发光细菌法急性毒性实验课件PPT
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实验一发光细菌的急性毒性评价试验一、实验器材1.菌株明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)2.培养基酵母膏0.5%,胰蛋白胨或多聚蛋白胨(Polypetone)0.5%,甘油0.3%,NaCl 3%,Na2HPO4 0.5%, KH2PO4 0.1%,pH6.5。
固体培养基再加琼脂2%。
3.溶液、试剂及待测物质酵母粉,蛋白胨,NaCl(AR),Na2HPO4(AR),KH2PO4(AR),甘油(AR),二甲基亚砜(AR),乙酸乙酯(AR),HCl(1M),去离子水。
4.仪器及其他用品生物毒性测试仪;电热恒温鼓风干燥箱;振荡培养箱;DELTA 320pH计;氮吹仪;镊子,移液枪,三角锥形瓶等。
二、目的要求1.学习了解发光细菌的急性毒性评价试验的基本原理。
2.掌握发光细菌的急性毒性评价试验的操作要领和评价方法。
三、基本原理发光细菌是指在正常的生理条件下能够发射肉眼可见的蓝绿色荧光的细菌,这种可见荧光波长在450-490 nm之间,在黑暗处肉眼可见。
不同种类发光细菌的发光机理是相同的,都是由特异性的荧光酶(LE),还原性的黄素(FMNH2),八碳以上长链脂肪醛(RCHO),氧分子(O2)所参与的复杂反应,大致历程如下:FMNH2+LE→FMNH2·LE+O2→LE·FMNH2·O2+RCH→LE·FMNH2·O2·RCHO→LE+FMN+ H2O+RCOOH+光具体来说,生物发光反应由分子氧作用,胞内荧光酶催化,将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为FMN及长链脂肪酸,同时释放出最大发光强度在波长为407-409 nm处的蓝绿光。
发光细菌法是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光细菌发光强度的影响。
发光细菌含有荧光素、荧光酶、ATP等发光要素,在有氧条件下通过细胞内生化反应而产生微弱荧光。
当细胞活性升高,处于积极分裂状态时,其ATP含量高,发光强度增强。
主要任务1.对常用钻井液材料进行生物毒性分析,遴选出符合环保要求的材料。
2.通过进行生物毒性分析,对不符合环保要求的钻井液材料,如果是必备材料而且目前又找不到相同功能的替代品,则研制新型的符合环保要求的替代品材料。
3.在遴选出的钻井液材料中,择优选用价格性能比较好的材料,通过室内钻井液性能综合试验研究,研制出一种钻井液性能优良,能保证钻探施工顺利进行,符合环境保护要求的新型钻井液体系。
4.现场试验两口井,通过实践检验其钻井液综合性能,整理试验数据,编写研究报告。
一、完成了符合环保要求的钻井液材料的遴选1.生物毒性测定方法的选择(1)糠虾生物试验法(2)微毒性分析法(3)发光细菌法通过对发光细菌法与糠虾法试验结果对比,我们发现发光细菌法的EC50值与糠虾生物试验法的LC50值之间具有一定的相关性:EC50值总是小于LC50值,实验结果见表1。
这说明相同数值的EC50值和LC50值相比,EC50值比LC50值对环境的毒性污染更小,更安全可靠。
表1 四种钻井液体系的EC 50值与LC 50值比较因此本项目采用发光细菌法,测定钻井液单剂及体系的生物毒性,用EC50(相对发光率50%时)来表征被测物的生物毒性,EC50值越大,表明被测物的生物毒性越小;EC50值越小,表明被测物的生物毒性越大。
我们参照糠虾法的排放标准,以EC50>30000ppm 作为钻井液单剂及体系允许排放的标准。
并参照糠虾生物毒性试验法的生物毒性分级标准,将生物毒性等级划分为六个等级(表2),以此作为本项目的环境可接受性评价方法和标准。
表2 生物毒性等级分类2.常用钻井液材料的生物毒性评价按发光细菌法对常用钻井液材料进行毒性评价,结果见表3表3 常用钻井液材料生物毒性结果二、完成环保型高效润滑剂的研制和应用在地质调查金刚石取心钻探中,因转速较高,要求钻井液具有良好的润滑性;在石油天然气钻探中,定向井、水平井和深井所占的比例日益增加,钻井液的润滑性成为关键指标之一,因此,钻井液用润滑剂成为一种重要的常用的钻井液材料,其市场需求量日益增加,在钻井液化学处理剂中呈大幅度增长趋势,而目前的润滑剂仍在使用有毒性的矿物油材料(如柴油等)作基础原料,必然会被日益严格的环境保护要求所限制。
发光细菌发光细菌,进行生物发光的细菌。
多数为海生,与发光浮游生物同是引起海面发光的原因。
此外,在空气中,死鱼及水产加工食品的表面于暗处也会发光,这种发光现象是海生菌第二次生长繁殖的结果。
用加有3%NaCl,1%甘油的普通肉汁蛋白胨培养基可以培养。
发光菌形态虽多种多样,但生理特性却非常相似。
一般对明胶不产生液化,分解蛋白质后不形成毒物,常寄生在各种动物体上引起“发光病”,即寄生发光。
这些细菌通常经由寄主的卵传递给后代寄主。
有些发光鱼类和乌贼是和发光细菌共生而利用了细菌的发光。
近年来,水污染问题日益严重,与此同时也开发出许多灵敏、有效的环境监测方法,这些方法可以划分为两类:分析技术和生物监测。
其中分析技术常常用于废水常规指标的测试,但不能反应水质综合毒性的大小。
传统的生物监测以水蚤、藻类或鱼类为受试对象,虽然能反映毒物对生物的直接影响,但是这些方法的最大缺点是实验周期长,实验过程比较繁琐。
针对传统生物毒性检测方法的不足,研究和开发新型生物毒性监测技术——发光细菌法。
该方法以简便的操作方式、测量结果一目了然,受到了科研单位和企业的青睐。
随着人们环保意识的增强,原有污染物排放标准的常规污染指标已不能全面说明污染物对生存环境造成的危害程度。
无法反映出有毒化合物相互作用的影响,发光细菌法则不然,既可以测定废水的综合毒性,也可以测定单一污染成分的毒性。
工业废水是水体污染的重要原因之一,当受纳水体的污染物达到一定浓度时,会引起生物中毒反应,使之行为异常,生理功能紊乱,组织细胞病变,甚至死亡。
国外在20世纪70年代和80年代做过大量用发光细菌法则测定废水综合毒性的研究。
Bolich根据采用发光细菌方法和采用鱼类测定工业废水的急性的实验结果,提出了3个毒性比较方法标准:1、有毒/无毒,2、百分数等级,3、对数等级。
自1672年R.Boyle观察到发光的菌体所发出的光易被化学物质抑制后,许多科学家相继对细菌的发光效应进行了大量的研究。