱水能力强，即能与水相混合，又能与透明剂相混，并可使组织硬化，便于切片。

缺点是穿透组织的速度快，且容易使组织收缩、变脆。

为克服这一缺点，在一般脱水中，应采用循序渐进的方法，逐步升级，经一系列不同浓度的乙醇，使组织中的水分逐渐被乙醇代替。