实验五 细菌的分离、接种和培养

实验五微生物的分离、接种及培养法一目的要求1.掌握倒平板的方法、划线分离法、稀释平板分离法和菌落（活菌）计数法。

2.熟练掌握微生物的接种技术，学会微生物的一般培养方法和无菌操作技术。

二实验原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

常用的分离方法有： 1) 平板划线分离法；2）稀释平板分离法。

在食品发酵工业中，通过微生物的分离、纯化，选育优良的微生物菌种，以提高产品的质量和产量；在食品卫生管理方面，需要进行微生物检测，必须将微生物单一分离出来，加以鉴别和研究。

土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。

因此土壤是微生物多样性的重要场所，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。

微生物的分离和接种是微生物学中重要的技术之一，需要严格的无菌操作，否则使得微生物实验毫无意义。

三实验材料1.菌种：葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、酵母菌、毛霉、曲霉、青霉等含菌样品。

2.培养基：肉汤蛋白胨培养基（斜面、平板）、肉汤蛋白胨液体培养基、蔡氏琼脂培养基（斜面、平板）。

3.土壤（自带）或其他物品；无菌水，无菌培养基，无菌吸管，无菌三角瓶等。

四实验内容与步骤（一）微生物的分离技术1. 平板划线分离法借助划线使混杂的微生物在平板的表面分散开，以获得单个菌落，从而达到分离的目的。

具体方法如下：倒制平板→制备含菌样品稀释液→划线→倒置适温培养→观察记录（1)倒制平板：将固体培养基熔化→冷却至 50-55℃→注入培养皿内 15ml（无菌操作）→旋匀→静置凝固→即成平板→在皿盖边贴标。

（2)含菌样液制备：样品少许（1-10g），加入盛有无菌水的试管内，摇匀，制成菌悬液即可，能直接划线的样品（如体液、黏液、污水等），可省去这操作。

（3)划线：左手持平板，接种环经灼烧灭菌后，以无菌操作取样，迅速将接种环伸入培养皿，轻轻划线（切勿把平板表面划破）。

然后将培养皿倒置放入恒温培养箱37℃，培养24-48 小时，观察平板上出现的现象，注意菌落的形状，并做记录。

细菌的分离培养与纯培养实验报告一、实验目的本实验旨在掌握细菌的分离培养方法，了解纯培养的原理及方法，以及熟悉细菌培养基的制备和使用。

二、实验原理1. 细菌分离培养方法细菌分离培养是指将混合菌落中的单一细菌分离出来，使其在无竞争的环境中独立生长。

常用的方法有均匀涂布法、斜坡涂布法和点式涂布法。

2. 纯培养原理及方法纯培养是指将混合菌落中同一种细菌分离出来并进行单独培养。

常用的方法有挑选法和稀释法。

3. 细菌培养基制备与使用细菌培养基是供给微生物生长发育所需营养物质和条件的一种人工环境。

根据不同需求可制备不同类型的细菌培养基，如寒偏好性、厭氧性、选择性、差异性等。

常用的细菌培养基有普通营养琼脂平板、LB 平板等。

三、实验步骤1. 细菌分离培养（1）取一支无菌的铂丝，将其消毒并冷却。

（2）取一份混合菌落，将铂丝在其表面轻轻刮几下，使细菌附着在铂丝上。

（3）将铂丝均匀涂布于琼脂平板上。

（4）重复以上步骤，涂布多个琼脂平板。

（5）将琼脂平板放置于恒温箱中，在适宜的温度下培养。

2. 纯培养（1）取一份混合菌落，在显微镜下观察并挑选出同一种细菌。

（2）取一支无菌的铂丝，在混合菌落表面轻轻刮几下，使细菌附着在铂丝上。

（3）将铂丝均匀涂布于琼脂平板上，并进行单独培养。

3. 细菌培养基制备与使用（1）按照需要制备不同类型的细菌培养基，并进行消毒灭菌处理。

（2）将需要进行分离或纯化的混合菌落均匀涂布于培养基上，进行培养。

四、实验结果1. 细菌分离培养经过适当时间的培养后，可看到琼脂平板上出现单一的细菌菌落。

2. 纯培养经过适当时间的培养后，可看到琼脂平板上只有挑选出的同一种细菌菌落。

3. 细菌培养基制备与使用制备好的细菌培养基可用于分离、纯化和大量繁殖特定细菌。

五、实验注意事项1. 实验器材需消毒并严格无菌操作。

2. 均匀涂布法需注意铂丝在琼脂平板上均匀涂布。

3. 液体培养基需注意摇晃均匀以使细菌均匀分布。

4. 实验结束后要彻底清洗和消毒实验器材和工作台面。

实验五 高氏一号合成培养基的制备、土壤中放线菌的分离实验目的：掌握配制合成培养基的一般方法。

掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。

实验材料：药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4•3H2O、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、琼脂。

其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。

实验原理：高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。

这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3 、NaCl 、K2HPO4•3H2O 、MgSO4•7H2O 作为无机盐，FeSO4•7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。

放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。

由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。

分离放线菌常用稀释倒平板法。

根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。

如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。

再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。

实验内容：1.高氏一号合成培养基的制备先将可溶性淀粉称好，在小烧杯内用50~100ml水调成糊状，再在另一容器内加入900~950ml热水，将小烧杯内淀粉倒入混匀。

再分别称取其它药品，并加热搅拌使之溶解后，调pH至7.2~7.4，分装，0.1Mpa（15lb/in2）15~30min高压蒸汽灭菌。

2.土壤中放线菌的分离（1）取9套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-3、10-4、10-5）、组别、姓名、操作日期等。

培养微生物五个步骤培养微生物是微生物学研究中非常重要的一环，通过培养可以获得大量的微生物，从而进行各种实验和研究。

下面将介绍培养微生物的五个步骤。

第一步：选择培养基培养基是培养微生物的基础，选择合适的培养基对于微生物的生长和繁殖至关重要。

培养基可以分为固体培养基和液体培养基两种形式。

固体培养基通常是用琼脂糖制成的，而液体培养基则是溶解在适当的溶液中。

在选择培养基时需要考虑微生物的类型和所需的生长条件，例如温度、pH值等。

第二步：准备培养基准备培养基时需要按照一定的比例混合各种成分，并加热至溶解。

然后将培养基分装到培养皿或试管中，并进行高温高压灭菌，以杀死其中的微生物和孢子。

灭菌后，将培养基冷却至适宜的温度，使其凝固（固体培养基）或保持液态状态（液体培养基）。

第三步：接种微生物接种微生物是将待培养的微生物转移到培养基中的过程。

接种时需要用无菌的工具（如匀菌针或无菌吸管）取少量微生物液体或菌落，均匀涂抹在培养基表面（固体培养基）或加入培养基中（液体培养基）。

接种后需要注意避免交叉污染，以保证培养的纯度。

第四步：培养微生物培养微生物的过程中需要提供适宜的生长条件，如适宜的温度、湿度和氧气含量。

对于不同的微生物，这些条件可能有所不同。

在培养过程中，需要定期观察和记录微生物的生长情况，如菌落的形状、颜色和大小等。

培养时间的长短也取决于微生物的生长速度。

第五步：分离纯种在培养微生物的过程中，可能存在多种微生物混合生长的情况。

为了得到纯种微生物，需要进行分离。

常用的分离方法有传代分离法、挑选分离法和稀释分离法等。

通过这些方法，可以将不同的微生物分离出来，得到纯种菌株。

总结起来，培养微生物的五个步骤分别是选择培养基、准备培养基、接种微生物、培养微生物和分离纯种。

通过这些步骤，可以获得大量的微生物，为微生物学研究提供了基础条件。

在进行微生物培养时，需要注意无菌操作，以避免外来的污染。

此外，培养条件的选择要根据微生物的需求进行调整，以促进微生物的生长和繁殖。

实验五真菌的分离培养及形态观察真菌分离培养应考虑所分离真菌的特性，配制合适的培养基，选择所需的气体环境。

同时, 由于真菌分离材料常污染有大量细菌，所以可在培养基中加入抗菌素并在分离培养过程中严格执行无菌操作。

目的要求1．掌握真菌分离培养方法。

2．认识真菌菌落的特征，比较与细菌菌落有何不同。

3．了解真菌载片培养法。

4．掌握观察真菌的基本方法，并观察其形态特征。

操作步骤—、真菌的分离培养方法（－）平板划线分离法1．取适合真菌的琼脂培养基融化，冷至45℃，注入无菌平皿中，每皿15～20ml，制成平板待用。

2．取要分离的材料（如田土、混杂的或污染的真菌培养物、真菌）少许，投入盛无菌水的试管内，振摇，使分离菌悬浮于水中。

3．将接种环经火焰灭菌并冷却后，蘸取上述菌悬浮液，进行平板划线(同细菌的划线法)。

4．划线完毕，置温箱中培养2～5d，待长出菌落后，钓取可疑单个菌落先作制片检查，若只有一种所需要的真菌生长，即可进行钓菌纯培养。

如有杂菌可从单个菌落中钓少许菌制成悬液，再作划线分离培养，有时需反复多次，才得纯种。

另外，也可在放大镜的观察下，用无菌镊子夹取一段待分离的真菌菌丝，直接放在平板上作分离培养，可获得该种真菌的纯培养。

（二）稀释分离法1．取盛有无菌水的试管5支（每管9ml），分别标记1、2、3、4、5号。

取样品（如田土等）1g，投入1号管内，振摇，使悬浮均匀。

2．用1ml灭菌吸管，按无菌操作法，从1号管中吸取1ml悬浮液注入2号管中，并摇匀；同样由2号管取1ml至3号管，依此类推，直至5号管。

注意每稀释一管应更换一支灭菌吸管。

3．用2支无菌吸管分别由4号、5号试管中各取1ml悬液，并分别注入2个灭菌培养皿中，再加入融化后冷至45℃的琼脂培养基约15ml，轻轻在桌面上摇转，静置，使冷凝成平板。

然后倒置温箱中培养，2～5d后，从中挑选单个菌落，并移植于斜面上。

二．真菌培养性状观察（一）真菌在固体培养基上的生长表现1 .酵母菌菌落：酵母菌在固体培养基上多呈油脂状或蜡脂状，表面光滑、湿润、黏稠，有的表面呈粉粒状、粗糙或皱褶。

实验五细菌的分离培养与移植[实验目的]1、掌握细菌分离培养及移植的基本要领和方法。

[实验原理]在细菌学诊断中，分离培养是不可缺少的一环。

分离培养的目的主要是在含多种细菌的病料或培养物中挑选出某种细菌。

在分离培养时应注意：选择适合于所分离细菌生长的培养基、培养温度、气体条件等。

同时应严格按无菌操作程序进行实验，并做好标记。

[实验材料]菌种：大肠杆菌斜面、大肠杆菌与金黄色葡萄球菌等。

器械：剪刀、记号笔(以上小组共用)。

培养基：普通肉汤和普通琼脂斜面、普通琼脂平板、酒精灯、接种环。

[实验内容]1、细菌的分离平板划线接种法通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。

若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。

可用做分离纯种细菌。

操作方法（三区划线法）：a、右手拿接种环，烧灼冷却后，勾取菌种。

b、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。

划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。

c、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。

d、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。

e、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37℃温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。

平板分区划线法培养后菌落分布情况平板划线培养的方法甚多，可按各人的习惯选择应用，其目的都是达到使被检材料适当的稀释，以求获得独立单在的菌落，防止发育成菌苔，以致不易鉴别其菌落性状。

实验五菌种组织分离法
目前食用菌主要栽培种类如平菇、香菇、草菇等生产上多采用组织分法制备菌种。

一、目的：
了解和掌握食用菌组织分离法的方法步骤，制备出栽培用菌种。

二、实验器材：
1、平菇或香菇等子实体。

2、接种箱、解剖剪、解剖刀、镊子、试管斜面、75%酒精、酒精棉球、无菌水、培养皿、紫外线灯、或硫磺。

三、实验方法：
1、菌种的选择：在出菇场要选择肉厚肥大、鲜嫩，出菇早、菇形整齐、菌柄短且无病害的做种。

2、将种菇表面用清水冲洗干净，放在接种箱（或无菌室内）进行表面消毒。

用镊子将种菇放在培养皿内，用另一反镊子夹75%酒精棉球（或0.1%升汞棉球）对种菇进行表面消毒，然后移入另一培养皿内再用无菌水反复洗涤三次，洗净残留的消毒剂。

3、用解剖刀或鲜剖剪蘸酒精进行火焰消毒，冷却后把自己消毒的种菇纵切开，然后用菌盖笔菌柄交界处，切取长宽的0.3-0.5厘米的菌肉组织块，用接种针移到斜面培养基上，置24℃恒温箱中培养。

4、每天检查试管斜面菌落生长情况，如从分离的菌肉组织块上长出正常的白色菌丝，即分离成功，及时将生长出来的菌丝转移新的试管斜面。

若在组织块附近或其他地方出现其他颜色杂菌生长应予以淘汰。

四、作业：
叙述组织分离的方法步骤，体会和注意事项，观察记载斜面菌落生长速度和成功率。

细菌的人工培养实验步骤细菌的人工培养实验步骤细菌的人工培养是微生物学研究中非常重要的实验方法，可以用于分离、鉴定和纯化细菌。

下面将详细介绍细菌的人工培养实验步骤。

一、准备实验室设备和材料1. 培养基：根据不同的研究目的选择合适的培养基，如营养琼脂、大肠杆菌选择性琼脂、血琼脂等。

2. 细菌液：从保存在冰箱或冷冻库中的细菌液中取出所需的细菌，并进行预处理。

3. 实验室设备：无菌操作台、离心机、移液器、显微镜等。

4. 无菌操作器具：无菌培养皿、试管、移液器等。

二、制备固体培养基1. 称取所需量的琼脂和其他成分，加入适量的去离子水中溶解。

2. 调整pH值，通常为7.0-7.4。

3. 加热消毒：将琼脂溶液装入无菌试管或烧杯中，用高压灭菌器或自制压力锅进行高温高压灭菌。

4. 倒制琼脂：将琼脂溶液倒入无菌培养皿中，使其均匀分布在培养皿底部。

5. 固化琼脂：将培养皿放置在平板上，待琼脂凝固后即可使用。

三、制备液体培养基1. 称取所需量的营养成分和其他添加剂，加入适量的去离子水中溶解。

2. 调整pH值，通常为7.0-7.4。

3. 加热消毒：将液体培养基装入无菌试管或烧杯中，用高压灭菌器或自制压力锅进行高温高压灭菌。

四、细菌的预处理1. 从冷冻库或冰箱中取出细菌液，并进行预处理。

通常采用离心法将细菌沉淀下来，并用生理盐水洗涤2-3次，以去除残留培养基和代谢产物等。

2. 用显微镜观察细胞形态和数量，并调整浓度至合适的范围。

五、接种细菌1. 无菌操作台上进行无菌操作，将细菌液用移液器均匀地滴在琼脂培养皿表面上。

2. 用火柴头或无菌环将细菌液均匀地涂抹在琼脂表面上。

3. 将培养皿倒置放置于恒温箱中，通常为37℃，并注意标记好培养皿的信息。

4. 观察培养皿中细菌的生长情况，并记录下来。

六、细菌的分离和鉴定1. 根据实验设计和研究目的，选择不同的方法对细菌进行分离和鉴定，如生化试验、药敏试验等。

2. 根据实验结果对细菌进行鉴定，并记录下相关信息。